一、东方田鼠乳酸脱氢酶同工酶的研究（论文文献综述）
高诚[1]（2021）在《《实验动物与比较医学》创刊40年重要文献回顾》文中进行了进一步梳理岁月荏苒,白驹过隙。2021年是《实验动物与比较医学》创刊40周年。作为我国第一本实验动物科学专业杂志,本刊自创刊以来,一直受到业内专家们的关注和呵护,每有重大事件或逢重要时段,皆有前辈们撰文寄语[1-10]。《实验动物与比较医学》杂志创刊于改革开放初期的1981年,当时以《上海畜牧兽医通讯·上海实验动物科学专辑》的形式内部发行;1983年12月经上海市科委批准,从1984年第1期起更名为《上海实验动物科学》,并独立内部发行;
安晓梦[2]（2020）在《田鼠巴贝斯虫丙酮酸激酶抑制剂的筛选》文中进行了进一步梳理田鼠巴贝斯虫是顶复门孢子虫纲梨形虫目的一种寄生于宿主红细胞内的血液原虫,主要经过硬蜱叮咬、输血或血液制品途径感染人或者啮齿类动物,极少数情况下是通过胎盘经母婴传播。具有免疫功能的个体通常无明显临床症状,但由于B细胞淋巴瘤、器官移植、HIV/AIDS或使用免疫抑制药物治疗而引起的免疫缺陷和免疫力低下的人群会增加患田鼠巴贝斯虫病的风险,严重时会导致多器官衰竭甚至死亡。目前在临床上主要采用阿托伐醌和阿奇霉素联合用药,但由于田鼠巴贝斯虫耐药性高,容易导致失败,且复发率高。糖酵解途径是顶复门原虫能量代谢的主要方式,在红细胞生命周期内田鼠巴贝斯虫高度消耗葡萄糖获取能量,且田鼠巴贝斯虫主要依靠无氧糖代谢产生ATP和乳酸,那么丙酮酸的获取至关重要,因此丙酮酸激酶（Py K）是田鼠巴贝斯虫能量获取的关键糖酵解酶,其有望成为一个药物靶标阻断丙酮酸的产生从而限制虫体的能量供应,抑制虫体增殖。本研究以田鼠巴贝斯虫Py K为基础,探索Py K催化活性及筛选其特异性抑制剂。具体如下:以田鼠巴贝斯虫c DNA和g DNA为模板,扩增到全长分别为1470 bp、1977bp的Py KⅠ、Py KⅡ目的片段,构建含GST标签的p GEX-6p-1-Py KⅠ与p GEX-6p-1-Py KⅡ原核表达载体,转化至大肠杆菌BL21后进行重组表达,从上清得到了纯化后的Py KⅠ与Py KⅡ蛋白。随后分别进行了鼠源和兔源多抗的制备,通过Western blot试验表明Py KⅠ与Py KⅡ免疫原性良好,虫体天然蛋白大小分别约为80 k Da和100 k Da。由于Py KⅡ重组蛋白难以提纯等原因,只对Py KⅠ重组蛋白进行GST标签的切除,探究其催化活性。通过变动PH值、Mg2+、K+以及底物浓度获得Py KⅠ的米氏常数KM、Kcat和Vmax等酶动力学参数,并确定了酶催化反应的最佳条件即3 m M PEP,1 m M ADP,PH=7.0的缓冲液。抑制剂筛选试验过程中,通过LDH酶偶联法筛选了13种药物,其中有6种药物对重组蛋白Py KⅠ酶活性产生抑制作用,分别为单宁酸、紫草素、芹菜素、PKM2 inhibitor、罗格列酮和吡格列酮。利用丙酮酸激酶活性检测试剂盒重复13种药物对Py KⅠ酶活性的影响,其结果基本与之前一致。体外培养实验筛选出单宁酸、紫草素、芹菜素、PYK-M2 inhibitor这四种药物均在微摩尔浓度内对田鼠巴贝斯虫生长有明显抑制效果,其中单宁酸细胞毒性相比较低。且在单宁酸体外抑制试验中,丙酮酸产物的回补能使药物组的染虫率得到部分恢复。综上所述,本研究分别对Py KⅠ和Py KⅡ基因进行了克隆,并探究了Py KⅠ的催化活性,通过酶活动力学试验和体外培养试验成功筛选出单宁酸、紫草素、芹菜素、PKM2 inhibitor这四种药物对Py KⅠ催化活性和田鼠巴贝斯虫体外生长的抑制效果。其研究结果将为设计和开发新的抗巴贝斯虫的药物提供理论基础,并对其他顶复门原虫糖代谢途径的研究具有一定的参考作用。
喻龙[3]（2019）在《巴贝斯虫乳酸脱氢酶晶体结构解析及催化分子机制研究》文中研究指明巴贝斯虫病是由顶复门孢子虫纲梨形虫目的100多种巴贝斯虫引起的,目前已报道能感染人的巴贝斯虫主要有B.microti、B.crassa、B.sp.MOI、B.divergens、B.duncani和B.venatorum六种,其中B.microti最为常见。人的巴贝斯虫病常伴有高寄生虫血症,严重时会导致人死亡,该病无商业化疫苗,亦无可治愈药物,临床上常用阿奇霉素和阿托伐醌联合用药,但失败率高并伴随严重的不良反应。全基因组信息表明巴贝斯虫缺乏传统的三羧酸循环（TCA cycle）,主要依靠无氧糖代谢产生ATP,因此乳酸脱氢酶（LDH）是该类寄生虫能量供应的关键糖酵解酶,有望成为一个药物靶标阻断虫体的能量供应,从而抑制寄生虫的红细胞内增殖。本研究以田鼠巴贝斯虫和东方巴贝斯虫LDH为研究对象,通过解析其蛋白晶体结构,探讨其LDH催化功能域及关键活性位点,并阐明其催化反应的分子机制及关键功能开关位点,主要结果如下:（1）巴贝斯虫LDH生物学功能鉴定。通过体外培养实验证实棉酚和草氨酸盐均在微摩尔范围对B.microti有明显抑制作用,小鼠体内实验进一步证实棉酚在体内也能抑制虫体生长。以B.microti和B.orientalis的c DNA为模板,克隆到全长999 bp的Bm LDH和Bo LDH开发阅读框,并将其分别插入p ET-28a表达载体,重组质粒转化进入大肠杆菌BL21进行重组蛋白表达。纯化后的两个重组蛋白经分子筛层析过滤,其出峰时间约60 min,以四聚体形式存在。重组LDH蛋白免疫原性好,能够区分巴贝斯虫感染的阳性血清和未感染的阴性血清,虫体天然LDH蛋白约为37 k Da,主要定位在虫体胞质中。最后,通过变动的底物或辅因子浓度获得了Bm LDH的米氏常数KM、Kcat、和Vmax等酶动力学参数,并确定棉酚和草氨酸盐对Bm LDH的抑制常数Ki值分别为0.67μM和65.92μM。（2）LDH晶体结构解析。纯化后的r Bm LDH和r Bo LDH经分子筛层析过滤,纯度可达98%,浓缩后用于结晶条件初筛。经结晶条件优化,Bm LDH单晶、Bo LDH单晶及Bm LDH与NADH和草氨酸盐三联共晶晶体均达到X-ray衍射质量标准,通过X-ray衍射收集到三种晶体的结构数据,并应用分子置换法解析其晶体结构。晶体分辨分别为2.79?（Bm LDH单晶）、2.69?（Bo LDH单晶）和1.89?（Bm LDH共结晶）,与人和疟原虫LDH结构比较结构显示Bm LDH和Bo LDH整体结构与人LDH和疟原虫LDH有着高度的保守性。此外,根据晶体结构推测出巴贝斯虫LDH催化反应的分子机制模型。（3）LDH催化活性开关鉴定及验证。以Bm LDH三联共结晶晶体为基础,寻找到十个Bm LDH催化中心与NADH相互作用的氨基酸残基,并对其中七个氨基酸残基进行了点突变研究。体外酶活实验显示G97A、R99A和N138A突变均能显着降低Bm LDH催化活性,其降低程度达86%以上。本研究进一步探索了Bm LDH与人LDH-A催化关键位点的差异,其结果显示突变人LDH-A中这三个氨基酸残基并检测其催化活性证实G97A和N138A突变能够显着降低人LDH-A的催化活性,而R99A突变对人LDH-A的催化活性无影响。Bm LDHR99A突变体共结晶、SPR和ITC实验结果表明R99A突变未造成Bm LDH整体结构的改变,也未影响Bm LDH对NADH的亲和力,但突变影响了Bm LDH催化口袋的正常关闭。（4）分子对接和虚拟筛选。以Bm LDH晶体结构为基础,从15万个小分子化合库中筛选到13种高评分化合物,并对三种棉酚衍生物（NDCA、DBHCA和DHNA）进行活性测试,结果显示化合物DBHCA和DHNA均在微摩尔浓度内抑制Bm LDH催化活性和虫体体外生长,其中化合物DHNA对Vero细胞毒性较低（SI>25）。此外,应用SPR实验进一步测定了这二种化合物结合Bm LDH的药物动力学曲线。综上所述,本研究通过体外培养证实了棉酚和草氨酸盐均在微摩尔范围内抑制B.microti生长,且棉酚还展现出体内抑制活性。分别对B.microti和B.orientalis LDH基因进行了克隆表达及虫体定位分析,并通过酶动力学曲线和酶抑制动力学曲线证实了棉酚和草氨酸盐均以Bm LDH为作用靶点。解析了Bm LDH单晶、Bo LDH单晶及Bm LDH与NADH和草氨酸盐三联共结晶晶体,揭示了Bm LDH催化反应机制及关键酶活催化残基的差异。通过分子对接和虚拟筛选得到一系列潜在的LDH抑制剂,并评估了二种抑制剂对Bm LDH催化活性及虫体体外生长的抑制效果。这些结果将对下一步设计和筛选新型的抗巴贝斯虫的药物奠定基础,同时也为其他顶复原虫的糖代谢途径的研究具有一定的指导作用。
江新杰,杨春文,金建丽,金志民,王瑞琪[4]（2016）在《东方田鼠不同器官组织同工酶研究》文中指出为了对东方田鼠的深入研究及鼠害防治提供基础的生理生化指标依据,试验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的方法对东北林区东方田鼠的心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌、脑、睾丸6种器官组织中的乳酸脱氢酶（LDH）、超氧化物歧化酶（SOD）同工酶进行分离、分析。结果表明:东方田鼠心脏、肾脏、骨骼肌、脑、睾丸5种器官组织中均有LDH1LDH5的5条谱带出现,而在肝脏中只出现1条谱带为LDH5,在心脏、肾脏、骨骼肌、睾丸4种器官组织中均有亚带出现,6种器官组织中的LDH同工酶活性不同;在东方田鼠心脏、肝脏、肾脏、骨骼肌、脑、睾丸6种器官组织中的SOD同工酶中共分离出SOD1SOD18的18条谱带,其中SOD4、SOD9、SOD14、SOD154条谱带为6种器官组织中共有谱带,且SOD15谱带在6种器官组织中活性最强。2种同工酶在6种器官组织中的谱带分布及酶活性存在明显的组织特异性。
汤敏,倪丽菊,高骏,肖君华,胡建华,高诚[5]（2012）在《东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选》文中指出目的从东方田鼠的部分BAC文库中筛选微卫星。方法应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记。结果以地高辛标记的寡聚核苷酸（CA）20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。结论成功且高效地从阳性BAC克隆中筛选出微卫星序列,这些微卫星和阳性BAC克隆可用于后续的定位研究。
姜宪环[6]（2012）在《东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析》文中提出东方田鼠（Microtus fortis）属啮齿目、仓鼠科、田鼠亚科、田鼠属,主要分布在我国,以及和我国接壤的俄罗斯、朝鲜、蒙古等某些地区。20世纪70年代以来,东方田鼠在洞庭湖区暴发成灾,不仅对当地的农林业造成巨大的损失,在迁移时还经常引发钩端螺旋体、流行性出血热等病疫。同时,东方田鼠还是重要的实验动物资源,我国学者现已利用东方田鼠构建出抗血吸虫病、糖尿病和卵巢癌等多种模型。对东方田鼠的生态防控以及作为实验动物的资源利用,都需要对其种群遗传结构进行先行研究。线粒体DNA和Y染色体序列是研究物种母系和父系遗传进化史的有效工具。田鼠属包含60多个物种,进化速度非常快,是研究系统进化的好材料。近年来,研究者们根据mtDNA序列研究田鼠系统进化关系,并已测出田鼠属Microtus kikuchii和Microtus levis的mtDNA基因组全序列。父系遗传结构仅在人类群体遗传学研究中被广泛应用,而在其他哺乳动物中研究很少。本课题采用长片段PCR（LA-PCR）和PCR引物步移测序等方法,首次测得了东方田鼠长江亚种（Microtus fortis calamorum）线粒体基因组全序列和Y染色体序列,主要结果如下：1.东方田鼠长江亚种线粒体基因组为双链环状分子,序列总长为16310bp, GenBank登录号为JF261175；包含了与其他脊椎动物一致的37个基因（13个蛋白质编码基因、2个rRNA基因、22个tRNA基因）和1个控制区（CR）。其基因组组成有很强的AT偏向性,全线粒体序列H-链的碱基百分含量为：A%（32.6）>C%（27.7）>T%（26.2）> G%（13.4）, A+T%（58.8）>G+C%（41.1）。2.东方田鼠长江亚种mtDNA的13个蛋白质编码基因最常用的起始密码子是ATG （COX1、COX2、ATP8、ATP6、COX3、ND4L、ND4、ND6、Cytb基因）,其次是ATT（ND3和ND5）。ND1和ND2基因比较特殊,起始密码子分别是GTG和ATA。COX1, COX2, ATPase8, ATPase6, ND3, ND4L, ND5和Cytb基因的终止密码子是TAA; ND2和ND6基因的终止密码子是TAG；另外,COX3和ND4以不完整的T作为终止密码子。3.东方田鼠长江亚种mtDNA的22个tRNA基因中,有21个可以折叠成标准的三叶草二级结构；tRNAser（AGY）仅有59bp,二级结构缺少DHU环,这种tRNA结构在其他啮齿类动物中也很常见。4.东方田鼠长江亚种mtDNA控制区的结构包括三个部分：两个终止序列区（ETAS-1和ETAS-2）、中央保守区（Central Domain）和保守序列区（CSB-1）。但与已报道的两个田鼠种一样均没有发现CSB-2和CSB-3。5.东方田鼠长江亚种mtDNA的L-链复制起始区（OL）长度为35bp,可以形成茎环结构,与Microtus kikuchii和Microtus levis比较发现,其长茎以及相邻的序列十分保守。这3种田鼠的长茎相邻的保守序列为5’-TAAGG-3’,而其他哺乳动物为5’-GCCGG-3’。6.16种啮齿类动物线粒体DNA H-链的12个蛋白编码基因序列ML法和Bayesian法系统进化树表明,东方田鼠属于田鼠属的亚洲谱系。田鼠属5个种（18条序列）线粒体DNA Cytb基因序列的ML法系统进化树表明,东方田鼠与Microtus. middendorfii组成姐妹群。7.首次测得了东方田鼠长江亚种和指名亚种Y染色体上的7300bp序列,比对这两个亚种的序列后发现4个SNPs位点。本论文测出了东方田鼠线粒体基因组全序列和Y染色体上部分序列,这将为我国东方田鼠的母系和父系遗传结构研究打下坚实基础；此外,提出了一种新的获得Y染色体序列的策略。
汤敏[7]（2012）在《东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选》文中指出本文就是应用非放射性的菌落杂交方法和磁珠富集法从东方田鼠的BAC文库中筛选高质量的微卫星标记以用于后续的定位研究。首先,以地高辛标记的寡聚核苷酸（CA）20为探针,通过菌落杂交法从136个东方田鼠BAC克隆中筛选出杂交信号最强的20个阳性克隆。再将这20个阳性克隆分别通过链霉亲和素磁珠法构建亚克隆文库,从中选取400个经PCR鉴定为阳性的亚克隆进一步测序分析,共得到220个微卫星序列,阳性率55%。选取重复次数高,侧翼序列完整的微卫星序列设计74对引物,共有35对引物能扩增出清晰的条带,其中16对引物具有多态性。
洪炀[8]（2011）在《日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究》文中研究指明血吸虫病（Schistosomiasis）是由血吸虫（Schistosome）感染引起的一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。全球有74个国家和地区流行血吸虫病,有5-6亿人受到威胁,约2亿人感染血吸虫病。当前血吸虫的防治策略主要以化疗药吡喹酮来进行治疗,从而减少发病率。但是吡喹酮又不能避免重复感染,而且近年来曼氏血吸虫已经有吡喹酮抗性虫株的报道,耐药虫株的出现引起了人们的不安与高度关注。因此,加强抗血吸虫疫苗的开发和新药物靶标的筛选显得格外重要。在我国,日本血吸虫（Schistosoma japonicum）可以感染40多种哺乳动物,山羊、黄牛、绵羊、兔子和小鼠等都是其易感宿主,但是另外一些哺乳动物如大鼠等是日本血吸虫的不易感宿主。在不易感宿主体内,血吸虫的发育率低而且虫体较小。东方田鼠是目前为止唯一一种对日本血吸虫具有抗性的宿主,日本血吸虫尾蚴可以感染东方田鼠,感染之后虫体发育迟缓,在感染尾蚴15天后,东方田鼠体内基本上找不到存活的虫体,感染42天后,东方田鼠体内检查不到日本血吸虫成虫。不同的宿主能够为日本血吸虫提供不同的生存环境,影响到虫体的生存和发育。不同宿主环境中生长的虫体在蛋白表达上也会存在差异,而这些差异表达的蛋白可能是虫体生存发育所需要的关键分子。因此找到在不同易感性宿主环境中日本血吸虫生长发育差异的蛋白具有重要理论和实际意义。1、日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究本文应用荧光差异凝胶双向电泳技术（2D-DIGE）,对BALB/c小鼠、Wistar大鼠和东方田鼠体内的10d日本血吸虫童虫的蛋白表达情况进行了分析,通过DeCyder 6.5软件分析和匹配后,得到了1721个点适合进行后续的差异分析。在大鼠体内10d童虫蛋白和小鼠体内10d童虫蛋白的比较分析中发现,有39个蛋白点存在显着性差异,其中有27个蛋白点在小鼠体内1Od童虫中高表达,12个蛋白点低表达。在小鼠体内lOd童虫蛋白和东方田鼠体内10d童虫蛋白的比较分析中发现,有21个蛋白点存在显着性差异,其中有13个蛋白点在小鼠体内10d童虫中高表达,8个蛋白点低表达。将分析胶与制备胶进行比对挑点,最终共有44个差异表达蛋白能够进行后续的质谱分析。将质谱鉴定出的数据进行搜库比对,其中3个蛋白点没有注释信息,其余41个蛋白点经过序列比对与去重复分析后发现,共代表了33种蛋白。为了验证2D-DIGE实验分析的可靠性,我们挑取了其中6个差异表达蛋白进行了实时定量分析,在基因水平上对其结果进行验证,验证结果显示,实时定量的结果与2D-DIGE的结果基本一致。我们对差异表达蛋白进行了GO分类以及KEGG通路分析,结果显示,在小鼠体内10d童虫和大鼠体内10d童虫的差异表达蛋白中,40%的差异蛋白在蛋白代谢途径中,26%的差异蛋白在糖类代谢途径中,13%的差异蛋白在RNA代谢途径中,9%的差异蛋白与应激反应有关,其余的差异表达蛋白与蛋白转运、调节基因表达和细胞骨架蛋白有关。在小鼠体内10d童虫和东方田鼠体内10d童虫的差异表达蛋白中,53%的差异蛋白在蛋白代谢途径中,23%的差异蛋白在RNA代谢途径中,其余的差异表达蛋白与糖类代谢途径、核酸代谢途径和细胞骨架蛋白有关。其中线粒体外膜转移酶复合物TOM34、蛋白酶体亚基、核内核糖体异构蛋白K和肌动蛋白在易感宿主小鼠体内高表达,而半胱氨酸蛋白酶抑制剂、醛缩酶和70kDa热激蛋白在不易感宿主大鼠体内或抗性宿主东方田鼠体内高表达。本文首次对不同宿主体内的日本血吸虫10d童虫进行了蛋白质组分析,为我们更好的理解血吸虫的生长发育机制提供了依据,同时也可为抗血吸虫疫苗和潜在药物靶标的研究提供基础。2、日本血吸虫蛋白酶体α5和α2亚基基因的克隆、表达及免疫效果观察本文利用RT-PCR技术从日本血吸虫18d童虫中首次扩增到蛋白酶体a5亚基基因（GenBank accession FJ595238）。序列分析表明蛋白酶体α5亚基基因的ORF含747bp,编码248个氨基酸,理论分子量27.38 kDa。同源性分析结果显示,该基因分别为日本血吸虫蛋白酶体α5亚基,命名为SjPSMA5。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在7 d、13 d、18 d、23 d、32 d和42 d虫体中都有表达,13d和32d虫体中的表达量高于其他时期；在小鼠体内的10d童虫中的表达量要高于大鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a（+）-SjPSMA5,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白rSjPSMA5以包涵体形式存在。Western印迹显示表达的重组蛋白rSjPSMA5能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。免疫组化实验结果表明,SjPSMA5蛋白在虫体各组织器官内广泛分布。应用重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,产生了较高的特异性抗体水平,并且CD4+细胞数量显着升高,诱导了23.29%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率本文利用RT-PCR技术从日本血吸虫18d童虫中扩增到蛋白酶体α2亚基基因（GenBank accession AY813725）。序列分析表明蛋白酶体α2亚基基因的ORF含708bp,编码235个氨基酸,理论分子量25.84 kDa。同源性分析结果显示,该基因为日本血吸虫蛋白酶体α2亚基,命名为SjPSMA2。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在7d、13d、18d、23d、32d和42d虫体中都有表达,7d和23d虫体表达量低于其他几个时期；在小鼠体内的10d童虫中的表达量要略高于大鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a（+）-SjPSMA2,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白rSjPSMA2以包涵体形式存在。Western印迹显示表达的重组蛋白rSjPSMA2能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别,并且能检测到天然状态下该蛋白的存在。免疫组化实验结果表明,SjPSMA2蛋白在虫体各组织器官内广泛分布。应用该重组蛋白免疫BALB/c小鼠后,产生了较高的特异性抗体水平,诱导了12.33%的减虫率和35.23%的肝脏减卵率。综上所述,SjPSMA5和SjPSMA2都可作为潜在的抗血吸虫病的疫苗候选分子,SjPSMA5和SjPSMA2基因及表达产物的获得,为探索蛋白酶体在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。3、日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶的特性研究根据GenBank上公布的日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶（thioredoxin peroxidase, TPx）基因的登陆号AY813893,对其序列进行分析,结果表明,该基因的ORF含681bp,编码227个氨基酸,理论分子量25.09 kDa。信号肽预测显示,该基因的前24个氨基酸为信号肽序列。设计去除信号肽序列的引物,利用RT-PCR技术从日本血吸虫42 d童虫中扩增到约600bp的产物。测序结果表明,扩增片断为日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶去除信号肽后的ORF序列。实时定量PCR对该基因在虫体不同发育阶段和不同宿主体内10d童虫中的表达情况进行了分析,结果显示,该基因在虫卵、尾蚴、7d、13d、21d、28d、35d和42d虫体中都有表达,7d、13d和42 d雌虫中表达量高于其他几个时期；在大鼠体内的10d童虫中的表达量要高于小鼠和东方田鼠体内的10d童虫中的表达量。构建了该基因的原核表达质粒pET28a（+）-SjTPx,在大肠杆菌系统中成功获得了表达,重组蛋白以可溶性和包涵体两种形式存在,Western印迹显示表达产物能被日本血吸虫成虫粗抗原免疫血清所识别。免疫组化实验结果表明,SjTPx蛋白主要分布于虫体皮下实质组织,体内其他部分也有分布。质谱鉴定的结果说明,纯化的重组SjTPx蛋白在体外可以以二聚体形式存在。酶活实验的结果说明,SjTPx在体外具有过氧化物酶活性。SjTPx基因及其表达产物的获得,为探索硫氧还蛋白过氧化物酶在血吸虫生长发育中的作用提供了重要基础。
胡媛,袁忠英,沈玉娟,朱小华,刘述先,曹建平[9]（2010）在《日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆》文中研究表明目的比较日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的差异。方法提取东方田鼠、SD大鼠、C57BL/6小鼠和KM鼠肝脏DNA,根据东方田鼠特异性DNA序列片段（GenBank登录号:AF277394）设计引物,PCR方法扩增以上4种鼠的基因组特异性DNA,琼脂糖凝胶电泳鉴定特异条带,纯化后的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体,进行DNA序列分析。结果 PCR扩增东方田鼠、SD大鼠DNA分别得到520bp左右的特异扩增片段,同源性为99%。C57BL/6小鼠和KM鼠没有扩增出此特异片段。结论日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠之间特异性DNA序列有高度的同源性。
彭金彪[10]（2010）在《不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究》文中认为血吸虫病是一种分布广泛、危害严重的人畜共患寄生虫病。已报道在我国流行的日本血吸虫中国大陆株可感染40余种哺乳动物,日本血吸虫对不同宿主有着不同的感受性,如在小鼠等易感宿主体内血吸虫的发育率达60-70%,在大鼠等非易感宿主体内的发育率为10-20%,而血吸虫感染东方田鼠后,大部分虫体在感染后2周死亡,不能发育成熟。东方田鼠是至今发现的唯一一种感染血吸虫后不致病的哺乳动物,查明其抗血吸虫病机理具有重要的理论和实际意义。此前该领域相关研究多限于形态观察、感染、致病和免疫现象等,研究亟待深入发展。为此,本研究以实验室感染的来源于易感宿主BALB/c小鼠,非易感宿主Wistar大鼠及不致病宿主东方田鼠的日本血吸虫10d童虫为研究对象,应用日本血吸虫寡核苷酸芯片技术比较、分析三种不同宿主来源的日本血吸虫基因表达方面的差异。并对东方田鼠来源虫体呈低表达的凋亡抑制基因Sj IAP和呈高表达的凋亡相关基因caspase3和caspase 7;在小鼠来源虫体呈高表达的生长发育、信号传导相关基因Sj MAP 2、Sj mago nashi、Sj Cyclophilin A、Cyclophilin B和Cyclophilin C等进行克隆、表达,及生物学功能初步分析,旨在揭示在不同宿主环境中,日本血吸虫生长发育差异的分子基础。研究结果对阐明血吸虫生长发育机制、与宿主相互作用机理,发现血吸虫生长发育相关的重要分子,也可为研制血吸虫病疫苗、新治疗药物和对血吸虫病防治提供新思路和新途径。1、不同宿主来源日本血吸虫10d童虫形态观察及体细胞凋亡分析实验室中以日本血吸虫尾蚴感染小鼠、大鼠和东方田鼠,10d后收集虫体。光镜下观察到不同来源日本血吸虫形态大小有很大差异,东方田鼠来源童虫长402.2±102.2μm,宽159.1±47.3μm,大鼠来源童虫长828.3±127.4μm,宽103.4±22.8μm,小鼠来源童虫长878.5±137.4μm,宽88.3±20.0μm。扫描电镜下观察,东方田鼠来源童虫虫体萎缩,口吸盘形成空泡,表面结构消失,腹吸盘表面结构改变,体表正常棘消失,萎缩,形成空泡;小鼠和大鼠来源虫体体表棘等结构无异常变化。透射电镜观察发现,东方田鼠来源童虫虫体细胞结构受到破坏,细胞崩解,细胞核仁消失,染色质凝集,有细胞凋亡的表现。小鼠和大鼠来源虫体细胞形态正常,细胞核和线粒体无明显变化。利用Annexin V-FITC/propidium iodide （PI）分析不同宿主来源虫体细胞凋亡状况表明,小鼠来源虫体的凋亡细胞比例为0.40%;大鼠来源虫体的凋亡细胞比例为5.22%;东方田鼠来源虫体的凋亡细胞比例为62.91%,表明东方田鼠来源虫体的细胞发生了明显凋亡。本研究首次利用扫描电镜和透射电镜技术,进行东方田鼠、大鼠和小鼠来源日本血吸虫童虫显微和超微结构的观察和比较,利用流式细胞仪检测发现日本血吸虫在不同宿主体内的生长发育状况与体细胞凋亡相关。2、不同宿主来源日本血吸虫童虫基因表达的芯片分析应用寡核苷酸芯片技术,比较分析小鼠、大鼠和东方田鼠来源的日本血吸虫10d童虫的基因表达差异。结果表明,与小鼠来源童虫相比,东方田鼠来源童虫有3293个基因呈下调表达（fold<0.5）,71个基因呈上调表达（fold>2）;大鼠来源童虫有3335个基因呈下调表达（fold<0.5）,133个基因呈上调表达（fold>2）。其中,东方田鼠来源童虫显着性下调表达基因81个（fold<0.2）,显着性上调表达基因18个（fold>5）;大鼠来源童虫显着性下调表达基因210个（fold<0.2）,显着性上调表达基因54个（fold>5）。东方田鼠和大鼠来源童虫具有相似表达趋势的显着性下调表达基因有27个（fold<0.2）,显着性上调表达基因有7个（fold>5）。对显着性差异表达基因进行GO分类和KEGG通路等生物信息分析,结果显示,东方田鼠来源童虫显着性上调表达基因主要与细胞（cell）、细胞凋亡（apoptosis）、细胞外组成部分（extracellular region part）、细胞组成（cell part）、酶调节活性（enzyme regulator activity）和转录调节活性（translation regulator activity）等相关。东方田鼠来源童虫显着性下调表达基因主要与代谢过程（metabolic process）、催化活性（catalytic activity）、发育过程（developmental process）、转运活性（transporter activity）、细胞进程（cellular process）、定位（localization）和结合（binding）等相关。东方田鼠和大鼠来源童虫均显着下调表达基因与代谢过程（metabolic process）、定位（localization）、结构形成自动修饰（anatomical structure formation）和催化活性（catalytic activity）等相关。对东方田鼠和大鼠来源童虫均显着下调表达的基因进行KEGG pathway通路分析,发现这些蛋白主要为甘氨酸/苏氨酸/丝氨酸代谢分子（Glycine,serine and threonine metabolism）、DNA复制关键分子（DNA replication）、MAPK信号通路分子（MAPK signaling pathway）、蛋白转运（Protein export）、氨酰基tRNA生物合成（Aminoacyl-tRNA biosythesis）等分子。本研究发现一批基因在三种宿主来源10d童虫中呈现差异表达,它们可能是不同宿主来源童虫发育差异的关键分子,影响血吸虫在不同宿主中的发育。如东方田鼠来源童虫显着上调表达,小鼠来源虫体显着下调的基因有与细胞增殖密切相关的颗粒蛋白（Granulin）基因,细胞凋亡通路中发挥凋亡效应的关键分子如Cell death protein 3,Caspase 7,caspase 3;在小鼠来源童虫显着上调表达,东方田鼠来源童虫显着下调表达的基因中与生长发育相关的甲硫氨酰氨肽酶2 （MAP 2）和Sj magonashi基因,与胰岛素代谢相关的胰岛素分子（Insulin-2）和胰岛素受体蛋白激酶（insulin receptor protein kinase）基因,与脂肪酸代谢相关的脂肪酸去饱和酶（Fatty acid desaturase）、长链脂肪酸延伸相关蛋白（Elongation of very long chain fatty acids protein）、脂肪酸脱氢酶（Fatty-acid amide hydrolase）、脂肪酸结合蛋白（fatty acid-binding protein）基因,与细胞凋亡通路中发挥抑制凋亡效应的关键分子相关Sj IAP（Baculoviral IAP repeat-containing protein）、cytokine-induced apoptosis inhibitor,与信号传导相关的Cyclophilin家族基因、TGF通路分子如Eukaryotic translation initiation factor 3,Transforming growth factor beta-1、Wnt通路分子Wnt inhibitory factor 1等。这些重要功能分子的发现,将为阐明血吸虫在不同宿主生存环境中的生长发育机制,探讨血吸虫与宿主相互作用关系、发现新的血吸虫候选疫苗分子和新药物靶标提供重要基础。本研究分析获得了一批小鼠、大鼠和东方田鼠来源的10d童虫的差异表达基因信息,初步揭示了在不同宿主体内日本血吸虫生长发育的分子基础,发现了一批在不同宿主环境中可能影响血吸虫生长发育的关键功能分子,为这些重要差异表达基因的确定及进行生物学功能研究提供了良好的基础。3、日本血吸虫细胞凋亡因子和凋亡抑制因子（Sj IAP）的研究基因组水平的研究表明血吸虫与其他多细胞生物一样具有凋亡这一生物学现象。上文透射电镜研究表明,东方田鼠来源10d童虫细胞有细胞凋亡的现象,同时芯片分析结果表明,日本血吸虫凋亡相关基因caspase3和7在东方田鼠来源虫体中呈高表达,而在小鼠来源虫体中呈较低表达;日本血吸虫凋亡抑制因子基因在小鼠来源虫体中高表达,东方田鼠来源虫体中低表达,表明日本血吸虫凋亡相关基因和凋亡抑制因子可能在血吸虫生长发育和寄生虫与宿主相互作用关系中发挥重要的生物学功能,在东方田鼠抗血吸虫机制中发挥一定的作用。本研究进行了不同宿主来源日本血吸虫童虫caspase3/7的活性和基因表达差异研究;利用RT-PCR技术获得了Sj IAP编码基因的全长cDNA,PCR扩增其mRNA对应基因组DNA序列;荧光实时定量PCR和western blot分析表明,该基因为成虫期雄虫期高表达基因;免疫组化研究分析表明,虫体IAP蛋白广泛分布于成虫体被膜;细胞水平实验证实该基因真核重组表达质粒在细胞水平可以有效抑制诱导剂引起的细胞凋亡,同时研究发现Sj IAP重组蛋白也可以在血吸虫的虫体水平抑制凋亡;Real Time RT-PCR和western blot研究了日本血吸虫凋亡抑制因子基因（IAP）在不同宿主的差异表达情况。研究结果表明细胞凋亡相关基因很可能是不同宿主环境中影响血吸虫生长发育的重要功能分子,在血吸虫生长发育调控和东方田鼠抗血吸虫病中可能发挥重要的生物学功能。4、日本血吸虫生长发育重要功能分子甲硫氨酰氨肽酶2基因（MAP 2）和mago nashi基因的研究MAP 2是一种双功能酶,其催化结构域位于C端,负责切除蛋白质合成过程中新生肽链N端的起始蛋氨酸,对蛋白质的成熟以及在细胞中的转运和定位、功能调节极其重要,其N端结构域含有酸性氨基酸和碱性氨基酸富集的区域,可以抑制真核起始因子eIF2-2α的磷酸化,促进蛋白质合成的起始。在哺乳动物细胞内,MAP 2与细胞增值与分化密切相关,MAP 2在秀丽线虫生殖和发育中发挥重要的生物学功能。mago nashi基因在真核生物中广泛存在,且极为保守。在生物体翻译转录中参与mRNA定位和剪切,在生物体生殖与发育中,mago nashi基因在胚胎早期发育和生殖细胞性别决定中发挥重要的生物学功能。芯片分析结果表明,日本血吸虫MAP 2和mago nashi基因在东方田鼠来源虫体中低表达,大鼠和小鼠来源虫体中高表达。本研究利用RT-PCR技术分别获得了Sj MAP 2（日本血吸虫甲硫氨酰氨肽酶2）和Sj mago nashi编码基因的全长cDNA（基因登录号为:GQ403663和GQ403668）。荧光实时定量PCR和western blot分析Sj MAP 2和Sj mago nashi基因在不同期别阶段虫体表达差异,发现这两个基因均为童虫期表达基因,且在雄虫的表达量均高于其在雌虫。Real Time RT-PCR和western blot分析Sj MAP 2和Sj mago nashi在不同宿主来源日本血吸虫童虫的表达情况,发现二者均在小鼠来源童虫中表达最高,大鼠次之,东方田鼠最低。应用吡喹酮处理雌虫和雄虫后,Sj M AP 2表达均有显着降低,其中雄虫和雌虫中分别下降92.17%和49.01%。构建了这2个基因的重组表达质粒,并分别在大肠杆菌中成功表达。Western blotting分析表明重组蛋白rSj MAP 2和rSj mago nashi具有良好的抗原性,应用这两种重组抗原免疫小鼠,与空白对照组比较,免疫组小鼠获得的减虫率分别为17.8%和22.43%,肝脏虫卵减少率分别为36.24%和29.11%。以上研究表明,日本血吸虫Sj MAP 2和Sj mago nashi基因的表达可能对血吸虫生长发育有影响,这两个基因可能在血吸虫生殖、生长发育及细胞分化中具有重要的生物学功能。5、日本血吸虫Cyclophilin家族CyPA、CyPB和CyPC基因的研究Cyclophilin（CyP）广泛存在于生物体内,为一种分布广泛的细胞内蛋白,在植物、细菌和哺乳动物中均存在,具有高度保守性。CyP具有肽酰脯氨酰顺反异构酶（PPIase）活性,在体内外能结合蛋白质并催化加速它们的折叠、装配和转运;特别是富含脯氨酸的蛋白质折叠,起着分子伴侣的作用,同时在信号转导中起着重要调节作用。信号转导与蛋白翻译后修饰在日本血吸虫中发挥重要的生物学功能。本研究利用RT-PCR技术分别获得了Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC编码基因的全长cDNA（基因登录号为:GQ403666、GQ403664和GQ403665）。荧光实时定量PCR分析这三个基因在不同期别阶段虫体表达量,发现这三个基因均为童虫期高表达基因。Real Time RT-PCR分别分析Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC在不同宿主来源日本血吸虫童虫的差异表达情况,发现三者均在小鼠来源童虫中表达最高,大鼠次之,东方田鼠最低。构建了这3个基因的重组表达质粒,并分别在大肠杆菌中成功表达Western blotting验证表明重组蛋白rSj CyP A、rSj CyPB和rSj CyP C均具有良好的抗原性,在小鼠免疫试验中,与空白对照组比较,三种蛋白免疫小鼠获得的减虫率分别为14.2%、26.98%和13.79%;肝脏虫卵减少率分别为43.38%、39.73%和51.32%。研究表明,日本血吸虫Sj CyP A、Sj CyPB和Sj CyPC基因的表达可能对血吸虫生长发育有影响,这三个基因可能在血吸虫的分子伴侣、信号转导等方面发挥重要的生物学功能。本文以日本血吸虫易感宿主BALB/c小鼠、非易感宿主Wistar大鼠和不致病宿主东方田鼠来源的10d童虫作为研究对象,应用电镜观察表明三种不同宿主来源的10d童虫在形态结构上存在较大差异。首次发现东方田鼠来源童虫虫体细胞的凋亡现象显着大于大鼠和小鼠来源虫体。首次应用寡核苷酸芯片技术对三种宿主来源童虫的差异表达基因进行了比较分析,发现一些重要的血吸虫生长发育、细胞凋亡、信号传导分子在三种不同宿主来源虫体呈差异表达,获得一批具有深入研究价值的差异表达基因信息。首次克隆、鉴定和表达了Sj MAP2, Sj magonashi, Sj CyPA, Sj CyPB和Sj CyPC五个血吸虫新基因,登录号分别为GQ403663、GQ403668 GQ403666、GQ403664和GQ403665。应用以上五种基因重组抗原进行了小鼠免疫试验,这5个基因的重组蛋白都诱导了部分免疫保护作用。首次对日本血吸虫凋亡抑制基因Sj IAP的生物学功能进行了探索,在细胞水平验证了该凋亡抑制因子可有效地抑制凋亡诱导剂诱发的凋亡。本文结果对深入探讨日本血吸虫的生长发育机制,发现血吸虫与宿主相互作用关键分子,进而为发现抗血吸虫病新的疫苗候选分子和新的治疗药物靶标提供了新思路。
二、东方田鼠乳酸脱氢酶同工酶的研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、东方田鼠乳酸脱氢酶同工酶的研究（论文提纲范文）
（1）《实验动物与比较医学》创刊40年重要文献回顾（论文提纲范文）
| 1 无菌和高等级实验动物 |
| 2 野生动物的实验动物化 |
| 2.1 狨猴 |
| 2.2 仓鼠、沙鼠和小家鼠 |
| 2.3 鼠兔 |
| 2.4 旱獭 |
| 2.5 东方田鼠 |
| 2.6 树鼩 |
| 2.7 长爪沙鼠 |
| 2.8 裸鼹鼠 |
（2）田鼠巴贝斯虫丙酮酸激酶抑制剂的筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 缩略语表 |
| 1 前言 |
| 1.1 田鼠巴贝斯虫概述 |
| 1.2 顶复门原虫糖代谢途径 |
| 1.3 丙酮酸激酶相关研究进展 |
| 1.4 丙酮酸激酶抑制剂研究 |
| 2 研究目的及意义 |
| 3.材料与方法 |
| 3.1 试验材料 |
| 3.1.1 虫株、细胞株和试验动物 |
| 3.1.2 菌株、质粒与引物 |
| 3.1.3 仪器设备 |
| 3.1.4 主要试剂与溶液配制 |
| 3.2 试验方法 |
| 3.2.1 生物信息学网站及工具 |
| 3.2.2 RNA提取及cDNA反转录 |
| 3.2.3 田鼠巴贝斯虫PyKⅠ与PyKⅡ基因的扩增、克隆和测序 |
| 3.2.4 田鼠巴贝斯虫PyKⅠ与PyKⅡ的原核表达 |
| 3.2.5 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 3.2.6 田鼠巴贝斯虫裂殖子全虫抗原的提取 |
| 3.2.7 Western blot |
| 3.2.8 间接免疫荧光试验(IFA) |
| 3.2.9 酶动力学试验 |
| 3.2.10 田鼠巴贝斯虫体外生长抑制实验 |
| 3.2.11 田鼠巴贝斯虫体内生长抑制试验 |
| 3.2.12 细胞毒性试验 |
| 4 结果与分析 |
| 4.1 PyKⅠ与PyKⅡ基因的扩增和克隆测序 |
| 4.1.1 PyKⅠ与PyKⅡ基因的全长扩增与克隆 |
| 4.1.2 PyKⅠ与PyKⅡ基因全长序列的测定 |
| 4.1.3 PyKⅠ与PyKⅡ基因的生物信息学分析 |
| 4.2 PyKⅠ与PyKⅡ的原核表达和纯化 |
| 4.2.1 重组表达质粒的构建 |
| 4.2.2 田鼠巴贝斯虫PyK的原核表达及纯化 |
| 4.3 PyKⅠ与PyKⅡ的免疫原性分析 |
| 4.3.1 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 4.3.2 PyKⅠ与PyKⅡ天然蛋白的鉴定 |
| 4.4 PyKⅠ酶动力学研究 |
| 4.4.1 PyKⅠ重组蛋白GST标签的切除及验证 |
| 4.4.2 PyKⅠ酶动力学曲线 |
| 4.5 PyKⅠ抑制剂筛选 |
| 4.6 PyKⅠ抑制剂效果评估 |
| 4.6.1 体外田鼠巴贝斯虫生长抑制效果评估 |
| 4.6.2 细胞毒性试验 |
| 4.6.3 Tannic acid产物回补试验 |
| 4.6.4 体内田鼠巴贝斯虫生长抑制效果评估 |
| 5 讨论 |
| 6 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录 |
（3）巴贝斯虫乳酸脱氢酶晶体结构解析及催化分子机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 缩略语 |
| 1、文献综述 |
| 1.1 巴贝斯虫病概述 |
| 1.2 巴贝斯虫主要代谢通路 |
| 1.3 乳酸脱氢酶相关研究进展 |
| 1.4 LDH小分子抑制剂的研究 |
| 1.5 小结 |
| 2、研究目的与意义 |
| 3、材料与方法 |
| 3.1 实验动物 |
| 3.2 虫株、血清 |
| 3.3 载体、质粒和引物 |
| 3.4 实验仪器 |
| 3.5 主要试剂 |
| 3.6 软件及网站 |
| 3.7 RNA提取及c DNA反转录 |
| 3.8 目的基因的扩增及克隆 |
| 3.9 重组质粒的构建 |
| 3.10 连接产物转化与单克隆挑取 |
| 3.11 菌液PCR鉴定 |
| 3.12 质粒小量抽提 |
| 3.13 酶切鉴定 |
| 3.14 蛋白表达与纯化 |
| 3.15 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 3.16 裂殖子全虫抗原提取 |
| 3.17 Western blot实验 |
| 3.18 间接免疫荧光实验(IFA) |
| 3.19 酶动力学实验 |
| 3.20 体外巴贝斯虫生长抑制实验 |
| 3.21 体内巴贝斯虫生长抑制实验 |
| 3.22 蛋白结晶条件初筛及优化 |
| 3.23 数据收集和结构解析 |
| 3.24 点突变质粒构建 |
| 3.25 表面等离子共振(SPR) |
| 3.26 等温滴定量热法(ITC) |
| 3.27 分子对接参数设置 |
| 3.28 SPR药物动力学实验 |
| 3.29 细胞毒性实验 |
| 4、结果 |
| 4.1 巴贝斯虫LDH生物学功能鉴定 |
| 4.1.1 体外巴贝斯虫生长抑制效果评估 |
| 4.1.2 体内巴贝斯虫生长抑制效果评估 |
| 4.1.3 基因克隆与进化分析 |
| 4.1.4 质粒构建与蛋白表达纯化 |
| 4.1.5 多克隆抗体的制备与纯化 |
| 4.1.6 免疫原性鉴定及虫体天然蛋白定位 |
| 4.1.7 酶动力学及抑制动力学曲线 |
| 4.2 LDH单晶结构解析 |
| 4.2.1 结晶蛋白准备 |
| 4.2.2 结晶条件初筛和优化 |
| 4.2.3 BmLDH单晶结构 |
| 4.2.4 BoLDH单晶结构 |
| 4.3 LDH-NADH-oxamate三联共晶结构解析 |
| 4.3.1 结晶蛋白准备 |
| 4.3.2 结晶条件初筛和优化 |
| 4.3.3 晶体冻存与X-ray数据收集 |
| 4.3.4 BmLDH三联复合结构 |
| 4.4 LDH酶活开关鉴定及验证 |
| 4.4.1 BmLDH突变体蛋白及酶活检测 |
| 4.4.2 人LDH-A突变体蛋白及酶活检测 |
| 4.4.3 Bm LDHR99A突变体结晶条件筛选及优化 |
| 4.4.4 晶体冻存与X-ray数据收集 |
| 4.4.5 Bm LDHR99A突变体晶体结构 |
| 4.4.6 表面等离子共振(SPR)实验 |
| 4.4.7 等温滴定量热法(ITC)实验 |
| 4.4.8 Bm LDH催化机制与R99A抑制机制模式图 |
| 4.5 小分子抑制剂虚拟筛选及抑制活性评估 |
| 4.5.1 BmLDH结构模型及活性位点定义 |
| 4.5.2 分子对接 |
| 4.5.3 三种萘系化合物酶活抑制效果评估 |
| 4.5.4 SPR药物动力学 |
| 4.5.5 二种萘系化合物体外培养研究 |
| 4.5.6 MTT细胞毒性实验 |
| 4.5.7 化合物NHNA与 Bm LDH结合模式 |
| 5、讨论 |
| 6、结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 |
| 附录2 |
（4）东方田鼠不同器官组织同工酶研究（论文提纲范文）
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 东方田鼠LDH同工酶电泳结果 |
| 3.2 东方田鼠SOD同工酶电泳结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
（5）东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 BAC文库来源 |
| 1.2 接头与探针 |
| 1.2.1 接头序列 |
| 1.2.2 生物素标记探针Biotin-20 |
| 1.2.3 地高辛标记探针DIG-20 |
| 1.3 菌落原位杂交 |
| 1.3.1 菌落的裂解 |
| 1.3.2 预杂交与正式杂交 |
| 1.3.3 洗膜和免疫检测 |
| 1.4 富含微卫星的亚克隆文库构建 |
| 1.4.1 BAC DNA的抽提、验证 |
| 1.4.2 BAC DNA的酶切、接头连接及纯化检测 |
| 1.4.3 亲和捕捉 |
| 1.4.4 连接和转化 |
| 1.5 引物的设计、筛选和鉴定 |
| 2 结果 |
| 2.1 菌落原位杂交 |
| 2.2 NotⅠ酶切鉴定 |
| 2.3 BAC DNA的双酶切 |
| 2.4 连接产物的PCR检测 |
| 2.5 亲和捕捉 |
| 2.6 亚克隆文库的测序分析 |
| 2.7 引物的设计和筛选 |
| 3 讨论 |
（6）东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究背景 |
| 1.1.1 东方田鼠的分类及地理分布 |
| 1.1.2 东方田鼠相关的遗传学研究进展 |
| 1.1.3 田鼠属的系统发生研究现状 |
| 1.2 研究策略 |
| 1.2.1 线粒体基因组全序列获得的策略 |
| 1.2.2 Y染色体部分序列的测序策略 |
| 1.3 研究意义 |
| 1.3.1 东方田鼠实验动物化研究 |
| 1.3.2 东方田鼠是我国重要的实验动物资源 |
| 1.3.3 东方田鼠的生态防治 |
| 1.4 本课题创新点 |
| 第二章 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.2 实验仪器及试剂 |
| 2.2.1 实验仪器 |
| 2.2.2 实验试剂 |
| 2.2.3 溶液配制方法 |
| 2.2.4 实验计算机软件 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 东方田鼠DNA抽提及保存 |
| 2.3.2 线粒体体基因组和Y染色体部分序列测序引物设计 |
| 2.3.3 Y染色体部分序列测序引物设计 |
| 2.3.4 PCR和LA-PCR |
| 2.3.5 mtDNA基因组的序列的拼接、注释与分析 |
| 2.3.6 利用mtDNA的系统进化分析 |
| 第三章 结果及讨论 |
| 3.1 东方田鼠长江亚种mtDNA基因组研究结果及分析讨论 |
| 3.1.1 东方田鼠基因组DNA抽提结果 |
| 3.1.2 PCR和LA-PCR结果 |
| 3.1.3 东方田鼠长江亚种的线粒体基因组基因结构 |
| 3.1.4 线粒体基因组酶切图谱分析 |
| 3.1.5 遗传进化分析 |
| 3.2 Y染色体SNP挖掘结果与讨论 |
| 3.2.1 Y染色体SNP挖掘结果 |
| 3.2.2 讨论 |
| 第四章 结论与展望 |
| 4.1 研究结论 |
| 4.2 课题展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 硕士研究生阶段发表论文 |
| 致谢 |
（7）东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 前言 |
| 1.1 东方田鼠的研究进展 |
| 1.1.1 分类分布 |
| 1.1.2 形态学、生态学特征 |
| 1.1.3 抗血吸虫特性 |
| 1.1.4 东方田鼠的遗传学研究 |
| 1.2 遗传标记简介 |
| 1.3 微卫星标记的研究进展 |
| 1.3.1 从数据库中搜寻微卫星标记 |
| 1.3.2 从相近物种获得微卫星引物 |
| 1.3.3 从基因组中筛选微卫星标记 |
| 1.3.4 微卫星标记在鼠类动物中的研究进展 |
| 1.4 基因定位 |
| 1.5 图谱的构建 |
| 1.5.1 遗传图谱 |
| 1.5.2 物理图谱 |
| 1.5.3 基因图谱 |
| 1.6 本课题的研究目的、意义和创新点 |
| 1.6.1 本实验的研究目的和意义 |
| 1.6.2 本课题的创新点 |
| 第2章 实验材料与方法 |
| 2.1 主要仪器和试剂 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 东方田鼠BAC文库的构建 |
| 2.2.2 接头与探针的设计 |
| 2.2.3 鼠尾小鼠基因组DNA抽提 |
| 2.2.4 菌落杂交法筛选含有微卫星的BAC文库 |
| 2.2.5 东方田鼠BAC DNA的抽提、酶切、酶连等 |
| 2.2.6 磁珠富集法筛选含有微卫星的基因片段 |
| 2.2.7 转化和测序 |
| 2.2.8 引物的设计、筛选和鉴定 |
| 2.3 本研究相关技术方案简介 |
| 2.3.1 原位杂交技术 |
| 2.3.2 磁珠富集法 |
| 2.3.3 The CopyControl Clonging System |
| 2.3.4 脉冲场电泳 |
| 第3章 结果与分析 |
| 3.1 菌落原位杂交 |
| 3.2 NotⅠ酶切鉴定 |
| 3.3 BAC DNA的双酶切 |
| 3.4 连接产物的PCR检测 |
| 3.5 亲和捕捉 |
| 3.6 亚克隆文库的测序分析 |
| 3.7 引物的设计和筛选 |
| 第4章 讨论 |
| 4.1 地高辛标记及与同位素标记的的原位杂交技术的比较 |
| 4.2 从BAC文库筛选微卫星的质量评价 |
| 4.3 微卫星标记的应用前景 |
| 第5章 结论和展望 |
| 参考文献 |
| 课题来源 |
| 致谢 |
（8）日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略表 |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 日本血吸虫对不同宿主的易感性 |
| 1 东方田鼠抗日本血吸虫病 |
| 1.1 日本血吸虫在东方田鼠体内的发育过程及东方田鼠产生的炎症反应 |
| 1.2 东方田鼠抗日本血吸虫特异性 |
| 1.3 展望 |
| 2 大鼠不易感日本血吸虫 |
| 2.1 大鼠不易感日本血吸虫的现象 |
| 2.2 血吸虫在大鼠体内的发育过程 |
| 2.3 大鼠感染日本血吸虫的免疫特性 |
| 参考文献 |
| 第二章 蛋白质组学的研究进展 |
| 1 蛋白质组学概述 |
| 1.1 蛋白质组学的定义 |
| 1.2 蛋白质组学的研究途径 |
| 2 蛋白质组学的研究方法 |
| 2.1 样品的制备 |
| 2.2 蛋白质组分的分离技术 |
| 2.3 蛋白质组分的鉴定技术 |
| 2.4 蛋白质组的生物信息学分析 |
| 3 蛋白质组学在寄生虫领域中的应用 |
| 3.1 寄生虫蛋白质组学的研究背景 |
| 3.2 蛋白质组学在寄生虫上的研究内容 |
| 3.3 蛋白质组学在寄生虫学中的研究进展 |
| 4 血吸虫蛋白质组学研究进展 |
| 5 展望 |
| 参考文献 |
| 第三章 血吸虫疫苗的研究进展 |
| 1 血吸虫疫苗 |
| 1.1 传统疫苗 |
| 1.2 新型疫苗 |
| 2 血吸虫保护性抗原研究 |
| 2.1 表膜蛋白抗原 |
| 2.2 酶类抗原 |
| 2.3 信号转导相关抗原 |
| 2.4 血吸虫性别和发育调节相关抗原 |
| 参考文献 |
| 第二篇 实验研究 |
| 第四章 日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 双向电泳条件的确定 |
| 2.2 2D-DIGE分析 |
| 2.3 差异表达蛋白的鉴定 |
| 2.4 实时定量PCR对差异表达蛋白的验证 |
| 2.5 GO分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 日本血吸虫蛋白酶体A5和A2亚基基因的克隆、表达及免疫效果观察 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增 |
| 2.2 SjPSMA5和SjPSMA2基因的生物信息学分析 |
| 2.3 表达载体的构建和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 2.5 重组蛋白抗原性的分析 |
| 2.6 BALB/c小鼠的免疫保护试验结果 |
| 2.7 SjPSMA5和SjPSMA2基因在不同时期虫体内的表达 |
| 2.8 虫体SjPSMA5和SjPSMA2基因在不同宿主体内的表达 |
| 2.9 SjPSMA5和SjPSMA2蛋白在虫体内的定位 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 日本血吸虫硫氧还蛋白过氧化物酶的特性研究 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR的扩增 |
| 2.2 SjTPx基因的生物信息学分析 |
| 2.3 表达载体的构建和鉴定 |
| 2.4 重组蛋白在大肠杆菌中的表达与纯化 |
| 2.5 重组SjTPx蛋白抗氧化活性的分析 |
| 2.6 重组蛋白的western blot分析 |
| 2.7 SjTPx二聚体的鉴定 |
| 2.8 SjTPx基因在不同时期虫体内的表达 |
| 2.9 虫体SjTPx基因在不同宿主体内虫体中的表达 |
| 2.10 SjTPx蛋白在虫体内的定位 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆（论文提纲范文）
| 材料与方法 |
| 1 材料 |
| 1.1 动物 |
| 1.2 主要试剂 |
| 1.3 引物设计与合成 |
| 2 方法 |
| 2.1 基因组DNA提取 |
| 2.2 PCR扩增 |
| 2.3 PCR产物克隆 |
| 2.4 DNA序列分析 |
| 结 果 |
| 1 PCR扩增 |
| 2 重组质粒DNA克隆鉴定 |
| 3 测序结果及分析 |
| 讨 论 |
（10）不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 前言 |
| 1.2 东方田鼠抗血吸虫的研究 |
| 1.2.1 东方田鼠抗日本血吸虫病现象 |
| 1.2.2 日本血吸虫在东方田鼠体内的发育及宿主炎症反应 |
| 1.2.3 东方田鼠抗日本血吸虫特异性免疫机制研究 |
| 1.2.3.1 东方田鼠抗日本血吸虫体液免疫机制研究 |
| 1.2.3.2 东方田鼠抗日本血吸虫的细胞免疫机制研究 |
| 1.2.3.3 东方田鼠抗日本血吸虫非特异性免疫机制研究 |
| 1.2.3.4 东方田鼠抗日本血吸虫其他可能机制研究 |
| 1.3 血吸虫疫苗的研究 |
| 1.3.1 血吸虫疫苗的种类 |
| 1.3.2 血吸虫研究的保护性抗原介绍 |
| 1.4 基因芯片技术在寄生虫学中的应用 |
| 1.4.1 基因芯片的定义 |
| 1.4.2 基因芯片的制备 |
| 1.4.3 基因芯片技术在寄生虫学中的应用 |
| 第二章 不同宿主来源日本血吸虫 10d 童虫形态观察和体细胞凋亡研究 |
| 2.1 绪言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验动物 |
| 2.2.2 主要仪器 |
| 2.2.3 主要试剂 |
| 2.2.4 虫体收集 |
| 2.2.5 扫描电镜观察不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.2.6 透射电镜观察不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.2.7 Annexin V-FITC/propidium iodide (PI)法检测不同宿主来源虫体细胞细胞凋亡 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 扫描电镜分析不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.3.2 透射电镜分析不同宿主来源10d 童虫的形态 |
| 2.3.3 不同宿主来源虫体细胞细胞凋亡分析 |
| 2.4 讨论 |
| 第三章 不同宿主来源日本血吸虫童虫基因表达的芯片分析 |
| 3.1 绪言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验动物 |
| 3.2.2 主要仪器 |
| 3.2.3 主要试剂 |
| 3.2.4 虫体收集 |
| 3.2.5 寡核苷酸芯片的定制与杂交 |
| 3.2.6 芯片结果的实时定量PCR 验证 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 虫体总RNA 的提取 |
| 3.3.2 不同宿主来源童虫差异表达基因分析 |
| 3.3.3 芯片结果Real time RT-PCR 验证 |
| 3.4 讨论 |
| 第四章日本血吸虫细胞凋亡因子和凋亡抑制因子 SjIAP 研究 |
| 4.1 绪言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 主要试剂和酶 |
| 4.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 4.2.3 RNA 的提取 |
| 4.2.4 不同宿主来源童虫caspase3/7 活性检测 |
| 4.2.5 IAP 基因的扩增及生物信息学分析 |
| 4.2.6 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 4.2.7 重组表达质粒的构建与表达 |
| 4.2.8 Western blotting 检测 |
| 4.2.9 重组蛋白质谱鉴定 |
| 4.2.10 IAP 质粒转染对ActD 药物诱导凋亡的抑制作用 |
| 4.2.11 免疫组化 |
| 4.2.12 虫体蛋白与重组IAP 蛋白相互作用 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 不同宿主来源童虫caspase3/7 活性分析 |
| 4.3.2 不同宿主来源虫体caspase3 和caspase7 实时定量分析 |
| 4.3.3 Sj IAP 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 4.3.4 重组原核表达质粒的构建、原核表达及重组蛋白纯化 |
| 4.3.5 Sj IAP 基因的期别差异表达分析 |
| 4.3.6 Sj IAP 在293T 细胞中对caspase 活性的抑制作用 |
| 4.3.7 Sj IAP 重组蛋白对血吸虫caspase 活性影响的研究 |
| 4.3.8 Sj IAP 的免疫定位研究 |
| 4.3.9 Sj IAP 在不同宿主来源童虫中的表达差异 |
| 4.4 讨论 |
| 第五章 日本血吸虫甲硫氨酰氨肽酶2基因(MAP 2)和mago nashi基因的研究 |
| 5.1 绪言 |
| 5.2 材料和方法 |
| 5.2.1 主要试剂和酶 |
| 5.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 5.2.3 RNA 的提取 |
| 5.2.4 cDNA 片段的扩增及生物信息学分析 |
| 5.2.5 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 5.2.6 重组表达质粒的构建与表达 |
| 5.2.7 Sj MAP2 和Sj mago nashi 基因在不同宿主来源童虫的基因和蛋白表达情况 |
| 5.2.8 吡喹酮作用对SjMAP2 基因表达影响 |
| 5.2.9 小鼠免疫保护性试验 |
| 5.3 结果 |
| 5.3.1 Sj MAP 2 和Sj mago nashi 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 5.3.2 重组表达质粒的构建与原核表达、重组蛋白纯化 |
| 5.3.3 Sj MAP2 和Sj mago nashi 基因的期别差异表达分析 |
| 5.3.4 Sj MAP2 和Sj mago nashi 在不同宿主来源童虫中的表达差异 |
| 5.3.5 吡喹酮作用对血吸虫Sj MAP2 基因表达影响 |
| 5.3.6 动物免疫试验结果 |
| 5.3.7 血清特异性抗体水平 |
| 5.4 讨论 |
| 第六章 日本血吸虫Cyclophilin 家族基因的研究 |
| 6.1 绪言 |
| 6.2 材料和方法 |
| 6.2.1 主要试剂和酶 |
| 6.2.2 菌种、实验动物和血清 |
| 6.2.3 RNA 的提取 |
| 6.2.4 含ORF cDNA 片段和基因组序列的扩增及生物信息学分析 |
| 6.2.5 荧光实时定量RT-PCR 检测 |
| 6.2.6 重组表达质粒的构建与表达 |
| 6.2.7 复性后重组蛋白CyPA 的PPIase 酶活性测定 |
| 6.2.8 Cyclosporin A 作用日本血吸虫后Sj CyPA 基因的表达检测 |
| 6.2.9 小鼠免疫保护性试验 |
| 6.3 结果 |
| 6.3.1 SjCyPA、CyPB 和CyPC 基因的克隆及生物信息学分析 |
| 6.3.2 SjCyPA、CyPB 和CyPC 基因的期别差异表达分析 |
| 6.3.3 Sj CyPA、CyPB 和CyPC 重组蛋白的表达纯化 |
| 6.3.4 表达产物抗原性分析 |
| 6.3.5 重组复性蛋白 CyPA 的 PPIase 酶活性测定 |
| 6.3.6 Cyclosporin A 作用后 CyPA 基因的表达检测 |
| 6.3.7 动物免疫试验结果 |
| 6.3.8 血清抗体水平 |
| 6.4 讨论 |
| 第七章 全文结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
四、东方田鼠乳酸脱氢酶同工酶的研究（论文参考文献）
- [1]《实验动物与比较医学》创刊40年重要文献回顾[J]. 高诚. 实验动物与比较医学, 2021(01)
- [2]田鼠巴贝斯虫丙酮酸激酶抑制剂的筛选[D]. 安晓梦. 华中农业大学, 2020
- [3]巴贝斯虫乳酸脱氢酶晶体结构解析及催化分子机制研究[D]. 喻龙. 华中农业大学, 2019(01)
- [4]东方田鼠不同器官组织同工酶研究[J]. 江新杰,杨春文,金建丽,金志民,王瑞琪. 黑龙江畜牧兽医, 2016(23)
- [5]东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选[J]. 汤敏,倪丽菊,高骏,肖君华,胡建华,高诚. 中国实验动物学报, 2012(03)
- [6]东方田鼠线粒体基因组序列及Y染色体部分序列的测定及分析[D]. 姜宪环. 东华大学, 2012(07)
- [7]东方田鼠部分BAC文库的微卫星筛选[D]. 汤敏. 东华大学, 2012(07)
- [8]日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究[D]. 洪炀. 南京农业大学, 2011(06)
- [9]日本血吸虫非适宜宿主东方田鼠和SD大鼠特异性DNA序列的克隆[J]. 胡媛,袁忠英,沈玉娟,朱小华,刘述先,曹建平. 中国血吸虫病防治杂志, 2010(03)
- [10]不同宿主来源日本血吸虫童虫差异表达基因的研究[D]. 彭金彪. 中国农业科学院, 2010(10)