基因转移 FasL 诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究

一、基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究（论文文献综述）

黄暨生^[1]（2016）在《木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究》文中提出恶性肿瘤是21世纪以来严重危害人类健康的主要疾病之一,是目前导致人类死亡的主要原因之一。随着细胞生物学和分子生物学日新月异的发展,基因治疗对恶性肿瘤的治疗有着重要作用,特别是自杀基因治疗,已经成为继传统治疗手段（如手术治疗、放疗、化疗等）后一种治疗肿瘤最具希望和挑战的措施。本研究通过构建重组慢病毒介导的绿色荧光示踪蛋白单纯疱疹病毒胸苷激酶HSV-tk/GCV自杀基因治疗系统基因载体,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,在确定黄酮类中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素对细胞缝隙连接功能（GJIC）的促进作用,进一步将中药活性成分与自杀基因治疗系统组成联合治疗方案,研究中药活性成分联合自杀基因治疗系统的增效作用,通过本研究探讨将自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案的可行性。一、方法（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建设计引物,提取HEK293细胞总RNA, PCR反应扩增tk基因后,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳,切胶回收。对tk基因PCR扩增产物及CD511B质粒分别进行双酶切,T4 DNA连接酶连接；将连接产物转化大肠杆菌DH5a,提取质粒。重组质粒使用限制性内切酶消化进行鉴定及序列测定；将构建含有HSV1-tk、GFP融合基因的重组慢病毒质粒命名为pLV-tk/GFP。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建用该重组质粒pLV-tk/GFP与包装质粒共转染包装细胞HEK293T,获得重组活病毒并感染人黑色素瘤细胞A375,用嘌呤霉素筛选获得稳定表达细胞株；使用荧光显微镜观察GFP基因的表达,GCV杀伤实验验证tk-GFP基因的活性。将筛选获得稳定表达细胞命名为A375-tk/GFP.（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1 MTT法检测人黑色素瘤细胞A375生长曲线。2 MTT法检测0～100μmol/L木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长的影响,以确定用于研究的药物浓度。3荧光显微镜观察及流式细胞仪荧光示踪法分析缝隙连接通讯（GJIC）功能变化。用预标记双染料传输流式细胞术检测0～20μmol/L木犀草素、0-10μmol/L芹菜素及0～20μmol/L槲皮素对A375细胞GJIC功能的影响,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。检测并计算单绿色荧光细胞数量与荧光双阴性细胞数量的比值,作为评价GJIC功能的指标；比值越大表示细胞间形成GJIC功能越强。4 Western Blot检测0～20μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞缝隙连接蛋白Cx43、Cx26表达的影响,对图像进行扫描分析。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测0、2、5μmol/L GCV对0、20%、40%、60%、80%、100% A375-tk/GFP（tk+）细胞混合A375（tk-）细胞作用72h生长的影响,以确定联合作用GCV浓度和tk+细胞的混合比例。2 MTT法检测杀伤效应。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到96孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以MTT检测各组杀伤效应。3荧光显微镜观察及流式细胞仪PI单染分析细胞凋亡。将tk+细胞按20%比例混合tk-细胞接种到12孔板。混合细胞分为空白组、GCV组、木犀草素组、芹菜素组、槲皮素组、木犀草素联合GCV组、芹菜素联合GCV组和槲皮素联合GCV组。培养24h后根据分组给药,72h后以PI单染,流式细胞仪检测各组细胞凋亡的情况,并用荧光显微镜拍照记录实验结果。二、结果（一）人黑色素瘤细胞A375 HSVl-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建1绿色荧光蛋白示踪的HSV1-tk/GCV系统重组慢病毒载体的构建重组慢病毒质粒pLV-tk/GFP分子量约为10.0kb,经限制性酶切鉴定和DNA序列测定分析显示,证明目的基因tk已经成功连接到载体正确位置,测序结果与原始载体序列比对,相应序列100%完全一致,证明携带目的基因HSV1-tk的质粒pLV-tk/GFP构建成功。2人黑色素瘤细胞A375 HSV1-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统的构建pLV-tk/GFP感染A375细胞用0 .5μg/mL嘌呤霉素维持筛选浓度2周,荧光显微镜观察GFP的表达随着时间的延长而逐渐增多、荧光增强,最终获得重组基因整合到染色体上的稳定表达细胞株,命名为A375-tk/GFP。采用MTT法检测GCV对A375细胞、A375-tk/GFP细胞进行杀伤试验,GCV作用72h的细胞存活率结果显示,GCV对A375-tk/GFP细胞有明显的杀伤作用,而对未感染重组慢病毒的对照组A375细胞无明显细胞毒作用。结果表明重组质粒经包装后产生上清液含具有感染性的病毒颗粒,感染细胞后筛选的阳性抗性克隆细胞A375-tk/GFP能正常表达tk/GFP基因,表达产物具有生物活性。（二）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞缝隙连接通讯功能的作用1木犀草素、芹菜素、槲皮素对A375细胞生长有较为明显的抑制效应,6.25～100μmol/L木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375细胞杀伤作用呈时间和剂量依赖关系；本研究主要探讨木犀草素、芹菜素及槲皮素通过GJIC或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用2.5～20μmol/L木犀草素、芹菜素及5～40μmol/L槲皮素进行后续试验。2流式细胞术及Western Blot检测细胞缝隙连接功能和缝隙连接蛋白的表达,结果发现木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高肿瘤细胞缝隙连接蛋白的Cx43和Cx26表达水平,促进缝隙连接通讯的功能从而起到与自杀基因治疗系统的协同增效作用,旁观者效应也可能是通过GJIC机制发生的。（三）木犀草素、芹菜素及槲皮素对人黑色素瘤细胞自杀基因的增效作用1 MTT法检测2、5μmol/LGCV对20%～100% A375-tk/GFP细胞混合比例作用72h后,对显着的杀伤作用,为了观察木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV治疗系统,通过缝隙连接机制或细胞凋亡机制增强对A375-tk/GCV自杀基因治疗系统的旁观者效应,故选用5μmol/L GCV和20% A375-tk/GFP细胞混合比例进行后续实验验。2木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV组对肿瘤细胞的抑制率明显比相应浓度单药组和单纯tk/GCV组高（P<0.05）,说明木犀草素、芹菜素及槲皮素联合tk/GCV系统能显着提高tk+和tk-混合细胞对GCV的敏感性。5、10μmol/L木犀草素联合tk/GCV组,5、10、20μmol/L芹菜素联合tk/GCV组,10、20μmol/L槲皮素联合tk/GCV组,Q值均≥1.15,说明5、10μmol/L木犀草素、5、10、20μmol/L芹菜素及10、20μmol/L槲皮素具有协同性增强tk/GCV系统杀伤效应的作用。3 PI单染检测细胞凋亡结果显示,各中药活性成分联合tk/GCV组的细胞凋亡率均高于单纯中药活性成分组,PI单染法检测结果各组细胞凋亡率的趋势与MTT结果一致,实验证明,木犀草素、芹菜素及槲皮素对A375-tk/GFP自杀基因治疗系统具有增效作用。三、结论及展望上述实验结果表明：①我们已成功构建了绿色荧光示踪蛋白慢病毒介导的HSV-tk/GCV肿瘤自杀基因治疗系统；②中药活性成分木犀草素、芹菜素及槲皮素可以通过提高缝隙连接蛋白的表达水平促进细胞间缝隙连接功能；③将中药活性成分和自杀基因疗法组成联合治疗方案,对人黑色素瘤自杀基因治疗系统具有协同增效作用。通过对人恶性黑色素瘤治疗的实验研究,表明自杀基因疗法联合中药方药活性成分,能够通过促进缝隙连接机制发挥协同抗肿瘤作用,中药方药活性成分能够提高肿瘤自杀基因治疗的效果。初步证明了建立自杀基因联合中药方药活性成分的中西医结合基因治疗肿瘤方案具有可行性。将中药方药活性成分与肿瘤自杀基因治疗联合,体外实验对自杀基因治疗系统旁杀伤效应的研究结果显示,中药方药活性成分能协同增强肿瘤自杀基因旁杀伤效应的效果,其可能机制与中药方药活性成分通过促进细胞间缝隙连接通讯功能（即缝隙连接机制）发挥作用。进一步可以将其他的中药方药活性成分或旁杀伤效应的其他增效机制,以及体内实验研究做为我们今后研究工作方向的重点。目前肿瘤自杀基因治疗尚未成熟,但通过将祖国传统医学与现代医学结合,联合自杀基因治疗的增效作用的研究、建立及优化工作将大有可为。

戴欢子^[2]（2012）在《印迹基因TSSC3对骨肉瘤生物学特性的影响及其机制研究》文中研究说明骨肉瘤是好发于儿童和青少年的一种高转移性骨原发恶性肿瘤，肺转移是最主要的死亡原因。骨肉瘤的转移多发生于早期，85%90%的患者就诊时已存在临床上不能发现的转移灶。近年来的新辅助化疗使得患者肺转移率得到明显控制，骨肉瘤患者的预后得到了很大的提高，5年生存率达到60%～80%。但骨肉瘤的长期生存率并没有明显提高，骨肉瘤的治疗效果仍处于“瓶颈期”，骨肉瘤细胞对化疗的敏感性差以及对化疗药物的耐药是影响其化疗疗效的主要因素。因此，控制骨肉瘤的转移和克服化疗耐药对于提高骨肉瘤患者的生存率有重要意义。肿瘤的转移包含了一系列的复杂事件。肿瘤细胞获得“失巢凋亡抵抗”是其成功实现转移的基础和关键，而细胞周期阻滞和凋亡通路障碍也是化疗耐药产生的主要机制之一，因此探讨骨肉瘤耐药及失巢凋亡抵抗的机制将为深入阐明骨肉瘤转移及耐药提供有意义的理论和实验依据。本课题组前期研究发现，印迹基因TSSC3参与了成骨细胞的恶性转化。TSSC3是已报道的唯一与凋亡相关的印迹基因。目前关于TSSC3与肿瘤的研究很少，仅在完全性葡萄胎、Wilms’肿瘤和恶性胶质瘤中有表达缺失的报道，其在骨肉瘤中的表达情况及其发挥的功能作用和分子机制尚缺乏相关研究。有鉴于此，本研究共分三部分。第一部分检测了TSSC3在各骨肉瘤细胞系以及骨肉瘤组织中的表达，并进一步采用体内和体外实验模型，研究TSSC3在骨肉瘤中所发挥的功能作用。第二部分探讨了TSSC3对各凋亡通路关键分子表达变化的影响；并进一步探讨了TSSC3对骨肉瘤化疗敏感性的影响及其分子机制。第三部分在第一、二部分对TSSC3在骨肉瘤中表达、功能及作用机制研究的基础上，进一步探讨TSSC3调控骨肉瘤失巢凋亡抵抗进而在骨肉瘤迁移、侵袭、转移中发挥的作用及其分子机制。研究内容和主要结果结论如下：一、TSSC3在骨肉瘤细胞系和骨肉瘤组织中普遍低表达，提示其表达可能与骨肉瘤的发生发展密切相关1. TSSC3在骨肉瘤细胞系中普遍低表达：采用荧光定量PCR、RT-PCR和免疫荧光染色实验方法得到如下结果：（1）TSSC3在恶性转化的成骨细胞（MTF）中的表达明显低于hFOB1.19成骨细胞，差异有统计学意义。（2）TSSC3在成骨细胞系中的表达均高于所有被检测的骨肉瘤细胞系，其在低级别来源的骨肉瘤细胞系HOS和MG63中的表达要高于高级别来源的细胞系U2OS和SaOS2，且TSSC3主要定位于胞质。2. TSSC3在骨肉瘤组织中普遍低表达：我们采用RT-PCR和卡方检验的统计学方法得到如下结果：（1）TSSC3在肿瘤组织（阳性率为45.8%，表达丰度为0.18±0.03）中的表达显着低于配对癌旁组织（阳性率为79.1%，表达丰度为0.52±0.05），差异有统计学意义。（2）TSSC3在骨肉瘤组织（54.2%）中的表达缺失率显着高于配对癌旁组织（20.8%），差异有统计学意义，但骨肉瘤组织中TSSC3的表达缺失率与骨肉瘤患者的性别、年龄和病理组织学分型没有显着的相关性。二、TSSC3的表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖1.采用GeneSwitch诱导表达系统成功构建了稳定高表达TSSC3的SaOS2细胞系（overTSSC3）；采用pSilencer5.1Retro表达系统成功构建了稳定低表达TSSC3的SaOS2细胞系（siTSSC3）。2．TSSC3的表达抑制了骨肉瘤细胞的增殖：（1）CCK8比色法显示：overTSSC3细胞在接种2天后，增殖速率显着低于对照组（SaOS2和overCON）；相反，siTSSC3细胞在接种5天后，增殖速率显着高于对照组（SaOS2和siCON），差异有统计学意义。（2）平板克隆形成实验显示：过表达TSSC3明显地降低了大克隆形成率（从17.75±0.01%降低到0.67±0.01%）；相反，siTSSC3细胞的总克隆、大克隆、小克隆形成数均显着高于对照组（SaOS2和siCON），特别是大克隆形成数从7±2升高到107±12，差异有统计学意义。（3）Ki67免疫荧光染色显示：高表达TSSC3明显地降低了Ki67的表达强度和阳性率；反之，低表达TSSC3则显着地增强了Ki67的表达强度和阳性率，差异有统计学意义。（4）PI染色和流式细胞术进行细胞内DNA倍体分析显示：高表达TSSC3使G0/G1期细胞比例显着增加；反之，低表达TSSC3则使G0/G1期细胞比例显着降低。3. TSSC3的表达抑制了裸鼠体内骨肉瘤细胞的增殖：（1）免疫缺陷小鼠移植瘤实验显示：overTSSC3组成瘤率为18%，成瘤潜伏期为28天，接种7周后移植瘤体积为15.94±9.28（mm3±SD）；对照组SaOS2、overCON的成瘤率分别为86%和67%，成瘤潜伏期分别为14天和16天，接种7周后移植瘤体积分别为90.17±15.42（mm3±SD）和159.75±73.65（mm3±SD），差异有统计学意义。相反，siTSSC3组成瘤率为100%，成瘤潜伏期为6天，接种5周后移植瘤体积为153.45±42.38（mm3±SD）；siCON组成瘤率为67%，成瘤潜伏期为12天，接种5周后移植瘤体积为66.10±24.64（mm3±SD），差异有统计学意义。结果表明TSSC3明显地降低了骨肉瘤细胞体内的成瘤力。（2）HE染色观察移植瘤组织形态，结果显示： siTSSC3和SaOS2组来源的移植瘤，细胞大小不一，细胞核深染且异形性大，可见部分病理性核分裂像，有较多的坏死灶和高密度的微血管；而在overTSSC3组来源的移植瘤组织中，没有观察到坏死组织、病理性核分裂像以及高密度的微血管。结果说明低表达TSSC3使移植瘤更加接近于骨肉瘤的组织学特征。（3）免疫组化染色检测移植瘤组织中TSSC3、Ki67表达，结果显示： overTSSC3组高表达TSSC3，SaOS2组弱表达TSSC3， siTSSC3组中未检测到TSSC3的表达。采用Ki67染色，对瘤体内肿瘤细胞的增殖活性进行标记发现，overTSSC3组低表达Ki67，siTSSC3组高表达Ki67，差异有统计学意义。结果表明TSSC3在移植瘤组织中的表达与Ki67的表达负相关。三、TSSC3的表达通过线粒体途径促进了骨肉瘤细胞的凋亡1．TSSC3的表达促进了骨肉瘤细胞的凋亡：（1）倒置显微镜下观察，对照组SaOS2、overCON细胞呈短梭形，折光性强，透明度大，轮廓不清，胞质中未见颗粒样物质；而overTSSC3细胞则生长缓慢，形态不规则，失去原有特点，折光性降低，细胞间隙增大，胞质中出现颗粒样物质，细胞活力差，并有较多悬浮细胞。透射电镜下观察，overTSSC3细胞较对照组显示出了凋亡的特征，核膜不规则，核浓缩碎裂，出现新月体形核，胞质中出现空泡及凋亡小体。以上形态学的观察结果提示了TSSC3对细胞凋亡有促进作用。（2）AnnexinV/PI染色，流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示：相对于对照组，overTSSC3组的早期凋亡和晚期凋亡率分别从5.70%和1.39%明显地提高到了14.70%和9.97%。相反，低表达TSSC3使早期和晚期凋亡率分别下调了4.04倍和4.32倍。另外，我们采用PI染色检测亚G0期细胞的比率，细胞的凋亡率随着TSSC3的表达下调而下降。TUNEL染色的结果同样显示了在overTSSC3细胞中，FITC阳性细胞的表达要明显地高于对照组。2. TSSC3的表达促进了瘤体细胞的凋亡：移植瘤组织TSSC3和TUNEL免疫荧光双染结果显示：相对于对照组，overTSSC3细胞来源的移植瘤组织中TSSC3和TUNEL染色的比例和强度同时明显地增加，且共定位于同一细胞中，结果表明持续的TSSC3表达明显增加了瘤体细胞的凋亡。3.TSSC3通过线粒体凋亡信号转导途径诱导骨肉瘤细胞的凋亡：（1）荧光定量PCR结果显示：高表达TSSC3明显地增加了caspase-3和Cytc的表达，并同时上调了Bax:Bcl-2的比率；对于死亡受体通路而言，TSSC3的上调反而引起了Fas的下调以及Flip的上调，差异有统计学意义。反之，相对于siCON细胞，在siTSSC3细胞中caspase-3，Cytc，Bax:Bcl-2和Flip分子明显地下调，Fas则明显地上调，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3在基因水平通过上调内源性线粒体通路发挥诱导凋亡的作用。（2）免疫荧光染色结果显示：相对于overCON细胞，overTSSC3细胞上调了cleavedcaspase-3的表达，同时下调procaspase-9和Bcl-2的表达。相反，相对于siCON细胞，procaspase-9和Bcl-2在siTSSC3细胞中表达增强，但是procaspase-8的表达在overTSSC3细胞和overCON细胞中没有明显的不同。Western Blot检测结果显示：高表达TSSC3明显增加了cleaved caspase-3和Cytc蛋白的表达水平，同时显着下调了Fas蛋白的表达；而Cytc在siTSSC3细胞中的表达则明显低于siCON细胞，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3在蛋白水平通过上调内源性线粒体通路发挥诱导凋亡的作用。（3）JC-1染色结果显示：overCON细胞展示出桔红色的荧光，代表正常细胞线粒体的JC-1聚合体，而在overTSSC3细胞中红色荧光转变为绿色荧光，更加接近于阳性对照，代表凋亡细胞线粒体的JC-1单体。TSSC3使绿色/红色荧光强度的比值从0.90±0.04增加到4.31±0.87，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3破坏了线粒体膜电位，诱导了内源性凋亡信号转导途径。四、TSSC3通过诱导线粒体途径的凋亡增加了骨肉瘤细胞对化疗的敏感性1.TSSC3通过诱导凋亡增加了骨肉瘤细胞对化疗的敏感性：（1）AnnexinV/PI染色，流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示：顺铂和表柔比星处理后，overTSSC3细胞的凋亡率（特别是晚期凋亡率）明显地高于overCON细胞。而低表达TSSC3则明显地降低了化疗药处理后细胞的凋亡。（2）TUNEL免疫荧光染色结果显示：overTSSC3细胞在化疗药处理后FITC荧光强度明显地高于对照细胞。2.TSSC3通过线粒体凋亡信号转导途径明显地增加了骨肉瘤细胞对化疗药处理的敏感性：（1）免疫荧光染色结果显示：化疗药处理后，cleaved caspase-3在overTSSC3细胞表达强度显着高于overCON细胞。Western Blot检测结果显示：Cytc、cleaved caspase-3以及cleaved PARP在overTSSC3细胞的表达水平显着地高于对照细胞；相反，Cytc在siTSSC3细胞中的表达显着低于siCON细胞，差异有统计学意义。（2）JC-1免疫荧光染色结果显示：化疗药处理后，JC-1单体在overTSSC3细胞中的表达明显地高于overCON细胞，高表达TSSC3使绿色/红色荧光强度的比值从1.33±0.67增加到6.73±1.65，差异有统计学意义。线粒体膜电位的破坏以及Cytc等凋亡分子在overTSSC3细胞中表达的增加，说明TSSC3通过线粒体途径促进了化疗药引起的骨肉瘤细胞凋亡。五、TSSC3在失巢凋亡抵抗逐渐增强的过程中渐进性地表达下调1.成功建立了骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗模型：（1）悬浮-贴壁循环培养法建立骨肉瘤失巢凋亡抵抗细胞模型： SaOS2悬浮3天后，贴壁培养直至长成单细胞层，再次悬浮14天后再次贴壁培养，所形成的单层细胞即为失巢凋亡抵抗细胞，记为SaOSar。悬浮培养后细胞变圆，最初为散在的单个细胞逐渐成团生长，随着时间的推移细胞团块不断增大、致密。（2）骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗模型的鉴定：采用流式细胞术检测失巢凋亡细胞模型中各时相点悬浮细胞的凋亡率，贴壁培养SaOS2细胞的凋亡率（仅指早期凋亡率）为4.34%，悬浮24h之内凋亡率上升得最快，达到20.36%，3天和7天时分别为33.76%和49.36%，7天后凋亡率上升逐渐变缓，到14天时为55.28%，14天后凋亡率无显着变化。SaOS2与SaOSar细胞悬浮24h后检测凋亡率，前者的早期与晚期凋亡率分别为14.39%和21.79%，而后者仅为5.35%和10.07%。2.TSSC3在失巢凋亡抵抗逐渐增强的过程中渐进性地表达下调：采用荧光定量PCR、免疫荧光染色的实验方法得到如下结果：（1）TSSC3在失巢凋亡抵抗逐渐增强的过程中渐进性地表达下调。其中悬浮第1天和第7天下降幅度最显着，都较其前一时间点下降了65%，悬浮第14天后TSSC3的表达与未悬浮的SaOS2细胞相比下降了95%，差异有统计学意义。（2）相对于SaOS2细胞，TSSC3mRNA和蛋白的表达在SaOSar细胞中分别下调了56%和55%，差异有统计学意义。（3）TSSC3的表达在MTF中较hFOB1.19成骨细胞下降了67%，在MTFar中较MTF下降了15%，差异有统计学意义。综合以上结果提示TSSC3可能通过表达抑制参与骨肉瘤的失巢凋亡抵抗，进而促进了骨肉瘤的演进。六、TSSC3通过调控EMT相关分子以及转移相关分子的表达促进了MET，抑制了骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和转移潜能1.TSSC3的表达抑制了骨肉瘤细胞的迁移能力：采用细胞划痕实验检测细胞的运动能力，结果显示：overTSSC3和over overTSSC3ar细胞向致伤区迁移的距离明显小于各自的对照细胞，而siTSSC3细胞则明显大于siCON细胞。2.TSSC3的表达显着地降低了细胞的侵袭能力：采用Transwell侵袭小室法测定细胞的侵袭能力，结果显示：overTSSC3和overTSSC3ar的下室细胞数显着低于各自对照细胞，overTSSC3和overCON分别为8±2和105±16，overTSSC3ar和overCONar分别为40±6和179±26，差异有统计学意义。而siTSSC3的下室细胞则明显多于siCON细胞，siTSSC3和siCON分别为158±11和30±5，差异有统计学意义。3.TSSC3的表达对骨肉瘤细胞EMT相关分子以及转移相关分子表达的影响：采用荧光定量PCR的实验方法得到如下结果：（1）高表达TSSC3增加了上皮标志E-cadherin的表达，同时下调了间质相关标志N-cadherin、 Vimentin、Fibronectin以及EMT相关转录因子Twist、Snail、Slug、Smad1、Smad4、ZEB1、ZEB2的表达，差异有统计学意义。结果说明：高表达TSSC3使骨肉瘤细胞发生了MET。（2）高表达TSSC3降低了转移相关分子CD44s、CXCR4及金属蛋白酶家族分子MMP2、MMP7、MMP9、MMP14的表达，同样在失巢凋亡抵抗细胞中过表达TSSC3也得到了同样的结果，差异有统计学意义。相反，低表达TSSC3上调了CD44s、CXCR4、MMP7、MMP14的表达，差异有统计学意义。结果说明：高表达TSSC3在基因水平下调了骨肉瘤细胞侵袭和转移的潜能。七、TSSC3通过抑制整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号通路从而促进了骨肉瘤的失巢凋亡，并增加了失巢凋亡细胞对化疗药的敏感性1. TSSC3抑制整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号通路从而通过线粒体途径促进了骨肉瘤的失巢凋亡：（1）倒置显微镜下观察各转染组细胞悬浮状态下的细胞形态：与对照组相比，overTSSC3细胞团块较小且松散，有较多散在的凋亡细胞。流式细胞术检测各细胞悬浮3天的失巢凋亡率显示：SaOS2、overCON、overTSSC3分别为31.20%、31.00%、47.90%（早期凋亡率）；相反，siTSSC3细胞团块较大且紧密，散在的凋亡细胞较少。流式细胞术检测各细胞悬浮1天的失巢凋亡率显示：siCON、siTSSC3分别为22.70%、3.52%（早期凋亡率），且siTSSC3细胞的失巢凋亡率与抗失巢凋亡细胞SaOSar相近（8.55%）。结果表明：TSSC3促进了骨肉瘤细胞的失巢凋亡。（2）JC-1染色，流式细胞术检测线粒体膜电位的改变，结果显示：悬浮3天后，overTSSC3JC-1单体所占的比例为36.5%，明显高于对照细胞overCON （14.4%）和SaOS2（13.9%）。Western Blot结果显示：overTSSC3细胞溶质中Cytc的表达量显着高于overCON，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3破坏了骨肉瘤失巢凋亡细胞的线粒体膜电位从而促进了Cytc的释放。（3）荧光定量PCR的结果显示：高表达TSSC3增加了Puma、Noxa、Bim、Bax、Bak、Cytc、Apaf-1和caspase-3的表达，同时下调了Bcl-2和Bcl-xL的表达，从各个环节促进了线粒体途径的失巢凋亡，差异有统计学意义。相反，低表达TSSC3降低了Puma、Noxa、Bax、Cytc和caspase-3的表达，同时升高了Bcl-2的表达，差异有统计学意义。另外，overTSSC33day细胞中Bax/Bcl-2的比值为5.97，而overCON3day细胞中为0.40，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3通过线粒体凋亡信号途径增加了骨肉瘤细胞对失巢凋亡的敏感性。（4）荧光定量PCR的结果显示：高表达TSSC3同时降低了integrinβ4与Ezrin的表达，上调了integrinα2、integrinβ1的表达，且TSSC3与Caveolin-1的表达正相关，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3参与调控骨肉瘤细胞失巢凋亡信号途径中的多个分子。（5）Western Blot检测结果显示：过表达TSSC3使悬浮细胞整合素蛋白信号传导激酶Src的磷酸化水平降低，P-Akt降低，Akt升高， P-Bad降低，促进了Cytc从线粒体释放到胞质，cleaved caspase-3升高，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3抑制了整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号通路从而通过线粒体途径促进了骨肉瘤的失巢凋亡。2.TSSC3通过抑制整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt信号通路增加了失巢凋亡细胞对化疗药的敏感性：（1）AnnexinV/PI染色，流式细胞术检测细胞凋亡率显示：悬浮状态下用化疗药处理各转染组细胞3天，SaOS2、overCON凋亡率分别为59.90%、56.90%，而overTSSC3则达到78.60%。结果表明：高表达TSSC3显着地增加了失巢凋亡细胞对化疗药的敏感性。（2）JC-1染色，流式细胞术检测显示：悬浮状态下用化疗药处理各转染组细胞3天，SaOS2、overCON、overTSSC3细胞JC-1单体的比例分别为42.8%、35.6%、63.4%。结果表明：高表达TSSC3通过线粒体通路促进了失巢凋亡细胞化疗药处理后引起的凋亡。（3）Western Blot检测显示：悬浮状态下用化疗药处理各转染组细胞3天，高表达TSSC3降低了化疗药处理后失巢凋亡细胞P-Src和P-Akt的表达，同时增加了cleavedcaspase-3的表达，差异有统计学意义。结果表明：TSSC3通过抑制整合素介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号增加了失巢凋亡细胞对化疗药的敏感性。综上所述，本研究的主要结论是：1.印迹基因TSSC3在骨肉瘤中低表达，它通过抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导凋亡发挥抑癌基因作用，其机制可能为通过调控线粒体途径增加骨肉瘤的基础凋亡率和化疗敏感性。2.印迹基因TSSC3可通过调控EMT相关分子以及转移相关分子CD44s、CXCR4和MMP家族分子的表达促进MET，抑制骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和转移潜能。3.印迹基因TSSC3在骨肉瘤细胞失巢凋亡抵抗逐渐增强的过程中渐进性地表达下调，其机制可能为通过抑制整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号通路从而促进骨肉瘤的失巢凋亡，并增加失巢凋亡细胞对化疗药的敏感性。本研究首次报道了印迹基因TSSC3在骨肉瘤发生和演进过程中的表达变化、功能及作用机制。从印迹基因的角度探讨了骨肉瘤失巢凋亡及耐药的分子机制。提出了印迹基因TSSC3作为抑癌基因可抑制骨肉瘤细胞增殖、诱导凋亡（包括失巢凋亡），并通过调控EMT相关分子以及转移相关分子的表达促进了MET，抑制了骨肉瘤细胞的迁移、侵袭和转移潜能。其分子机制可能是通过内源性线粒体途径诱导凋亡以及抑制整合蛋白信号传导激酶Src介导的PI3K/Akt失巢凋亡抵抗信号通路促进骨肉瘤的失巢凋亡。上述结果说明印迹基因TSSC3在骨肉瘤的发生演进中发挥着至关重要的作用，为以TSSC3为靶点、寻找更具特异性的骨肉瘤靶向基因治疗和表遗传学调控策略提供了理论和实验依据。

周静^[3]（2010）在《丹参酮IIA对自杀基因旁观者效应增效作用及机制研究》文中研究表明恶性肿瘤是严重危害人类健康和生命的重大疾病。随着分子生物学的发展,基因治疗给恶性肿瘤患者带来了曙光,国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。自杀基因治疗是当前最有前景的肿瘤基因治疗方案,对肿瘤细胞具有特异性并能产生旁观者效应,理论上能完全消除肿瘤细胞达到治愈的效果,但由于尚存在载体转染效率低、靶向性不够等问题还没解决,因而未能达到预期的效果。如何有效的提高治疗效果,同时减少毒副作用是目前仍须解决的关键问题。增强旁观者效应能降低对高转染率的要求,减少载体及前体药物用量和毒性,增强基因治疗系统对肿瘤的杀伤力。因此,增强旁观者效应已成为提高肿瘤自杀基因治疗疗效的重要策略。目前主要采用基因转染法或药物诱导法以促进缝隙连接细胞通讯（GJIC）、诱导细胞凋亡或提高患瘤机体免疫功能等措施来提高自杀基因系统的旁观者效应。中药是一个天然药物宝库,中医研究肿瘤病学的历史源远流长,迄今为止,不少报道证实了中药在促进肿瘤GJIC、诱导癌细胞凋亡等方面都有独特的优势或潜力,加之价格低廉,给药方便,毒副作用较少,使其极有可能成为自杀基因疗法的有效增效成分,联合使用可发挥协同性抗肿瘤作用。研究目的意义：本研究选择被报道具有抗肿瘤作用的中药成分丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙,研究其对自杀基因系统是否有增效作用,在获得有明显作用的中药成分基础上进一步探讨其对肿瘤细胞生长、诱导细胞凋亡以及增强细胞缝隙连接通讯等方面的影响,以了解该有效中药成分增强旁观者效应的作用机制,探讨建立一种自杀基因疗法联合中药成分的中西医结合肿瘤基因治疗方案,为肿瘤治疗提供新的思路和模式。实验方法：1.中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选：丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙成分各自以不同浓度单独或与GCV共同作用于大鼠肝癌细胞CBRH7919的10%tk+/tk-混合细胞,MTT检测各组抑制率,两两比较分析各组抑制率的差异和旁观者效应大小,用金正钧Q值分析中药与自杀基因系统联合的相互作用是否具有协同性。筛选出的活性中药成分,用小鼠黑色素瘤细胞B16的10%tk+/tk-混合细胞对其联合自杀基因系统的增效作用进行验证。2.丹参酮ⅡA联合自杀基因系统对小鼠移植性黑色素瘤细胞的治疗观察。实验分为模型对照组、丹参酮ⅡA组、GCV组和丹参酮IIA+GCV联合组;把tk+、tk-细胞按1：4比例混合接种C57BL／6J小鼠腋下皮下组织内,每只小鼠接种2×105个肿瘤细胞,次日雌雄均随机分组；接种后1-7天用中药治疗,7天后用自杀基因系统治疗7天,进行疗效观察。3.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞和小鼠黑色素瘤细胞的影响：以大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16两种细胞株为对象,采用MTT法从浓度依赖和时间依赖两方面检测有效中药成分对两种细胞生长的影响；形态学观察药物作用后细胞的形态变化；彗星电泳检测药物对细胞DNA的影响。4.采用流式细胞技术观察丹参酮ⅡA对HSV-tk/GCV系统的影响。检测丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16细胞周期和凋亡率的影响。PI单染法检测丹参酮ⅡA对10%CBRH7919/tk+和B16／tk+的影响：用终浓度为12.5μM、25、50μM的丹参酮ⅡA与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10% CBRH7919/tk+和B16／tk+细胞72h,各组细胞经收集后PBS洗2次,用预冷的70%乙醇固定后,PI染色,流式细胞仪进行凋亡率和细胞周期分析。5.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤细胞B16缝隙连接的影响。采用降落伞法观察丹参酮ⅡA对细胞GJIC的影响：培养板内的细胞用绿色荧光染料钙黄绿素（Calecin-AM）孵育,该染料在细胞内代谢后所产生的代谢产物可通过GJ进行传递。把被绿色荧光染料标记的细胞制成细胞悬液,使绿色荧光细胞像降落伞一样降落到无标记的细胞组内,通过观察绿色荧光染料在细胞内的传输判断药物对细胞GJIC功能的影响；在丹参酮ⅡA和HSV-tk/GCV联合的系统中加入GJ长效抑制剂甘草次酸,MTT法检测甘草次酸对联合系统的影响：加入丹参酮ⅡA至终浓度为0μM、12.5μM、25μM、50μM四个不同浓度组,GCV终浓度分别为OgM和15.7μM,甘草次酸浓度分别0、15μM,药物和GCV两个浓度分别联合,药物和GCV与甘草次酸的两个浓度分别联合,药物作用72h后MTT法测定肿瘤细胞对不同组别的敏感程度;分别用终浓度为12.5μM、25μM和50μM的丹参酮ⅡA作用CBRH7919细胞和B16细胞72h,然后采用RT-PCR和Western-blot技术检测各组细胞Cx43的表达量。实验结果：1.中药活性成分对自杀基因旁观者效应影响的体外筛选：各浓度丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的细胞抑制率（%）分别为30.38±5.28、33.22±5.21、40.58±4.49和73.04±2.85,与单纯10%tk+/GCV组（21.04±3.96）和相应的各浓度丹参酮ⅡA组（3.65±2.84、4.74±4.48、17.34±5.08和52.81±5.95）的抑制率明显提高。从其两两比较的表2可知,6.25μM、12.5μM、25μM和50μM浓度下的丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的实际抑制率显着高于理论抑制率,金正钧Q值分别为1.270、1.341、1.168和1.164,均大于1.15。用小鼠恶性黑色素瘤细胞以相同浓度的丹参酮ⅡA联合自杀基因重做该实验,结果表明,6.25μM、12.5μM、25μM和50μM浓度下的丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV组的实际抑制率显着高于理论抑制率,金正钧Q值分别为2.276、1.892、1.150和1.211,均大于1.15。说明丹参酮ⅡA对自杀基因系统具有增效作用,且该增效作用为协同作用。25μM浓度的丹参素钠联合10%tk+/GCV组的实际抑制率大于理论抑制率,金正钧Q值大于1.15,说明该浓度的丹参素钠对自杀基因系统具有增效作用。但50μM、100gM和200μM浓度下的丹参素钠联合10%tk+/GCV组的实际抑制率均低于理论抑制率,Q值均低于1.15,说明在此浓度范围内丹参素钠对自杀基因系统没有协同增效作用。100mg／L、200mg/L、400mg/L和800 mg／L浓度下的三七总皂甙联合10%tk+/GCV组的实际抑制率均低于理论抑制率,金正钧Q值均低于1.15,说明在此浓度范围内三七总皂甙对自杀基因系统没有协同增效作用。2.丹参酮ⅡA联合自杀基因系统对小鼠移植性黑色素瘤细胞的治疗观察。各组小鼠均在9-10日在右腋下触及肿块,自杀基因系统联合丹参酮ⅡA组治疗后,肿瘤生长速度减慢,肿瘤呈现生长抑制状态,平均肿瘤体积200.2 mm3,比模型对照组352.7 mm3减少43.24%（P<0.05）,小鼠平均肿瘤质量0.278g,比模型对照组0.5628减少50.6%（P<0.05）,统计学上差异有显着性意义。GCV组平均肿瘤体积比模型对照组减少34.76%（P<0.05）；小鼠的平均瘤块质量比模型对照组减少38.98%,但该结果没有统计学意义（P>0.05）。丹参酮ⅡA组平均肿瘤体积比模型对照组减少29.94%,小鼠的瘤块质量比模型对照组减少21.22%,但其肿瘤体积和质量与对照组相比都没有统计学意义（P>0.05）。以上结果提示：丹参酮ⅡA能提高自杀基因系统对小鼠移植瘤的杀伤力,协同自杀基因作用,达到提高自杀基因疗效的效果。3.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤B16的影响：CBRH7919和B16经梯度浓度丹参酮ⅡA（12.5μM、25μM和50μM）作用后都出现了不同程度的生长抑制,而且相关分析显示,这一抑制作用表现出一定的浓度和时间依赖性,浓度增加,或药物作用时间延长,都会使抑制率增加。倒置相差显微镜观察到CBRH7919和B16的对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形,药物作用后细胞生长增殖明显受到抑制,增殖缓慢,几乎停滞,细胞逐渐由贴壁而脱落,药物浓度越高脱落细胞越多。Hoechst染色后,可见CBRH7919的细胞形态变圆,折光性差,体积减小,细胞核皱缩、染色质浓缩,胞内多见颗粒,高浓度组可见数个圆形凋亡小体围绕在细胞周围,但未观察到B16细胞的死亡或凋亡现象。彗星电泳结果显示,大鼠肝癌细胞CBRH7919细胞和小鼠恶性黑色素瘤细胞株B16经梯度丹参酮ⅡA（12.5μM、25μM和50μM）作用后,DNA发生损伤细胞后面形成长的拖尾,并呈典型凋亡彗星尾形态,平均光密度值较阴性对照均降低,差异具统计学意义,彗星尾距阴性对照均增加,差异具统计学意义,且二者的改变与作用浓度相关,即浓度越大,DNA受损伤的细胞越多。4.采用流式细胞技术观察丹参酮ⅡA对HSV-tk/GCV系统的影响。丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV作用于大鼠肝癌细胞CBRH7919时,S期细胞较对照组和GCV单独作用组都有了显着的增加,说明丹参酮ⅡA联合10%tk+/GCV可有效地使大鼠肝癌细胞CBRH7919阻滞在S期,抑制DNA的合成。25μM联合组的凋亡率是23%,50μM联合组的凋亡率则达到35%,是相应浓度丹参酮ⅡA或GCV单独作用时凋亡率的5倍,说明丹参酮ⅡA能大大增加自杀基因系统的杀伤能力,抑止肝癌细胞CBRH7919的生长,促进它的凋亡。药物对B16细胞周期的影响较少,但25μM和50μM联合组的流式图上均观察到亚二倍体凋亡峰,50μM联合组的凋亡率达到34%,说明丹参酮ⅡA可促进B16 （10%tk+/GCV）细胞系统的细胞凋亡,对自杀基因系统具有增效作用。5.丹参酮ⅡA对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠恶性黑色素瘤细胞B16缝隙连接蛋白的影响。降落伞实验的结果显示,经过丹参酮ⅡA作用后,细胞之间出现了染料传输的现象,而且随着浓度的升高,含有绿色荧光的贴壁无标记细胞数量增多,提示丹参酮ⅡA极有可能具有增强细胞间GJIC的作用,而且浓度越高,效果越强；在丹参酮ⅡA和HSV-tk/GCV联合的系统中加入GJ长效抑制剂甘草次酸后,结果显示甘草次酸能显着下调丹参酮ⅡA与10%tk+/GCV的联合作用,使药物对细胞的抑制率降低,说明丹参酮ⅡA对自杀基因系统的增效作用机制很可能与改善细胞间缝隙连接细胞通讯有关；RT-PCR和Western-blot检测结果显示：高浓度（≥50μM）丹参酮ⅡA对CBRH7919细胞的Cx43mRNA和蛋白的表达有促进作用,而中、低浓度组则无明显上调作用；12.5μM、25μM和50μM的丹参酮ⅡA对B16细胞Cx43蛋白表达都有上调作用,但只有高浓度组对Cx43的mRNA表达有增强作用。实验结论：本文在细胞水平探讨了丹参酮ⅡA、丹参素钠和三七总皂甙三种中药活性成分对HSV-tk/GCV自杀基因疗法的旁观者效应,发现丹参酮ⅡA能有效增强自杀基因对细胞杀伤力,提高旁观者效应,而且有协同增效作用。丹参酮ⅡA还在小鼠移植瘤模型上得到了疗效验证：其联合自杀基因系统能明显抑制小鼠移植性黑色素瘤。通过体内实验对丹参酮ⅡA促进自杀基因旁观者效应的机制进行初步的研究,推测其增效机制可能是：丹参酮ⅡA作用于肿瘤细胞后在一定程度上恢复了Cx介导的GJIC功能,在一定程度上恢复或增强了细胞间的通讯,同时使肿瘤细胞阻滞于S期,令细胞毒素GCV-TP能更充分地起作用,进一步阻碍肿瘤细胞DNA的合成,使DNA发生损伤,并最终诱导细胞的凋亡。而细胞毒素则通过凋亡或细胞连接通讯的途径进入临近更多的细胞,从而使自杀基因的杀伤作用大大加强。本研究为探讨中药增强自杀基因旁观者效应的可行性及其机制研究打下了基础,今后将在待选中药中继续筛选更多针对不同旁观者效应机制的强效中药成分,对有效中药成分的药理机制深入研究,从GJIC、细胞凋亡、免疫调节等及其与旁观者效应的关系这一新领域阐明中药的抗肿瘤机制。还可望进一步把针对多种增效机制的多种中药成分联合组成比单一成分更高效的复方,形成组分与药理药效明确、质量稳定的鸡尾酒式肿瘤基因治疗增效中药复方。研究有利于促进肿瘤基因治疗的临床推广应用,为建立新的肿瘤基因治疗联合疗法提供了实验依据。

徐晓红^[4]（2010）在《抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用》文中进行了进一步梳理由抗体介导的免疫靶向治疗是肿瘤生物治疗的主要组成部分,但其发展仍面临诸多挑战,如作为靶向工具的抗体分子量比较大、侵透性差、稳定性弱；所应用抗体多为鼠源抗体,免疫原性较高；所应用抑癌分子特异性较低,存在损伤正常细胞的隐患等。癌胚抗原（carcinoembryonic antigen, CEA）是一种广泛存在于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞表面的高度糖基化癌胚蛋白。人源化的抗CEA单链抗体（single chain Fv fragment, scFv） T84.66对CEA具有较高特异性,已普遍应用于结直肠癌、乳腺癌等多种肿瘤的诊断和免疫治疗,其疗效已为临床Ⅰ期试验所证实。且scFv T84.66具有结合活性高、侵透性强、免疫原性低和廓清快等优点。scFv T84.66同其它单链抗体一样具有先天缺陷,如较亲本抗体亲合力有所下降；在体温条件下稳定差较差；特定情况下会出现聚集倾向等,这可能与scFv的轻、重链可变区存在非共价键有关,但这种现象会通过引入链间二硫键而有所改观,即将scFv改构为稳定性较高的二硫键稳定型单链抗体（disulfide stabilized single chain Fv fragments, scdsFv）。Apoptin基因来源于鸡贫血病毒（chicken anemia virus, CAV）,能够特异性地诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常细胞无细胞毒作用。另外,肿瘤的放射治疗和多数化学治疗药物通过p53发挥作用,一旦p53突变即会形成耐药,而Apoptin的凋亡诱导作用不依赖p53,也不受凋亡抑制分子bcl-2等因素的影响,bcl-2分子的存在反而能够增强其作用。因此,Apoptin基因已广泛应用于肿瘤基因治疗研究领域。本研究通过生物信息学方法设计scdsFv T84.66,并利用人工合成方法,将Apoptin基因通过柔性肽序列连接至scdsFv T84.66下游,构建并表达了具有特异性识别／结合CEA功能和特异性杀伤肿瘤细胞功能的抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin,并在体内、外对其抑瘤作用进行了分析。

韩硕^[5]（2009）在《腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究》文中指出神经胶质瘤是人类最常见的脑部肿瘤,已成为15岁以下儿童肿瘤致死的第二大病因,是导致3554岁成年男性和1534岁女性肿瘤死亡的第四大病因。目前,恶性胶质瘤的常规治疗手段（手术加放化疗）治疗困难、远期效果差,死亡率高。对于恶性程度高的胶质瘤患者,生存期短、5年生存率小于1%。怎样改善胶质瘤的治疗效果,是临床面对的一个难题。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的研究进展,对于肿瘤的基因治疗方面取得了长足进步,为提高恶性胶质瘤的治疗效果,增加患者的生存率开拓了新的思路。白细胞介素24（interleukin-24,IL-24）是细胞因子白介素10家族的新成员,由于最初在人类黑色素瘤中发现,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7（melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7）基因。研究发现,IL-24对多种肿瘤细胞（肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌、肝癌等）均有选择性的抑制作用。此外,IL-24与化疗、放疗相结合的研究表明,将IL-24基因转染入人非小细胞肺癌的细胞后,可增强此肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,而同时接受照射的人正常成纤维细胞则未受此放射线照射的影响。由于IL-24特有的杀伤肿瘤细胞,而对正常细胞没有损伤作用的生物学特点,现已成为基因治疗的候选基因,并成功用于1期临床研究。目前,关于IL-24对胶质瘤作用的研究报道尚少,尤其对于IL-24诱导胶质瘤细胞凋亡的分子机制尚缺乏足够的了解。本研究应用新型重组腺病毒载体（Ad5F35-IL24）,将IL-24基因导入人胶质瘤U251细胞,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳（Single cell gel electrophoresis; SCGE）等技术,体外观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验、细胞划痕实验（Cell scratch assay）检测药物作用后肿瘤细胞侵袭、迁移能力的改变。应用Western blot印迹检测外源性IL-24基因转染U251细胞后, ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK等细胞信号转导通路蛋白的表达水平变化。同时应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAPK蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤中作用的影响。应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。以期更深入的了解IL-24基因可能的效应途径和作用靶点,为进一步提高临床神经胶质瘤治疗效果提供研究基础。第一部分Ad5F35-IL24重组腺病毒载体的构建目的:构建重组腺病毒载体Ad5F35-IL24。方法:先用HindⅢ和SalⅠ双酶切ATCC质粒,得到目的条带,然后再用HindⅢ和SalⅠ双酶切pDC316质粒,得到线性化的载体条带,进行片断连接,转化,筛选得到重组的pDC316-IL24质粒。随后用PCR和酶切的方法对重组pDC316-IL24质粒进行鉴定;最后经全自动核酸分析仪上进行序列测定证实连接正确。制备感受态细胞,进行转化,大量制备质粒DNA;之后用双质粒共转染293细胞,产生重组腺病毒Ad5F35-IL24。进行病毒扩增、纯化,计算病毒滴度,按照公式:病毒滴度（PFU/mL）=GFP阳性细胞数×病毒上清稀释倍数/0.5 mL。结果:成功构建载有IL-24基因的重组pDC316-IL24质粒,并用PCR、酶切、序列测定和BLAST的方法进行了鉴定,证明连接正确;获得了携带IL-24基因的大肠杆菌菌株;成功构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,并进行了扩增和纯化。测得病毒滴度为2.8×108 PFU/mL。结论:成功构建携带IL-24基因,具有增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24载体。第二部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的侵袭、迁移及杀伤作用目的:观察IL-24基因对U251人胶质瘤细胞的杀伤作用,及其对肿瘤细胞侵袭、迁移能力的影响。方法:用MTT、流式细胞术、双荧光染色、Hoechst 33258荧光染色、Annexin V-FITC凋亡试剂盒和单细胞凝胶电泳（ Single cell gel electrophoresis; SCGE）等技术,观察Ad5F35-IL24对U251细胞的杀伤作用。同时用transwell细胞侵袭实验和细胞划痕实验（Cell scratch assay）,检测药物作用后对肿瘤细胞侵袭和迁移能力的影响。结果:与空白对照组和空载体组相比,Ad5F35-IL24能够抑制人U251细胞的增殖,诱导细胞凋亡,且随着Ad5F35-IL24药物浓度的增加,细胞杀伤率增加明显。结果表明,Ad5F35-IL24对U251细胞细胞周期进程有抑制作用,可使细胞周期被阻滞于G2/M期。同时,研究表明Ad5F35-IL24组可显着降低U251细胞的侵袭和迁移能力。结论:Ad5F35-IL24能够诱导人U251细胞凋亡,诱导G2/M期阻滞,降低肿瘤细胞的侵袭和迁移能力。第三部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响目的:探讨外源性IL-24基因对U251胶质瘤细胞ERK和p38 MAPK信号转导通路的影响。方法:IL-24基因转染U251细胞24小时后,应用Western blot印迹检测细胞信号转导通路蛋白ERK、p-ERK、p38 MAPK和p-p38 MAPK的表达水平变化。同时,应用MTT、流式细胞术、双荧光染色观察ERK、p38 MAP蛋白抑制剂PD98059、SB203580作用后,对IL-24基因介导U251细胞杀伤作用的影响,以及细胞内相关蛋白表达水平的变化。结果:Western Blot结果表明:外源性IL-24基因作用于胶质瘤细胞U251后,p38 MAPK和p-p38 MAPK蛋白表达（0.46±0.07, 0.60±0.07）明显增强（P<0.05）。将p38 MAPK抑制剂SB203580与Ad5F35-IL24合用后（20.83±1.34）,较Ad5F35-IL24单用组（36.15±2.61）杀伤作用减弱（P<0.05）。ERK和p-ERK蛋白的与对照组相比没有显着改变（P>0.05）。ERK蛋白抑制剂PD98059与Ad5F35-IL24合用,能够提高IL-24基因对U251的杀伤作用（P<0.05）。结论:外源性IL-24基因对U251的选择性诱导凋亡作用,可能与其上调并激活p38 MAPK表达有关。而阻断ERK途径可进一步提高IL-24基因对肿瘤细胞的杀伤。第四部分腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞拓扑异构酶Ⅱα、bcl-2及caspase-3表达的影响目的:观察外源性IL-24基因对bcl-2、caspase-3以及拓扑异构酶Ⅱα表达（TopoⅡα）的影响。方法:应用Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术、免疫细胞化学的方法检测bcl-2、caspase-3和TopoⅡα蛋白的表达变化情况。结果:Western blot印迹结果表明,Ad5F35-IL24组TopoⅡα蛋白表达（0.48±0.03, 0.31±0.02）较对照组（1.35±0.07）和空载体VEC组（1.39±0.11, 1.26±0.06）表达减低（P<0.05）。且随IL-24基因表达浓度增高TopoⅡα表达随之减低。Ad5F35-IL24组bcl-2的表达（0.02±0.01）也较对照组（0.17±0.02）和空载体VEC组（0.18±0.01）表达减低（P<0.05）。Ad5F35-IL24组caspase-3蛋白的表达（0.71±0.09）较对照组（0.43±0.04）和空载体VEC组（0.47±0.02）表达增加（P<0.05）。流式细胞术检测表明,caspase-3表达增加,bcl-2表达降低（P<0.05）。Western blot印迹、RT-PCR、流式细胞术的方法观察到TopoⅡα表达降低,且与药物浓度增加成反比。免疫细胞化学检测发现TopoⅡα表达降低。结论:外源性IL-24基因杀伤U251细胞,TopoⅡα、bcl-2、caspase-3为其重要的作用靶点。研究结果为今后IL-24基因用于胶质瘤的临床治疗提供了实验资料。

郭晶^[6]（2009）在《姜黄素对tk/GCV自杀基因系统旁观者效应的增效作用及机制》文中研究表明恶性肿瘤目前仍然是一类严重危害人类生命的常见病,随着现代医学的发展,基因治疗作为一种全新的治疗方法受到关注。国外已把基因治疗作为恶性肿瘤常规治疗无效后的一种标准治疗尝试。但由于存在载体转染效率较低、靶向性不足、使用有一定毒副作用、对肿瘤细胞的杀伤效率不够高的问题,因此如何有效地减少载体及前体药物用量和毒性,增强基因治疗系统对肿瘤的杀伤力的解决就显得极为迫切。中药具有毒副作用较少,可减轻放化疗副作用等优势,从中寻找自杀基因增效药物,进行中西医结合治疗肿瘤也愈来愈被世界医学所认可和接受。研究目的:本实验研究姜黄素对自杀基因系统的协同增效作用及作用机制,探讨其通过GJIC或细胞凋亡机制增强自杀基因旁观者效应的药理靶点,阐明其增效的机理,为建立肿瘤基因治疗联合中医药疗法,推进肿瘤基因治疗的临床应用和抗肿瘤中药新药开发提供实验依据。实验方法:1.采用MTT法从姜黄素中筛选对肿瘤自杀基因旁观者效应有协同作用的作用浓度（用金正均Q值作为评价标准）。首先检测姜黄素对大鼠肝癌细胞CBRH7919和小鼠黑色素瘤细胞B16的作用:分别用终浓度为0μM、3.125μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的姜黄素作用CBRH7919细胞48h和终浓度为0μM、6.25μM、12.5μM、25μM、50μM的姜黄素作用B16细胞72h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。接着筛选GCV对B16细胞的最佳工作浓度和HSV-tk/GCV治疗中tk+:tk-细胞的最佳比例:选择GCV浓度为0μM、3.925μM、7.85μM、15.7μM、31.4μM、62.8μM作用B16细胞72h;选择tk+:tk-细胞比例为0%、10%、20%、30%、50%、100%的B16细胞作用48h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞存活率。最后检测姜黄素对CBRH7919和B16细胞HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk+细胞和20%B16/tk+细胞48h。倒置显微镜下观察药物作用前后各组细胞的数目和形态;MTT法检测各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正均Q值分析姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。2.采用流式细胞技术检测姜黄素对肝癌细胞周期及细胞凋亡指数的影响。PI单染法检测姜黄素对10%CBRH7919/tk+细胞周期的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk+细胞48h。流式细胞技术分析各组细胞周期相。AnnexinV/PI双染色法检测姜黄素对细胞凋亡指数的影响:用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素与终浓度为15.7μM的GCV分别和联合作用10%CBRH7919/tk+细胞48h。流式细胞技术分析各组细胞凋亡指数。计算各组细胞抑制率,两两比较分析各组细胞抑制率的差异和旁观者效应大小,并用金正均Q值分析姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合的相互作用是否具有协同性。3.采用预标记双染料传输技术观察姜黄素对CBRH7919及B16的GJIC功能的影响。分别用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素作用CBRH7919和B16细胞48h,然后采用预标记双染料传输技术及流式细胞术检测各组细胞GJIC功能。4.采用RT-PCR及Western-blot技术检测姜黄素对缝隙连接Cx26和Cx43的影响。分别用终浓度为6.25μM、12.5μM、25μM的姜黄素作用CBRH7919细胞和B16细胞48h,然后采用RT-PCR和Western-blot技术检测各组细胞Cx26和Cx43的的表达量。实验结果:1.姜黄素对HSV-tk/GCV系统旁观者效应的影响首先姜黄素对CBRH7919和B16细胞的杀伤作用:镜下观察可见,对照组细胞生长状况良好,贴壁很稳,密度高,细胞呈梭状、菱形、三角形或多边形;与对照组细胞相比,加药组均出现细胞数目减少、贴壁的细胞少、细胞碎片和细胞死亡（细胞变圆、脱落）。姜黄素作用CBRH7919细胞48h各浓度组细胞存活率分别为:96.0±2.45%、96.01±3.05%、92.69±2.32%、52.54±3.35%、33.62±5.44%;姜黄素作用B16细胞72h各浓度组细胞存活率分别为:71.35±1.35%、62.40±0.30%、36.0±7.0%、10.0±0.20%。实验证明:选择发挥最大药效且对B16细胞毒性最小的15.7μMGCV作为最佳工作浓度;在20%B16/tk+混合比例下药物可作用空间比较大,有利于观察药物对旁观者效应的诱导促进作用。姜黄素对自杀基因旁观者效应的体外MTT法筛选结果显示:用6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合CBRH7919细胞10%tk+/GCV组的细胞抑制率（%）分别为23.12±8.49、32.34±4.07、35.48±2.53,与单纯10%tk+/GCV组（10.80±5.03）和相应的各浓度单纯姜黄素组（0.00±5.27、5.90±8.54、22.47±2.37）的抑制率相比都高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正均Q值计算结果显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合10%tk+/GCV组的实际抑制率（分别为23.12%、32.34%、35.48%）显着高于理论抑制率（分别为10.80%、16.07%、30.84%）,金正均Q值分别为2.14、2.01、1.15均≥1.15,说明其增效作用为协同作用;用6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合B16细胞20%tk+/GCV组的细胞抑制率分别为32.15±0.81%、39.92±0.48%、67.98±0.67%,与单纯20%tk+/GCV组（13.96±1.93%）和相应的各浓度单纯姜黄素组（6.27±1.15%、22.20±0.96%、51.36±0.93%）的抑制率相比明显要高。各组细胞实际抑制率和理论抑制率的两两比较及金正均Q值计算结果显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合20%tk+/GCV组的实际抑制率（分别为32.15%、39.92%、67.98%）显着高于理论抑制率（分别为19.36%、33.07%、58.15%）,金正均Q值分别为1.66、1.21、1.17均>1.15,说明其增效作用为协同作用。2.姜黄素对肝癌细胞周期及细胞凋亡指数的影响流式细胞仪检测分析显示:6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素作用于CBRH7919的10%tk+细胞48h,G0/G1期比例降低,S期、G2/M期比例增高,呈剂量依赖关系,提示姜黄素可促进其从G0/G1期到S期的发展;姜黄素与HSV-tk/GCV系统联合作用48小时,可显着使更多癌细胞停留于S期,并诱导部分细胞凋亡。6.25μM、12.5μM和25μM的姜黄素联合10%tk+/GCV组的细胞实际抑制率（分别为14.20%、15.65%、18.05%）和理论抑制率（分别为10.85%、12.10%、13.60%）的两两比较及金正均Q值计算结果显示,金正均Q值分别为1.31、1.29、1.33均≥1.15,说明其增效作用为协同作用;3.姜黄素对CBRH7919及B16的GJIC功能的影响双染料传输技术结合流式细胞仪检测结果显示:姜黄素可增强CBRH7919及B16细胞间缝隙连接通讯功能。4.姜黄素对缝隙连接Cx26和Cx43的影响RT-PCR和Western-blot检测结果显示:姜黄素能提高CBRH7919及B16细胞缝隙连接Cx26和Cx43的mRNA及蛋白表达,并有细胞特异性及转录和翻译等水平上的差异。实验结论:本文在细胞水平实验探讨了中药活性成分姜黄素对HSV-tk/GCV自杀基因系统的增效作用,发现姜黄素能有效增强自杀基因对细胞杀伤力,提高旁观者效应,而且有协同增效作用。对其机制研究分析表明,其作用机制很可能是通过增强细胞的GJIC或诱导凋亡,调节细胞周期等来起作用,也可能是几个机制都起作用。

王娟^[7]（2008）在《RGD-FasL的基因构建、表达、纯化及功能分析》文中提出恶性肿瘤是严重威胁人类生命健康的头号杀手,手术、放疗和化疗是治疗肿瘤的常用方法。放疗、化疗因同时杀伤肿瘤细胞和正常细胞,副作用大,因此寻找特异、高效的肿瘤治疗方法一直是肿瘤研究的热点。肝癌是危害人类健康的常见恶性肿瘤,肝癌是所有肿瘤中的第二位致死因素,肝癌的治疗方法及效果对肝癌防治致关重要,近年来,随着肝癌的发病机理和治疗研究的进展,人们认识到细胞凋亡机制的异常在肝癌发生和抗肿瘤治疗中起重要作用,研究发现很多抗肿瘤治疗方法是通过诱导肿瘤细胞凋亡发挥作用,因此,寻找能够诱导肝癌细胞凋亡的活性物质,通过激发肝癌细胞的凋亡途径,达到治疗肝癌的目的是肝癌防治的有效方法之一。由于FasL具有抗肿瘤作用和多种免疫调节功能,FasL疗法的临床研究已在许多国家开展。动物实验和临床实验均表明,FasL对某些肿瘤具有明显的抑制作用;但是由于副作用较大,为FasL的临床应用造成困难。患者常因不能耐受其毒副作用而终止用药。为了降低FasL的副作用,临床多采用局部用药、联合用药、温热疗法等。尽可能降低FasL用药量,增强疗效而不损伤正常细胞,然而,欲从根本上解决FasL的疗效问题还需要对FasL进行遗传改造以获得高特异性、低毒性的新一代FasL,有关这方面的工作,目前主要集中在以下两个方面:一是根据FasL结构与功能的关系研究结果,通过遗传操作,获得FasL突变体,降低其毒副作用;二是将FasL与其它蛋白共同构建双功能的融合蛋白,实现肿瘤靶向治疗。肿瘤靶向治疗是利用特异性的载体或导向系统,将药物或其他杀伤肿瘤细胞的活性物质选择性地运送到肿瘤部位,而不影响正常细胞、组织或器官的功能,从而提高疗效、减少毒副作用。肿瘤靶向治疗中治疗靶点、靶向载体和效应分子的选择是关键。整合素是一类膜受体家族,由α和β两个亚单位组成。在部分肿瘤细胞或者肿瘤新生血管内皮细胞中,常特异性地高表达某些整合素,如αvβ3,而正常细胞不表达或表达量很低。整合素αvβ3在肿瘤新生血管形成、肿瘤生长和转移过程中发挥重要作用,可以作为一类新的肿瘤治疗靶点;RGD肽是一类含有精氨酸-甘氨酸-天门冬氨酸（Arg-Gly-Asp）的短肽,细胞外基质（ECM）和血液中的粘附蛋白是人体中最常见的含RGD序列的蛋白。研究发现,大部分整合素与其配体的结合过程,是通过识别配体中所含的RGD序列来完成的。目前,利用噬菌体表面展示技术,已经筛选出与一类与整合素αvβ3特异性结合的RGD肽,即ACDCRGDCFCG（RGD-4C）,这类RGD肽可以作为肿瘤靶向载体,特异性地引导抗肿瘤药物到达肿瘤部位,杀灭肿瘤细胞。本研究以整合素αvβ3为靶点,RGD肽为靶向载体,FasL蛋白为抗肿瘤效应分子,构建双靶向性抗肿瘤融合蛋白RGD-FasL,并检测其生物学活性,为深入探讨RGD-FasL的体内靶向抑瘤活性及肿瘤治疗应用前景奠定基础。同时丰富了FasL在肿瘤治疗中的应用形式,为肿瘤靶向治疗提供了新思路。我们获得RGD-FasL基因,构建到表达载体pGEX-5X-1,通过酶切、测序鉴定阳性重组载体。含重组质粒pGEX-5X-1/RGD-FasL的E.coli BL21DE（3）经IPTG诱导表达后,通过不同的诱导时间和诱导剂浓度对重组菌进行诱导表达,确定其最适表达条件为IPTG终浓度为0.5mmol/L、30℃诱导12 h。目的蛋白主要存在包涵体裂解液上清中,表达量占菌体总蛋白的30%以上,过GST Resin柱纯化。经SDS-PAGE分析在Mr 62 000附近有一特异条带,符合目的蛋白理论推算值（Mr约62 700）,扫描分析显示其纯度达95%以上,透析和稀释复性制备正确折叠的融合蛋白。通过流式细胞仪检测肝癌分子表面Fas,CD61的表达,通过体外粘附实验证实RGD-FasL具有靶向性,从而为进一步实验提供了有力基础。MTT比色实验证实,RGD-FasL能抑制小鼠肝癌细胞H22和人肝癌H9101细胞生长,对正常小鼠肝细胞生长没有影响;通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术定量分析技术和末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）方法分析证实RGD-FasL诱导H22和H9101细胞凋亡能力;体内实验显示RGD-FasL融合蛋白能有效抑制鼠源性肝癌的生长。在H22小鼠模型中,当RGD-FasL剂量为200mg/kg时,RGD-FasL的抑瘤率为62.5%,优于相同剂量的FasL的抑瘤率（51.3%）:免疫组化及HE染色组织学观察发现RGD-FasL能选择性作用于肿瘤组织,诱导肿瘤细胞凋亡,而对正常组织及肝组织没有毒副作用。本研究表明:融合蛋白RGD-FasL具有诱导肝癌细胞凋亡,抑制肝癌细胞生长的能力。同时RGD-FasL能够特异性结合肿瘤细胞,具有肿瘤靶向性,有利于发挥FasL的抗肿瘤活性。为深入探讨肝癌的基因治疗提供了新的方法与途径。

王跃红^[8]（2008）在《白细胞介素24抑制人胶质瘤细胞生长及对其化疗敏感性影响的体内外实验研究》文中进行了进一步梳理恶性胶质瘤是一种最常见的中枢神经系统恶性肿瘤,常规治疗的效果均不理想,目前还没有非常有效的治疗方法。近年来,随着分子生物学、分子遗传学的发展,基因治疗的研究发展较快,为恶性胶质瘤的治疗开辟了新的道路。白细胞介素24（interleukin-24,IL-24）是白介素10细胞因子家族中的新成员,最初发现IL-24基因在终末分化的人类黑色素瘤中高度表达,因此也被称为黑色素瘤分化相关因子-7（melanoma differentiation-associated gene-7,mda-7）基因。研究发现IL-24对人多种肿瘤细胞（包括肺癌、前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等）均有选择性抑制作用,因此成为基因治疗的候选基因。此外,IL-24与化疗、放疗相结合的研究亦有报道,比如Nishikawa于2001年首先报道将IL-24基因转染入人非小细胞肺癌的细胞后,可增强此肿瘤细胞对放射治疗的敏感性,而同时接受照射的人正常成纤维细胞则未受此放射线照射的影响。Chada也报道:对于人乳腺癌细胞,IL-24和放疗、化疗相结合后有协同和增效作用。本研究应用载有IL-24基因的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胶质瘤细胞系U251和胶质瘤组织,并与化疗药替尼泊甙进行联合干预研究,观察IL-24基因对胶质瘤细胞在体外和体内的影响以及IL-24与化疗药卫盟联合作用是否相互协同增效,并探讨其可能的作用机制。第一部分Ad5F35-IL24重组腺病毒的构建目的:构建重组腺病毒Ad5F35-IL24。方法:先用HindIII和SalI双酶切ATCC质粒,得到目的条带,然后再用HindIII和SalI双酶切pDC316质粒,得到线性化的载体条带,接着进行片断连接,转化,筛选得到重组的pDC316-IL24质粒。随后用PCR和酶切的方法对重组pDC316-IL24质粒进行鉴定,经过此两者鉴定可能正确的IL-24重组质粒在全自动核酸分析仪上进行序列测定。接着制备感受态细胞,进行转化,随后大量制备质粒DNA;之后用双质粒共转染293细胞,同源重组产生重组腺病毒Ad5F35-IL24,再用PCR方法对其鉴定。然后进行病毒扩增、纯化,再用PCR方法对其鉴定后,按照公式:VP/ml=OD260×1.1×1012进行滴度测定。结果:成功构建成载有IL-24基因的重组pDC316-IL24质粒,并用PCR、酶切、序列测定和BLAST的方法进行了鉴定;获得了携带IL-24基因的大肠杆菌菌株;成功构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,并进行了扩增和纯化,且用PCR的方法进行了鉴定;并按照公式:VP/ml=OD260×1.1×1012测定了病毒的滴度,其滴度为2.8×1011vp/ml。结论:构建成载有IL-24基因的增殖能力缺陷的新型重组腺病毒Ad5F35-IL24,其滴度为2.8×1011vp/ml。第二部分白细胞介素24抑制胶质瘤细胞生长的体内外实验研究目的:观察IL-24基因对在体外和体内胶质瘤细胞的影响,并探讨IL-24基因对胶质瘤的治疗作用及其可能的作用机制。方法:先原代培养人胎脑星形胶质细胞,然后用载有人白细胞介素24cDNA的新型重组腺病毒（Ad5F35-IL24）感染人胎脑星形胶质细胞和人胶质瘤细胞系U251,体外观察Ad5F35-IL24对它们生长的影响;建立人胶质瘤动物模型,瘤内注射Ad5F35-IL24,观察肿瘤生长情况;用流式细胞仪检测细胞和组织的凋亡及其Bax/Bcl-2的表达情况。结果:Ad5F35-IL24感染人胎脑星形胶质细胞、U251细胞和肿瘤组织后IL-24蛋白高表达,人胎脑星形胶质细胞的生长未受到明显抑制（P>0.05）,U251细胞和组织的生长受到明显抑制（P<0.05）,其凋亡率明显升高（P<0.05）,Bax/Bcl-2也明显升高（P<0.05）。结论:白细胞介素24具有选择性抑制人胶质瘤细胞系U251生长和诱导凋亡作用。Ad5F35-IL24转导白细胞介素24基因可能是一种有效的胶质瘤基因治疗途径。第三部分白细胞介素24在体内外抑制胶质瘤细胞生长的机制实验研究目的:探讨IL-24基因抑制胶质瘤细胞生长的可能的作用机制。方法:先用MTT法检测加入2-氨基嘌呤后U251细胞的抑制率,再用流式细胞仪检测加入2-氨基嘌呤后U251细胞的凋亡率和Bax/Bcl-2蛋白的表达情况,接着再用western blot检测加或未加2-氨基嘌呤的U251细胞和各组肿瘤组织中IL-24蛋白、一些信号蛋白如PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、促凋亡蛋白BAX和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达情况。随后用免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织的血管密度和bFGF、VEGF的表达情况。结果:通过Western Blot发现:IL-24对U251的选择性诱导凋亡作用可能是通过上调并激活其PKR蛋白（P<0.01）,随后又激活p38MAPK途径而实现的。接着又通过应用2-AP阻断了PKR蛋白的激活后,其下游p38MAPK的激活和凋亡也被阻断,这进一步证实了其作用机制。通过免疫组化技术,发现IL-24治疗组的微血管生成明显减少（P<0.05）,且其VEGF和bFGF表达也明显减少（P<0.05）。结论:IL-24选择性的抑制U251细胞和胶质瘤生长的机制是通过上调并激活PKR蛋白,随后又激活p38MAPK途径而实现的。IL-24还可抑制胶质瘤微血管生成,进而抑制肿瘤增殖。其机制可能与IL-24诱导胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达的减少有关。第四部分白细胞介素24对胶质瘤细胞化疗敏感性影响的体内外实验研究目的:观察IL-24与化疗药卫盟联合作用是否相互协同增效,并探讨其可能的作用机制。方法:先用MTT法检测IL-24和替尼泊甙联合干预后的U251细胞抑制率,再用Hochest33258法检测其凋亡率,接着用流式细胞仪检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。随后用Western blot分析IL-24和替尼泊甙联合干预后的U251细胞的IL-24、PKR、p-PKR、p38-MAPK、p-p38-MAPK、Bcl-2、BAX蛋白表达水平。还采用TUNEL法测定各组肿瘤组织的凋亡情况,再用流式细胞仪检测其Bcl-2和Bax蛋白的表达情况。接着用免疫组织化学染色检测各组肿瘤组织的血管密度和bFGF、VEGF的表达情况。结果:通过MTT法发现IL-24和替尼泊甙联合干预组U251细胞的抑制率明显增高（P<0.001）,通过Hochest33258法和TUNEL法发现联合干预组U251细胞和肿瘤组织的凋亡率也明显增高（P<0.001）,通过流式细胞技术发现联合干预组U251细胞和肿瘤组织的Bax/Bcl-2升高（P<0.05）,通过Western Blot发现联合治疗组的PKR蛋白的表达和活化以及其下游的靶分子p38MAPK的表达和活化都明显增高（P<0.001）。通过免疫组化技术,发现联合治疗组的微血管生成明显减少（P<0.05）,且其VEGF和bFGF表达也明显减少（P<0.05）。结论:IL-24和替尼泊甙对U251细胞和胶质瘤具有协同杀伤和诱导凋亡的作用,其机制与IL-24诱导凋亡通路有关,还可能与促凋亡蛋白Bax和抗凋亡蛋白Bcl-2的比例的升高有关。此外,联合治疗还可抑制胶质瘤微血管生成,进而抑制肿瘤增殖。其机制可能与IL-24诱导胶质瘤组织中VEGF和bFGF表达的减少有关。实验证明:IL-24和卫盟联合治疗胶质瘤是可取的治疗方案。

王永晨^[9]（2008）在《Fas/FasL、增殖细胞核抗原及细胞凋亡与人恶性黑色素瘤的关系》文中认为恶性黑色素瘤,简称恶黑,是一类起源于神经脊黑色素细胞的恶性肿瘤,常原发于皮肤及粘膜组织,其发生往往比较隐袭,恶性程度高,易发生血管和淋巴结转移、复发率高、发展迅速、预后差、死亡率高。然而关于恶黑的发病机理、侵袭转移及凋亡等机制仍不十分清楚。一直以来,人们致力于从各个角度研究黑色素瘤恶性度高、转移及复发迅速的机制,其中以Fas/FasL系统为切入点的研究日渐深入。肿瘤的发生是个多因素、多阶段的过程,其机制非常复杂。近年来研究证明细胞凋亡异常与细胞增殖之间的失衡是导致肿瘤发生、发展的重要原因,因此增殖细胞核抗原（PCNA）作为一项评估细胞增殖状态的指标在恶黑的发展中起着重要的作用,而在目前的研究中,对于PCNA与恶黑恶性行为及其发生、发展报道并不多见。本研究旨在发现Fas/FasL、sFas和PCNA等相关指标在恶黑中表达、分布与恶黑的恶性行为、发生发展及预后的关系,为恶黑的临床早期发现、早期诊断、早期治疗及预后转归判断提供线索和依据。通过观察Fas、FasL、sFas和PCNA在人恶黑、良性黑色素细胞痣和正常组织中表达及恶黑细胞凋亡情况,结果可见恶黑组织中FasL、sFas、PCNA表达均明显增高（P<0.01）,恶黑细胞凋亡指数低于其他组,说明FasL、sFas、PCNA及肿瘤细胞凋亡指数等指标与恶黑的恶性行为相关。

徐银祥^[10]（2007）在《非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究》文中认为背景与目的恶性肿瘤的发展变化在某种程度上取决于肿瘤与免疫系统之间的相互作用。机体免疫能力下降是肿瘤发生、发展的一个重要原因。因此,增强机体免疫力,促进肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一个重要目标。研究发现细胞凋亡主要有线粒体和死亡受体两条途径。FasL是重要凋亡分子,与死亡受体Fas结合后诱导细胞膜表面Fas分子聚集形成三聚体启动细胞凋亡的信号传递诱导Fas阳性细胞凋亡。Fas广泛表达于体细胞,而FasL在正常情况下仅表达于活化T细胞,以及眼、睾丸、胎盘等特殊组织。Caspase是执行凋亡的主要酶类,Caspase-3是一种特异性半胱氨酸蛋白酶,在Caspase酶系级联反应中发挥重要作用。研究发现恶性肿瘤间质内存在以T淋巴细胞为主的淋巴细胞群体,称之为肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）。TILs通过表达FasL蛋白诱导肿瘤细胞凋亡发挥其杀瘤活性。然而,TILs与非小细胞肺癌均表达FasL,非小细胞肺癌表达FasL和Caspase-3与肿瘤浸润淋巴细胞凋亡之间存在什么关系?肿瘤细胞高表达FasL能否引起宿主TILs凋亡,从而发挥反杀伤作用,逃避宿主免疫监视?肿瘤细胞高表达FasL是否与肿瘤浸润淋巴细胞分泌的细胞因子有关?表达FasL是不是NSCLC在接受来自TILs分泌细胞因子刺激后采取的一种反击宿主免疫系统的措施?相信深入研究非小细胞肺癌FasL、Caspase-3表达与肿瘤微环境中TILs的关系可能具有重要生物学意义。方法本研究采取以下方法:1.将手术切除45例非小细胞肺癌标本及远癌肺组织作为研究对象,应用免疫组织化学方法检测FasL、Caspase-3蛋白表达。2.应用激光微切技术获取非小细胞肺癌周边区和非周边区域肿瘤细胞,共10例,应用RT-PCR技术检测不同区域肿瘤细胞FasL和Caspase-3 mRNA表达。3.应用免疫组织化学技术标记肿瘤浸润淋巴细胞45例,结合应用TUNEL法检测肿瘤浸润淋巴细胞凋亡情况,原位检测非小细胞肺癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡比例。4.筛选出4份HLA-A2+ PBL;A549细胞转染质粒后稳定表达HLA-A2+,表达HLA-A2的PBL成为A549细胞的特异性TILs。HLA-A2+ PBL培养后细胞计数为3×105/ml,共246ml,离心后共获得96ml上清液。分别应用50μl、100μl、150μl、200μl、250μl和500μl肿瘤浸润淋巴细胞上清液与A549细胞共培养30min、60min、120min、180min和240min,设立阴性对照组,应用RT-PCR和Western blot技术分别检测A549细胞在不同时间、不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞上清液共培养时FasL和Caspase-3 mRNA和蛋白表达。5.所得结果采用SPSS 10.0进行相应的统计学分析。结果本课题研究主要结果如下:1.非小细胞肺癌FasL表达检查结果:⑴肺腺癌FasL表达率为73.3%±15.8%,肺鳞状细胞癌FasL表达率为60.4 %±15.8 %,腺癌FasL表达显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化肺癌FasL表达率为60.6 %±15.8 %,低分化肺癌FasL表达率为70.1 %±16.9 %,低分化肺癌FasL表达显着高于中高分化肺癌（p<0.05）;⑶伴淋巴结转移组NSCLC FasL表达阳性率为62.4 %±15.6 %,无淋巴结转移组肺癌FasL表达阳性率为55.8 %±11.9 %,伴淋巴结转移组肺癌FasL表达率显着高于无淋巴结转移组（p<0.05）;⑷本组单纯以肺癌pTNM分期统计分期,各期间统计比较无显着差异,将Ⅰ+Ⅱ期、ⅢA+ⅢB期分别合并后再进行统计分析,前者FasL表达阳性率为62.4%±15.6 %,而后者FasL表达阳性率为72.8 %±18.0 %,ⅢA+ⅢB期非小细胞肺癌FasL阳性率显着高于Ⅰ+Ⅱ期非小细胞肺癌FasL表达阳性率（p<0.05）。⑸NSCLC周边区FasL表达阳性率为74.4 %±18.4 %,而肿瘤非周边区FasL表达率为64.4 %±13.1 %,肿瘤周边区FasL表达显着高于非周边区FasL表达（ p<0.05 ）。2. NSCLC不同部位FasL、Caspase-3 mRNA表达检测结果:⑴NSCLC周边区FasL mRNA表达强度为0.926 + 0.41;肿瘤非周边区FasL mRNA表达强度为0.892 + 0.26。两组间存在显着差异,（P<0.05 ）。⑵肿瘤周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.912 + 0.07;肿瘤团非周边区Caspase-3 mRNA表达强度为0.923 + 0.04。两组间无显着统计学差异,（P>0.05 ）。3.非小细胞肺癌Caspase-3蛋白表达检测结果:⑴肺鳞状细胞癌Caspase-3蛋白平均阳性表达率为76.9 %,腺癌Caspase-3阳性表达率为47.4 %,鳞癌Caspase-3表达水平显着高于腺癌（p<0.05）;⑵中高分化NSCLC Caspase-3阳性表达率为70.0%,低分化非小细胞肺癌Caspase-3阳性表达率为64.0%,中高分化非小细胞肺癌与低分化NSCLC Caspase-3表达无显着差异（p>0.05）;⑶Caspase-3蛋白表达与N分期有关,无淋巴结转移组Caspase-3阳性表达率为81.8%,淋巴结转移NSCLC组Caspase-3阳性率为61.8%,无淋巴结转移组Caspase-3表达水平显着高于淋巴结转移组NSCLC（p<0.05）;⑷比较肺癌周边区与非周边区Caspase-3蛋白表达无显着差异（p>0.05）。4. NSCLC肿瘤浸润淋巴细胞凋亡检测结果:⑴肺腺癌组织肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为5.51±1.56,肺鳞状细胞癌肿瘤浸润淋巴细胞凋亡指数为4.11±2.03,腺癌组织TILs凋亡指数显着高于鳞状细胞癌（p<0.01）;⑵中高分化非小细胞肺癌组织中TILs凋亡指数为3.84±1.71,低分化非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数为5.38±1.90,低分化肺癌TILs凋亡指数显着高于中高分化NSCLC （p<0.01）;⑶不同pTNM非小细胞肺癌组织TILs凋亡指数统计比较无显着差异（ P >0.05）;⑷TIL凋亡指数随NSCLC FasL表达强度增强而增加,与其表达强度呈显着正相关（r = 0.707, p<0.01）。5.肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养后FasL和Caspase-3 mRNA及蛋白检测结果:⑴将TILs上清液250μl与A549细胞共培养60min时,FasL mRNA表达水平显着高于对照组（p<0.05）;⑵将TILs上清液200μl和250μl分别与A549细胞共培养90min时,FasL mRNA表达水平均显着高于对照组（ p<0.05 ）,两组间无显着差异（p>0.05）;⑶其他不同剂量TILs上清液与A549细胞共培养时肿瘤细胞FasL mRNA表达水平无显着变化（p>0.05）;⑷不同剂量肿瘤浸润淋巴细胞培养上清液与A549细胞共培养时各组FasL蛋白表达与对照组比较均无显着差异（p>0.05）;⑸各组A549细胞Caspase-3 mRNA和蛋白表达水平与对照组比较均无显着差异（p>0.05）。结论本研究得出如下结论:1. FasL蛋白在NSCLC中特异性高表达,而且与NSCLC生物学特点有关,FasL高表达可能是肺腺癌容易早期转移、预后较差的原因之一。2. FasL蛋白在NSCLC肿瘤组织呈不均匀分布,肿瘤细胞周边区FasL蛋白及FasL mRNA表达高于非周边区域。推测肿瘤团外部微环境因素可能影响肿瘤细胞FasL表达。NSCLC周边区细胞可能首先接受来自机体肿瘤浸润淋巴细胞分泌的淋巴因子,或其他体液因子刺激,上调FasL表达,对进入肿瘤团块的肿瘤浸润淋巴细胞实施反制措施,杀伤机体免疫细胞,进而在与机体免疫系统的杀伤与反杀伤战斗中争取生存空间,并进一步生长和发展。3.非小细胞肺癌FasL表达与TILs凋亡率存在密切关系,FasL蛋白表达水平越高,肿瘤浸润淋巴细胞凋亡率越高。高表达FasL蛋白可能意味着该组类型肺癌更容易应用FasL蛋白反杀伤机体肿瘤浸润淋巴细胞及免疫系统。4.肿瘤细胞与TIL上清液共培养时FasL表达上调,提示肿瘤细胞接受来自TIL分泌的某种细胞因子影响或调控。肿瘤细胞在加入TIL上清液6090min后上调FasL表达,反应较快,但在更长时间的共培养观察中未发现FasL高表达,并且,更大剂量TIL上清液加入肿瘤培养液中反而未发现FasL表达上调现象,其机制不明。参与细胞凋亡因素很多,调控机制复杂,TIL分泌细胞因子参与肿瘤细胞FasL表达尚需要进一步深入研究。

二、基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究（论文提纲范文）

（1）木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究（论文提纲范文）

（2）印迹基因TSSC3对骨肉瘤生物学特性的影响及其机制研究（论文提纲范文）

（3）丹参酮IIA对自杀基因旁观者效应增效作用及机制研究（论文提纲范文）

（4）抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用（论文提纲范文）

（5）腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究（论文提纲范文）

（6）姜黄素对tk/GCV自杀基因系统旁观者效应的增效作用及机制（论文提纲范文）

（7）RGD-FasL的基因构建、表达、纯化及功能分析（论文提纲范文）

（8）白细胞介素24抑制人胶质瘤细胞生长及对其化疗敏感性影响的体内外实验研究（论文提纲范文）

（9）Fas/FasL、增殖细胞核抗原及细胞凋亡与人恶性黑色素瘤的关系（论文提纲范文）

（10）非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究（论文提纲范文）

四、基因转移FasL诱导人黑色素瘤细胞凋亡的体外研究（论文参考文献）

• [1]木犀草素、芹菜素及槲皮素对黑色素瘤自杀基因治疗的增效研究[D]. 黄暨生. 广州中医药大学, 2016(11)
• [2]印迹基因TSSC3对骨肉瘤生物学特性的影响及其机制研究[D]. 戴欢子. 第三军医大学, 2012(12)
• [3]丹参酮IIA对自杀基因旁观者效应增效作用及机制研究[D]. 周静. 广州中医药大学, 2010(10)
• [4]抗肿瘤双特异免疫导向治疗制剂CAtin的表达及其体内外抑瘤作用[D]. 徐晓红. 吉林大学, 2010(09)
• [5]腺病毒介导IL-24基因对U251胶质瘤细胞的杀伤作用及相关机制研究[D]. 韩硕. 河北医科大学, 2009(10)
• [6]姜黄素对tk/GCV自杀基因系统旁观者效应的增效作用及机制[D]. 郭晶. 广州中医药大学, 2009(11)
• [7]RGD-FasL的基因构建、表达、纯化及功能分析[D]. 王娟. 厦门大学, 2008(08)
• [8]白细胞介素24抑制人胶质瘤细胞生长及对其化疗敏感性影响的体内外实验研究[D]. 王跃红. 河北医科大学, 2008(12)
• [9]Fas/FasL、增殖细胞核抗原及细胞凋亡与人恶性黑色素瘤的关系[D]. 王永晨. 吉林大学, 2008(11)
• [10]非小细胞肺癌FasL和Caspase-3表达与肿瘤浸润淋巴细胞关系研究[D]. 徐银祥. 第三军医大学, 2007(03)

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