一、新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文文献综述）
王珊珊[1]（2019）在《海南鼠源性细小病毒、多瘤病毒及Gemycycrularvirus的基因组分析》文中认为研究目的:对海南省部分地区野生鼠类样本携带的致病性及潜在致病性病毒进行基因组分析,为防控以鼠源性新发致病性疾病的流行提供数据支撑。研究方法:本课题基于本实验前期对海南省部分地区野生鼠类样本病毒宏基因组高通量测序及生物信息学分析的结果,从中筛选出可能导致人类和动物致病鼠源性细小病毒（parvovirus,ParV）、多瘤病毒（polyomavirus,PyV）及Gemycircularvivus（GemyCV）的reads,分别对三种病毒通过PCR技术进行全基因组扩增、序列拼接、基因组遗传进化分析,初步建立了巢式PCR（Nested PCR）检测鼠源性ParV和PyV方法。研究结果:（1）海南鼠源性ParV的基因组分析基于前期对海南临高地区捕获的野生鼠咽拭子样本病毒宏基因组高通量测序及生物信息学的结果分析,发现了1603条reads与啮齿类动物ParV具有同源性（80%-94%）,疑似ParV（ParV/LG株）。应用PCR技术进行全基因组扩增、基因全长拼接等方法,获得ParV/LG株的全基因组序列。基因组全长为4691 bp,编码非结构蛋白（NS1）和衣壳蛋白1（VP1）,分别编码721 aa及583 aa。在NS1序列（448-GPASTGKS-455）中发现ATP或GTP结合的Walker环基序（GXXXXGK[T/S]）,NS1和VP1的GC含量分别为54.57%和45.43%。基于NS1和VP1氨基酸序列构建的进化树分析显示,Parv/LG株与Kilham rat virus株（KRV）（AF321230.1）亲缘关系最密切,同源性分别为91%和97%,该病毒基因组已上传至GenBank,序列号为MK530648.1,命名为parvovirus Ro/Lingo/China。初步建立了基于该病毒VP1基因的Nested PCR检测方法。（2）海南鼠源性PyV的基因组分析基于前期对海南海口地区捕获的野生褐家鼠咽拭子样本病毒宏基因组高通量测序及生物信息学的结果分析,发现了114条reads与啮齿类动物PyV具有同源性（93%-97%）,疑似PyV（PyV/HK株）。应用PCR技术进行全基因组扩增、基因全长拼接等方法,获得PyV/HK株的全基因组序列。基因组全长为5318 bp,编码早期基因和晚期基因,早期基因编码大T抗原（LTAg）、中间T抗原（MTAg）和小T抗原(（STAg）,晚期基因编码主要衣壳蛋白1（VP1）、衣壳蛋白2（VP2）和衣壳蛋白3（VP3）,LTAg,MTAg,STAg,VP1,VP2和VP3分别编码776 aa,414aa,194 aa,384 aa,347 aa和228 aa。基于LTAg氨基酸序列构建的进化树分析显示,PyV/HK株与Rattus norvegicus polyomavirus 1（RnorPyV1）株（KR075945.1）的亲缘关系最密切,LTAg,MTAg和VP1氨基酸的同源性分别为99%,99%和99%,该病毒基因组已上传至GenBank,序列号为MK372231.1,命名为polyomavirus sp RN/Haikou/China。初步建立了基于该病毒的VP1基因的Nested PCR检测方法。（3）海南鼠源性GemyCV的基因组分析基于前期对海南海口褐家鼠咽拭子样本病毒宏基因组高通量测序及生物信息学分析的结果,发现了298条reads与GemyCV具有同源性（81%-97%）,疑似GemyCV（GemyCV/HK株）。应用PCR技术进行全基因组扩增、基因全长拼接等方法,获得GemyCV/HK株的全基因序列。基因组全长为2199 bp,编码衣壳蛋白（Cap）、主要复制蛋白（Rep 1）和次要复制蛋白（Rep 2）,分别编码322aa、194aa和112aa。GemyCV/HK株基因间区域（Iterons）（127-nt）含有一个具有九聚体[TAAAATTTA]的非典型茎环结构,Rep 1和Rep 2之间具有独特的内含子（Intron）。基于Cap和Rep氨基酸序列构建的进化树分析显示,GemyCV/HK株与gemycircularvirus SL1（GemyCV-SL1）株（KP133075.1）亲缘关系最密切,氨基酸的同源性分别是97%和99%,该病毒基因组已上传至GenBank,序列号为MK293717.1,命名为gemycircularvirus RN/Haikou/China。结论:（1）获得了ParV/LG株的全基因序列,遗传进化分析表明,ParV/LG株与可引起大鼠致病的KRV株亲缘关系最密切,表明海南临高地区鼠类携带ParV。初步建立了基于ParV/LG株VP1基因的Nested PCR检测方法。（2）获得了PyV/HK株的全基因序列,遗传进化分析表明,PyV/HK株与RnorPyV1株的亲缘关系最密切,表明海南海口地区鼠类携带PyV。初步建立了基于PyV/HK株VP1基因的Nested PCR检测方法。（3）获得了GemyCV/HK株的全基因序列,遗传进化分析表明,GemyCV/HK株与GemyCV-SL1株的亲缘关系最密切,表明海南海口地区鼠类携带GemyCV。
陆兴洁[2]（2019）在《蜱传森林脑炎病毒（TBEV）荧光定量PCR检测方法的建立与应用》文中认为蜱传脑炎（TBE）又称森林脑炎,是由森林脑炎病毒（TBEV）经蜱媒介传播所导致的大脑中枢神经性疾病,TBEV隶属于黄病毒科、黄病毒属。犬、羊、牛、马等家畜均为该病的传播宿主。蜱叮咬健康的家畜,病毒随着蜱的唾液流进家畜的血液使其患病,还会直接或间接的将病毒传染给人群。人一旦感染上该病毒,重者会出现高烧、意识模糊、四肢肌肉瘫痪及脑膜刺激征等病症,对生命健康构成极大威胁。因此本研究旨在建立一种对TBEV成本低且快速精准的检测方法,为蜱传病防控奠定基础。TBEV荧光定量PCR检测方法的建立。成功制备了TBEV标准品,确定了反应条件和反应体系。对获得的标准品进行荧光定量检测后成功建立标准曲线,且相同稀释梯度间变异系数均低于2%,表明此方法稳定性良好。将标准质粒按（108拷贝/μL101拷贝/μL）梯度稀释,进行荧光定量PCR和半巢式PCR检测并比较其敏感性,结果显示,荧光定量PCR检测下限可达101拷贝/μL,灵敏度比半巢式PCR高10倍。选用沙粒病毒（LCMV）、发热板血小板（SFTSV）和TBEV毒株进行荧光定量PCR检测,结果显示,仅TBEV出现特异性扩增,其它毒株均不能产生扩增,表明此方法特异性良好。TBEV荧光定量PCR检测方法的应用。对在内蒙古地区采集的155份牛血清样本进行荧光定量PCR检测和半巢式PCR检测。结果显示,155份牛血清样本里荧光定量PCR检测出阳性样本22份,阳性率为14.19%,半巢式PCR检测出阳性样本14份,阳性率为9.03%,两者一致率为63.64%,经测序结果显示36份阳性样本均感染TBEV。证明此方法检测敏感性强,可应用于TBEV的临床诊断及病原的定量分析。综上所述,此方法的建立为TBEV的流行病学调查及医学诊断提供了理论依据和技术和支持。
寇春[3]（2016）在《新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究》文中研究指明新疆维吾尔自治区位于我国西北边陲,亚欧大陆腹地,与俄罗斯、蒙古、巴基斯坦等8家接壤,陆上对外口岸较多,与周边国家经济交往频繁。新疆地理生态环境多样,物种分布广与内地有着明显的不同,适合蜱的生长繁殖,其分布广泛,种类较多,可传播多种虫媒病毒。新疆地区时有人、畜不明原因发热和脑炎散发或流行,疑似虫媒病毒引起,但是由于种种原因,目前还没有进行过系统而深入的调查,急需加强研究。我国已知流行的4种虫媒病毒病中新疆出血热和蜱传脑炎在新疆都有发现,在新疆既往进行的虫媒病毒调查中,已经从新疆地区的全沟硬蜱、森林革蜱、亚洲璃眼蜱、边缘革蜱和草原革蜱中分别分离到蜱传脑炎病毒,东方马脑炎病毒,新疆出血热病毒、新环状病毒。从按蚊、库蚊、伊蚊中分别分离到辛德毕斯病毒,西方马脑炎病毒,辽宁病毒,Tahyna病毒等。但尚缺乏对新疆准噶尔盆地周边地区虫媒病毒的深入调查研究。为了解新疆准噶尔盆地周边地区蜱及啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒情况,应用RT-PCR、细胞培养及生物信息学等方法对该地区蜱及啮齿动物（鼠）感染虫媒病毒情况进行了调查研究。本项研究结果对丰富新疆乃至国内虫媒病毒资源和进行新疆地区虫媒病毒病预防控制具有重要意义。主要内容包括以下方面:1.新疆啮齿动物（鼠）样本采集及携带虫媒病毒的初步检测2014-2015年在新疆准噶尔盆地周边地区乌苏、阜康、奇台、吉木萨尔和石河子149团等地区采集了1054只啮齿动物,其中2014年,2015年分别为684只和370只,主要种类有长尾黄鼠（Spermophilus undulatus）、子午沙鼠（Meriones meridianus Pallas）、大沙鼠（Rhombomys opimus）和三趾跳鼠（Dipus sagitta）。2014年鼠样本根据采集地、属种与脏器的不同分成193组。通过RT-PCR的方法对鼠中发热伴血小板减少综合征病毒（SFTSV）、新疆出血热病毒（XHFV）、荆门病毒（JMTV）以及古尔图病毒（Guertu virus）的感染情况进行了检测。结果发现总样本中Guertu virus的S片段阳性率为9.3%,SFTSV的S片段阳性率为6.2%。Guertu virus与SFTSV主要集中在乌苏地区,主要宿主为长尾黄鼠。提示长尾黄鼠为Guertu virus与SFTSV新的宿主。2015年样本同样方法分组成136组,除检测以上4种病毒外还检测了汉坦病毒（HTV）,蜱传脑炎病毒（TBEV）与黄病毒属病毒（Flavivirus）。结果显示总样本中XHFV的阳性率为11%,SFTSV阳性率为7.4%,Guertu virus阳性率为21.3%。阳性样本主要集中在乌苏地区。根据2014-2015年对准噶尔盆地周边地区鼠样本的检测结果,提示新疆乌苏地区可能存在XHFV、SFTSV与Guertu virus的自然疫源地。2.新疆蜱中新病毒的发现、分离及在蜱中分子流行病学调查2014年在新疆乌苏地区共采集了13662只草原革蜱（Dermacentor nuttalli）。根据采集地与蜱种类不同按每组约200只左右分成68组,选取8组有代表样性的样本,经武汉中科院病毒研究所的454高通量测序,有7组样本中存在黄病毒科病毒的重叠群（Contig）。对获得的Contig利用NCBI中的BLISA工具搜索,发现所有Contig都与荆门蜱病毒（Jingmen tick virus,JMTV）的核酸序列相似性最高,在65%-84%之间。暂将该新病毒命名为新疆蜱病毒（Xinjiang tick virus,XJTV）。选取454高通量测序的3组阳性样本,利用Vero细胞对XJTV进行病毒培养和分离,细胞传至第7代后,仅在第一代培养细胞的上清中检测到有XJTV的核酸片段,同时对第一代细胞的上清及细胞制备切片进行电镜观察,发现在细胞与上清中存在90nm左右的病毒粒子。通过RT-PCR对XJTV在乌苏地区蜱中的流行情况进行检测。结果表明,2014年乌苏地区的68组草原革蜱中,检测到XJTV阳性组数54组,其阳性率达79.4%。说明草原革蜱为XJTV的媒介之一,该病毒可能在乌苏地区的蜱中广泛分布。3.新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆454高通量测序的Contig与JMTV基因序列比对后发现只有部分S1与S3的信息,利用获得的基因序列设计引物进行RT-PCR得到了该病毒的S1与S3全序列信息。对采自新疆羊沟地区的一份阳性样本经RNA-Seq技术（上海伯豪公司）分析获得了S2与S4的部分序列信息,通过设计特异性引物用RT-PCR的方法获得了该病毒的S2与S4全序列信息。利用RT-PCR和重叠RT-PCR的方法分别将结构蛋白S1,S2,S3与S4全基因序列克隆到p GEM-Teasy载体中,这为更好地保存病毒的基因组信息,以及对该病毒分子特性和相关基因功能等性质的研究提供了基础。4.XJTV非结构蛋白和结构蛋白的生物信息学分析利用相关生物学软件Signa IP 4.1、TMHMM、Net NGlyc1.0 Serve、Phrye、MEGA5与DNAStar等对XJTV编码的非结构蛋白（NSP1与NSP2）和结构蛋白（VP1、VP2和VP3）进行了分析。在二级结构中XJTV与黄病毒科的代表株在非结构蛋白的功能区域的motif保守性较高。利用已经解析蛋白晶体结构的登革热病毒（DENV-4）和日本脑炎病毒（JEV）作为模板模拟出XJTV的S1与S3编码蛋白的三维结构。结果发现XJTV基于二级结构保守的motif在空间位置上也与模板蛋白的motif一一对应,提示这些保守结构在病毒的生命周期中可能行使着相同的生物学功能。对结构蛋白VP1、VP2与VP3的跨膜区域、信号肽与糖基化位点进行分析预测,结果表明结构蛋白VP1、VP2与VP3分别具有病毒的包膜蛋白、衣壳蛋白和膜蛋白的功能。基于XJTV的S1与S3编码的非结构蛋白构建的系统发育进化树分析结果显示,与选择的黄病毒科的部分代表毒株相比,XJTV不属于黄病毒科已有的三个属,而与JMTV和MGTV位于进化树单独的分支中。提示XJTV可能是黄病毒科一个新的属中的毒株。5.XJTV衣壳蛋白重组表达质粒的构建及其兔多克隆抗体的制备将XJTV与JMTV编码结构蛋白的基因序列进行比较后,选取相对保守的衣壳蛋白（Capsid protein）ORF片段序列,将其构建到原核表达载体p ET28a与p ET32a中,同时构建至真核表达载体pc DNA3.1中,通过序列测定,结果表明成功获得了三种表达质粒p ET28a-CP,p ET32a-CP和pc DNA3.1-CP。将p ET28a-CP质粒转染大肠杆菌中表达纯化获得重组蛋白,用纯化的重组蛋白免疫新西兰白兔制备抗体,经检测所获得的抗体效价达1:100000以上,通过western blot检测证实了该抗体与抗原有很好的结合亲和性。构建的原核表达质粒及制备的抗体可为后续开展病毒血清学检测及XJTV的免疫学特性研究工作提供了条件。将构建的真核表达载体p CDNA3.1-CP转染入293T细胞,经IFA检测,表明VP2基因编码的衣壳蛋白在该细胞中成功表达,这为后续病毒的包装以及对哺乳动物的侵染机制研究提供了基础。
寇春,段晓梅,张渝疆,孙素荣[4]（2016）在《新疆地区虫媒病毒调查研究状况》文中认为近年来新疆陆续发现的一些新的虫媒病毒与虫媒病毒病对当地人畜健康造成一定危害。新疆地理生态环境的复杂多样性为多种虫媒病毒的传播提供了有利条件,虫媒病毒在新疆分布广泛,存在地域差异性。随着分子流行病学的发展,基于核酸分子和细胞培养检测技术方法从新疆的多种昆虫媒介和宿主动物中鉴定并分离得到分属于黄病毒科、披膜病毒科、呼肠孤病毒科和布尼亚病毒科的多种病毒,部分病毒属在新疆系首次发现。本文对新疆多个地区近年来已报道的虫媒病毒在宿主中的检测和感染人畜引起的疾病的情况进行了汇总整理,有利于对新疆各地虫媒病毒的流行病学进行深入的调查与研究。
郑夔,袁帅,黎东红,丁国允,李小波,师永霞,戴俊,黄吉城[5]（2016）在《新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的假病毒阳性对照品制备》文中研究指明目的制备安全、稳定的新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测阳性对照品。方法人工合成含实时荧光RT-PCR扩增片段的新疆出血热病毒核苷酸序列,连接入慢病毒载体,将重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞,培养48 h后采用实时荧光RT-PCR方法检测假病毒包装情况,随后将包装成功的假病毒颗粒加核酸保护剂制备成阳性对照品,并进行稳定性试验。结果重组慢病毒载体与慢病毒包装载体共转染293T细胞后,将收集到的细胞培养上清采用实时荧光RT-PCR进行检测,结果显示10、100、1 000、10 000倍4个倍比稀释度扩增后所得的Ct值分别为13、19、25、33,显示含高浓度的假病毒颗粒。取经1 000倍稀释后制备的阳性对照品于37℃孵箱中放置0、3、7、15、21和30 d后,提取的RNA经实时荧光RT-PCR检测,所得Ct值在2528之间,表明阳性对照品有较高的热稳定性。结论本研究通过慢病毒包装技术制备的假病毒颗粒,是新疆出血热病毒荧光RT-PCR核酸检测过程中理想的阳性对照品。
高晓艳[6]（2013）在《乙脑病毒时空动力学分析》文中指出乙型脑炎（Japanese Encephalitis, JE）,简称乙脑,是目前全世界无可争议的最严重的病毒性脑炎,发病率和病死率高,后遗症严重。乙脑病毒（Japanese Encephalitis virus, JEV）是蚊传虫媒病毒,可以被多种蚊虫携带和传播,猪是其主要的储存宿主,鸟被认为是乙脑病毒的传播宿主,人和马是乙脑病毒的终末宿主。本研究的目的是通过对优势基因型别乙脑病毒进行时空动力学研究分析,寻找乙脑病毒的播散规律和播散特点以及可能影响乙脑病毒传播的因素,预测乙脑病毒将来的分布变化趋势,为全球乙脑的预防控制提供依据。湖北省位于我国中南部,长江中游,每年降水充沛,具有丰富的蚊虫媒介种类。湖北省曾是蚊传虫媒病毒病乙脑的高发地区,湖北省是否还存在其他蚊传虫媒病毒,至今缺乏系统的调查研究。为系统了解湖北省蚊传虫媒病毒的分布情况及其种类,为当地虫媒病毒病的预防控制提供理论依据,本研究在2009年和2010年7-8月份,分别在湖北省的东西南北中挑选武穴市、通城县、恩施州、神农架林区、江陵县和随州市等6个地区进行蚊虫采集,并通过病毒分离和序列分析确定该地区的虫媒病毒种类、分布及分子生物学特征。1.乙脑病毒时空动力学分析本研究首先测定了中国2005-2010年在湖北、重庆、江西、山东、辽宁和云南省新分离的22株基因1型乙脑病毒的E基因序列,其中包括本研究2010年在湖北省新分离的乙脑病毒株,填补了湖北、重庆、江西等亚洲中部区域乙脑病毒的空白,为乙脑病毒时空动力学分析提供了条件。继而利用GenBank下载乙脑病毒序列,最终构建了本研究时空动力学分析所用的涵盖所有乙脑流行区域和多种媒介宿主的优势基因型别乙脑病毒序列数据集,共包括359株基因1型乙脑病毒的E基因序列。本研究采用贝叶斯马尔科夫蒙特卡洛方法对上述数据集进行乙脑病毒的分子进化分析,结果显示分布在不同区域的乙脑病毒形成了相对独立的病毒进化特征,并分别在亚洲最南部地区、亚洲东部沿海地区、亚洲西部地区和亚洲中部地区形成循环。进一步分析发现在以上4个地区形成的独立进化分支中都具有来自最南部地区的病毒,且最南部地区的病毒大都是每个分支中最早分化出来的病毒；另外,每个独立进化分支中最南部地区分离的毒株具有广泛的时间跨度,以上结果说明亚洲最南部地区分离的乙脑病毒既体现了种群多样性又维持了种群稳定性,提示亚洲大陆最南部地区在乙脑病毒向亚洲大陆传播的过程中担当了重要的源泉地区作用。本研究还讨论了乙脑病毒的传播路线,发现乙脑病毒在亚洲存在由南向北的传播特点,主要通过3条传播路线,而三条传播路线分别与候鸟在亚洲的迁徙路线吻合,提示候鸟在乙脑病毒远距离传播中发挥重要的作用。优势基因型别乙脑病毒的种群动态分析显示乙脑病毒在传播和地域播散过程中经历了平缓—快速增长—下降—平缓的种群变化。基于种群动态Skyline plots的时间节点对4个地域循环中毒株的分离时间进行分析,进一步证实了亚洲大陆最南部地区是乙脑病毒的源泉地区。乙脑病毒系统发生分析的结果显示乙脑病毒具有地域分布特征,但也存在毒株地域混合现象,提示乙脑病毒的分布分化机制除了族群结构分化外,还可能存在迁移事件（基因漂移）。因此,为详细地了解乙脑病毒的空间动力学特征,本研究还采用Migraphyla软件对乙脑病毒传播的空间动力学特征进行分析,结果显示乙脑病毒在亚洲的播散存在频繁的迁徙事件,迁徙事件也是促成乙脑病毒地域分布分化的重要方式。更进一步的分析发现,泰国、上海、山东、四川和越南是乙脑病毒重要的迁徙源泉地区。泰国是乙脑病毒向亚洲西部、东亚传播的主要源泉地区；上海维持了乙脑病毒在东亚沿海地区的循环；山东是乙脑病毒从沿海地区向中国内陆地区传播的源泉地区；四川维持了乙脑病毒在中国内陆的循环；而越南则是乙脑病毒从东南亚地区向中国内陆省份传播的源泉。2.湖北省虫媒病毒调查本研究在2009年和2010年的7-8月在分别在湖北省武穴市、通城县、恩施州、神农架林区、江陵县和随州市等6个地区采集蚊虫标本,共采集三带喙库蚊、中华按蚊、骚扰阿蚊、致倦库蚊和未分类杂蚊等3属5种共计22,269只蚊虫标本。三带喙库蚊是武穴市、通城县、随州市和江陵县的优势蚊种,致倦库蚊是恩施州的优势蚊种,在神农架林区主要采集到骚扰阿蚊。对所有标本分272批进行研磨和病毒分离,结果分离到42个阳性分离物,来自4个蚊种——三带喙库蚊、致倦库蚊、骚扰阿蚊和中华按蚊。经过系统鉴定,共得到33株乙脑病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）、6株盖塔病毒（Getah virus, GETV）（?）口4株版纳病毒（Banna virus, BAV）。从三带喙库蚊和致倦库蚊中分离到的病毒最多,分别是21株和15株,而且3种病毒都从三带喙库蚊中分离到；从恩施州分离的病毒最多,为31株；恩施州致倦库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为53.6%和1：103.3,其次是恩施州三带喙库蚊中乙脑病毒的批次阳性率和现场最低感染率最高,分别为44.4%和1：128.8。新分离病毒分子生物学特征分析显示,所有33株JEV均为基因Ⅰ型病毒,分离株之间E基因核苷酸和氨基酸序列同源性为98.7%-100%和99.8%-100%。新分离JEV与疫苗株SA14-14-2在E基因区段存在14处共同的氨基酸差异,但差异位点均不处于决定抗原性的关键氨基酸位点。新分离GETV与我国2002年分离株HB0234、YN0540和韩国2004年分离株Korea的进化关系最近,位于同一个进化分支中；而与俄罗斯分离株LEIV/16275的进化关系较远。新分离BAV第12片段核苷酸之间的同源性为100%,第12片段核苷酸和VP12蛋白序列中存在多个不同于其它地域分离株的共同差异位点,进化分析显示所有新分离株与中国北京和云南的分离株以及越南分离株处于同一亚群。本研究的意义本研究首次在全球范围内开展了乙脑病毒的时空动力学分析,阐明了乙脑病毒在亚洲的播散特征和播散方式,首次发现乙脑病毒的传播存在地域分布特征和播散源泉地区,首次发现迁徙事件是乙脑病毒重要的分布分化机制,并首次从系统进化角度揭示候鸟在乙脑病毒远距离传播中具有重要的作用。研究结果还提示乙脑病毒存在向欧洲等传统非流行区传播的可能性,为全球乙脑的预防控制提供了重要依据。本研究还对湖北省部分地区进行了虫媒病毒调查,分离到乙脑病毒、盖塔病毒和版纳病毒等3种虫媒病毒,并发现库蚊是湖北市携带病毒最多的蚊种。盖塔病毒和版纳病毒为湖北省首次分离；乙脑病毒在湖北的分离也填补了乙脑病毒在亚洲中部的空白,为乙脑病毒时空动力学分析提供了条件。本研究还明确了湖北省新分离病毒与国内外分离株之间的分子生物学差异,丰富了我国和湖北省虫媒病毒信息,为深入开展研究提供了基础数据,也为了解当地传染病病因以及积极预防和控制相关虫媒病毒疾病提供了重要的资料信息。
王晓宏[7]（2012）在《脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立》文中进行了进一步梳理人类文明的进步并未阻止传染病的肆虐,进入二十一世纪,传染病的防治仍是人类必须面对的巨大挑战。对传染病病原学的研究始终是一项具有重大意义的任务。近年来,生物学技术的迅速发展也使得传染病病原体的检测与鉴定技术得到飞速发展,每一项技术的革新对生命科学领域来说都是一次跨越。目前,众多分子生物学方法已成功应用于病原体检测中,如PCR技术、基因芯片技术、分子杂交技术等。相对于传统检测技术而言,新一代分子生物学技术具有操作简单、耗时短、检测效率高等特点,但是也存在相应的不足,如何避免这些不足并开发新技术已成为目前科研工作者的首要任务。在本研究中,我们将最初用于基因分型、突变位点检测、耐药位点分析等方面的多重PCR-Mass ARRAY技术应用于传染病病原体的高通量检测中,以15种可引起脑炎/脑膜炎症状的病原体以及16种可引起病毒性出血热的病毒为研究对象,建立脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术,实现此类病原体的多重、高通量、高特异性以及高灵敏度检测,服务于流行病学调查研究以及传染病病原体大规模筛查与鉴定。实验方法：针对拟检测病原体,使用生物信息学方法对待检病原体的基因组序列进行分析,确定各病原体的保守序列；以保守序列为参考序列,设计PCR-Mass ARRAY的扩增引物组合和延伸引物组合（每种病原体包括一对扩增引物和一条延伸引物）；使用无菌双蒸水、正常人基因组DNA以及人工重组质粒对引物体系的特异性以及可重复性进行验证；使用梯度稀释的质粒对该体系的灵敏度进行测定。在优化并建立了脑炎/脑膜炎以及出血热病毒的多重PCR-Mass ARRAY检测技术体系之后,使用6种脑炎培养病毒以及14份脑炎症状的临床标本对该体系的实际检测效果进行评价。同时,使用实时荧光定量PCR技术、Sanger测序法对同批样本进行平行检测,以评价多重PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度以及准确性。结果与结论：（1）建立的脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术具有很高的特异性,最终确定的检测体系不出现假阳性和非特异延伸；对梯度稀释后的重组质粒进行多重PCR-Mass ARRAY检测,确定各质粒的检测灵敏度,脑炎/脑膜炎病原体质粒的灵敏度范围为100copies/μl—10000copies/μl,且只有两种病原体的灵敏度为10000copies/μl;6种脑炎纯病毒的检测结果显示各病毒cDNA均可检出,没有假阳性,Sanger测序结果与多重PCR-Mass ARRAY的检测结果一致；对14份脑炎症状的临床样本多重PCR-Mass ARRAY检测结果显示,有3份样本检测到流行性乙型脑炎（JEV）,其余样本各种病原体检测均为阴性。使用荧光定量PCR法对同批样本进行平行检测,检出两份JEV,这两份样本的PCR-Mass ARRAY结果也为JEV阳性,应用Sanger测序法对3份阳性样本进行鉴定,证实3份样本均为JEV阳性,证明PCR-Mass ARRAY技术的灵敏度高于荧光定量PCR技术。（2）建立的16种出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术同样具有很好的特异性与可重复性；分别使用梯度稀释的出血热病毒重组质粒对该技术的灵敏度进行测试,测试结果显示质粒的灵敏度范围为10copies/μl—100copies/μl,大部分质粒灵敏度为100copies/μl,证明所建立的出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY技术具有很高的灵敏度。上述实验结果表明：多重PCR-Mass ARRAY在脑炎／脑膜炎病原体以及出血热病毒的检测中具有良好的特异性与可重复性,并具有比较高的灵敏度与准确度。因此,该技术适合应用于流行病学调查研究与传染病病原体的大规模筛查中。
李文娟[8]（2011）在《青藏高原（青海省）蚊虫和蚊传虫媒病毒及其与当地疾病关系的研究》文中研究说明背景青海省位于“世界屋脊”青藏高原的东北部,全省平均海拔在3000米以上。作为内陆省份,青海省分别与西藏、新疆、甘肃省和四川省相邻,地理位置极其重要,素有“天河锁钥”、“海藏咽喉”之称。青海省面积约为72万平方千米,地域广大,地理景观复杂,媒介生物及媒介传播性疾病种类较多。已有研究显示,青海省存在鼠疫、斑疹伤寒、布鲁氏杆菌病、莱姆病等多种经媒介传播的细菌性传染病。此前,青海省一直未开展过蚊传虫媒病毒调查。近年来,青海省夏秋季存在不明原因发热病例增多,病因不清,是否与病毒感染有关亟待研究。流行性乙型脑炎（以下简称“乙脑”）是我国主要的蚊传虫媒病毒疾病,但是自1950年代以来,青海省一直没有乙脑病例报告,被认为是非乙脑流行区。而与青海省相毗邻的四川省和甘肃省历年来均有乙脑病例的报道,因此不能排除青海省存在流行性乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）或其他蚊传虫媒病毒及相关疾病的可能性。随着我国西部大开发战略的推进和青藏铁路的建成通车,青海省进一步成为连接中国内陆与西藏甚至南亚各国的重要陆路交通要道。这对于推动青海省等西部地区经济发展发挥重要作用；同时随着贸易、旅游等迅速发展,物质和人员交流日益增加,也增加了各种媒介性传染病传入或传出的机会。因此在青海省开展蚊虫和蚊传虫媒病毒相关研究势在必行。目的本课题通过在青海省进行系统的蚊虫和蚊传虫媒病毒研究,掌握当地有关蚊虫媒介及蚊传虫媒病毒种类与分布的本底信息；在此基础上重点研究新分离病毒在当地人群和动物中自然感染状况以及与当地感染性疾病的关系及相关疾病的临床特点和流行病学特征,为当地蚊传虫媒病毒疾病的预防与控制提供科学依据。方法2007-2009年连续三年选择夏季在青海省采集蚊虫标本,同时采集健康人群、家养动物和发热病人血清标本。蚊虫标本置于液氮保存,血清标本置于超低温冰箱保存,采用干冰保存运送至实验室。蚊虫标本经研磨离心后,取上清接种组织细胞进行培养,阳性分离物采用血清学和分子生物学方法进行系统鉴定。针对新分离病毒特异性基因片段进行扩增测序,使用ClustalX 1.83、MegAlign、Mega 4和Genedoc 3.2等生物信息学软件进行病毒核苷酸和氨基酸序列比对及系统进化分析。健康人群和家养动物血清标本,采用IFA方法检测新分离病毒IgM和IgG抗体；IFA检测阳性的标本,采用空斑减少中和试验检测病毒中和抗体滴度。发热病人血清标本,采用IFA方法检测新分离病毒IgM抗体,对IgM抗体阳性者继续采集恢复期血清,并定期随访,明确疾病的进程及转归；采用空斑减少中和试验检测病人急性期和恢复期血清是否存在病毒中和抗体滴度4倍及以上增高；采用巢式PCR检测病人急性期血清标本中病毒核酸；采用乳鼠接种法对病毒核酸阳性标本进行病毒分离。结果1、蚊虫媒介分布。本研究于2007-2009年连续三年在青海省采集蚊虫标本,在格尔木市、西宁市、民和县和刚察县设立12个采集点,共采集蚊虫标本23608只（其中2007年采集蚊虫8147只,2008年采集7838只,2009年采集7623只）,经鉴定分为3属10种,其中伊蚊属7种：屑皮伊蚊、背点伊蚊、黄背伊蚊、里海伊蚊、黑头伊蚊、刺扰伊蚊、未分类伊蚊；库蚊属2种：凶小库蚊、淡色库蚊；按蚊属1种：为最黑按蚊。四个地区的蚊种构成和优势蚊种存在明显差异,其中格尔木市的优势蚊种为屑皮伊蚊（29.32%,2523/8604）；西宁市为刺扰伊蚊（84.47%,4225/5002）；民和县为凶小库蚊（32.80%,2448/7463）；刚察县为黄背伊蚊（98.03%,2489/2539）。虽然在青海省连续三年开展蚊虫分布调查,但是一直未采集到JEV的主要传播媒介——三带喙库蚊,这与青海省历年来没有乙脑病例报告的情况一致。此外,本研究连续在青海省民和县采集到最黑按蚊,这是中国首次在高纬度和高海拔地区关于最黑按蚊的报道。2、病毒分离鉴定。采用组织细胞培养法,将23 608只蚊虫标本按照蚊种和采集时间地点分479批进行病毒分离,经过连续3次传代,共得到19株阳性分离物。血清学鉴定显示,其中2株能够与布尼亚病毒属特异性抗体和Tahyna病毒（Tahyna virus, TAHV）原型株Bardos 92特异性抗体发生反应；1株能够与辽宁病毒（Liaoning virus, LNV）特异性抗体发生反应；其余16株与常见虫媒病毒抗体均不发生反应。分子生物学鉴定结果显示,2株为TAHV,1株为LNV,2株为环状病毒,14株为淡色库蚊浓核病毒（Culex pipiens pallens densovirus, CpDNV）。分子遗传进化分析显示,TAHV青海省新分离株独立于欧洲分离株和中国新疆分离株之外,表明青海省新分离TAHV具有明显的遗传进化特征。由于TAHV是欧洲流行最为广泛的致人疾病的布尼亚病毒,且该病毒为我国新近分离病毒,故本课题将对TAHV青海新分离株进行重点研究,并着重于TAHV在当地的感染状况及致病性的系统研究。3、病毒表型和分子特征研究。针对青海省新分离TAHV QH07060病毒系统开展病毒生物学表型和分子特征研究。QH07060病毒在BHK-21细胞上存在两种空斑形态的变异株,分别命名为QH07060-LP（大斑）和QH07060-SP（小斑）病毒。生长动力曲线显示,QH07060-LP病毒感染BHK-21细胞42h达到复制高峰,峰值滴度为9.04 1g PFU/m1；QH07060-SP病毒复制高峰亦为42h,峰值滴度为6.70 1g PFU/ml。乳鼠生存曲线显示,QH07060-LP和QH07060-SP病毒对乳鼠的全部致死时间分别为4d和6d,且QH07060-LP病毒对乳鼠从开始致病到全部致死的过程较短。全基因组测序表明,QH07060-LP和QH07060-SP病毒全基因组序列长度均为12 260nt,共存在9个核苷酸差异位点,并导致6个保守氨基酸位点发生改变；提示这些氨基酸位点的改变可能是引起QH07060病毒空斑表型和生物学差异的分子基础。4、健康人群TAHV感染状况。2007年7-9月和2008年7-9月,在青海省格尔木市、西宁市和民和县共采集健康人血清标本1078份。IFA检测和空斑减少中和试验显示,青海省健康人群IgG抗体阳性率为1.76%（19/1078）；中和抗体阳性率为2.13%（23/1078）。从地区分布看,格尔木市TAHV抗体阳性率明显高于西宁市和民和县,呈现明显的区域分特征。按年龄特征分析,TAHV抗体阳性标本均来自30岁以下人群,其中IgG和中和抗体阳性均以20-29岁年龄组最高,且抗体阳性率均为4.35%（4/92）。结合青海省格尔木市于2007年分离到TAHV,并青海省健康人群中TAHV抗体阳性者主要集中在格尔木市,提示当地存在TAHV感染。5、家养动物TAHV感染状况。2008年7-9月,在青海省格尔木市、西宁市和民和县共采集240份家养动物血清,动物种类包括羊、牛、猪。检测结果显示,青海省家养动物TAHV IgG抗体阳性率为9.17%（22/240）,其中格尔木市抗体阳性率最高,为18.3%（11/60）,明显高于其他两个地区（χ2=7.969,P<0.05）。因此我们将研究重点放在格尔木市,于2009年7-9月再次采集家养动物血清标本,并将动物种类扩大为羊、牛、猪、兔、鸡、鸭,共采集血清标本364份。检测结果显示,格尔木市家养动物TAHV IgG抗体阳性率为11.5%（42/364）,其中兔子的抗体阳性率最高,为38.0%（5/13）,提示兔子等动物可能在当地TAHV自然循环过程中发挥重要作用。6、TAHV与当地发热性疾病的关系。鉴于国外研究报道人类感染TAHV后出现程度不等的发热,为明确TAHV感染与当地疾病的关系,2009年7-9月在青海省格尔木市、西宁市、民和县收集各医院以发热为主诉的病例临床症状信息和血清标本,并着重在格尔木市开展病例搜索和随访调查。调查区域以格尔木市新华村（2007年青海省TAHV分离地）为中心,向东西两个方向扩展共涉及6个村镇,调查面积大约240平方千米（40千米×6千米）。每天在上述村镇医院巡回收集病例信息和采集急性发热病例标本,并在当地疾病控制中心建立TAHV感染的特异检测条件,每天检测收集的血清标本中TAHV IgM抗体。现场调查工作结束后,将所有采集的标本在北京的实验室进行重复检测,以保证检测结果的准确性。调查及实验室检测结果显示,青海省发热病人急性期血清标本TAHV IgM抗体阳性率为3.17%（21/661）；并且在TAHV IgM抗体阳性发热病人双份血清存在TAHV中和抗体4倍及以上增高；发热病人急性期血清标本中检测到TAHV核酸。通过实验室检测确认TAHV感染病例的临床症状主要包括发热、全身不适、头痛、呼吸道症状和消化道症状等,一般症状较轻微；病例随访调查发现,所有病例的临床症状在2-5天全部消失,经过连续3个月的随访未发现严重病例和/或死亡病例。结论本课题通过连续三年的系统研究,明确了青海省蚊虫种类分布的本底信息,发现当地不同地理环境的蚊种构成和优势蚊种存在较大差异；通过组织细胞培养法从采集的蚊虫标本中分离到TAHV、LNV、环状病毒、CppDNV等19株病毒,均为我国青藏高原地区首次分离；在当地居民和家养动物血清中检测到TAHV抗体,且格尔木市抗体阳性率明显高于其他两个地区；通过病例调查和实验室确认,首次在格尔木市发热病人中发现TAHV感染病例。本研究首次证实我国存在TAHV现症感染病例,这是我国除乙脑、登革热之外的第三种蚊传虫媒病毒病。
陈维欣[9]（2011）在《山东省蚊虫及蚊传虫媒病毒分布研究》文中研究说明背景虫媒病毒（Arbovirus）是指通过吸血节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒。虫媒病毒能在节肢动物体内繁殖,但对其不致病,经过一定的潜伏期,通过节肢动物叮咬脊椎动物传给新的宿主,并在新宿主体内繁殖,引起相应的临床症状。虫媒病毒呈全球性分布,主要分布于中温带、亚热带和热带地区,大多数具有地理分布特征。国际上已发现537种虫媒病毒,其中130余种可引起人兽疾病,许多虫媒病毒在全球范围内广泛流行并引起严重疾病,如登革病毒（DENV）,乙型脑炎病毒（JEV）,黄热病毒（YFV）等。虫媒病毒病已成为国际社会关注的公共卫生问题。山东省位于中国东部沿海,地处黄河下游,属于暖温带湿润和半湿润季风气候。人口密集,地质地理条件复杂,气候温暖湿润,适宜媒介昆虫滋生繁殖,形成了媒介昆虫种类的多样性,适宜多种虫媒病毒的存在与循环。但是,时至今日仅有流行性乙型脑炎（Japanese Encephalitis, JE）的病例报告,是否存在其它虫媒病毒病尚不清楚。而山东省部分地区夏秋季节存在不明原因发热和脑炎病例。为此需要开展山东省蚊传虫媒病毒与当地疾病关系的研究,为当地虫媒病毒疾病的预防控制提供依据。目的对山东省进行系统的蚊虫现场调查及蚊传虫媒病毒病原学研究,为当地虫媒病毒病的预防控制及夏秋季不明原因发热病例的诊断提供依据和信息。方法连续两年在山东省采集蚊虫标本,分类后,标本用液氮保存运送至实验室。蚊虫标本研磨后接种于组织细胞培养,阳性分离物使用血清学和分子生物学技术进行鉴定。对新分离病毒的特异性基因片段扩增测序后,使用ClustalX1.83、MegAlign、Mega4和Genedoc3.2等生物学软件进行核苷酸和氨基酸序列分析及系统进化分析。同时制备蚊虫标本核酸的cDNA文库,采用半巢式PCR法检测JEV核酸,使用PooledlnfRateManual软件计算蚊虫JEV感染率。结果1.本研究于2008～2009年连续两年在山东省7个采集点采集蚊虫标本,分别为山东省东部的烟台、青岛和东营,中部的淄博和济南以及西南部的济宁和菏泽。两年共采集到5属6种19211只蚊虫标本,包括三带喙库蚊、淡色库蚊、骚扰阿蚊、中华按蚊、常型曼蚊和伊蚊。烟台、青岛和淄博以淡色库蚊为优势蚊种,淡色库蚊所占的比例分别为烟台2008年94.2%（1386/1471）2009年78.5%（992/1263）,青岛83.3%（738/886）,淄博89.2%（390/437）；济南、东营、菏泽和济宁以三带喙库蚊为优势蚊种,三带喙库蚊所占的比例分别为济南2008年67.2%（2050/3050）,2009年100%（1400/1400）,东营93.3%（2800/3000）,菏泽99.6%（3950/3965）,济宁87.2%（3260/3739）。2009年在烟台市采集的标本种类最多,采集到了除常型曼蚊外的所有5种蚊种。常型曼蚊只在济宁市采集到。2.通过组织细胞培养法对2008～2009年采集的蚊虫标本进行病毒分离。结果在242批蚊虫研磨上清中分离到33株病毒阳性分离物。血清学和分子生物学鉴定结果显示,21株分离物为乙脑病毒（Japanese encephalitis virus, JEV）,1株为盖塔病毒（Getah virus, GETV）,1株为（Banna virus, BAV）,10株为（Culex pipiens pallens densovirus,CppDNV）。基于E基因核苷酸序列的系统进化分析显示,山东省分离的21株JEV均属于基因Ⅰ型JEV,且存在明显的地域特征。21株JEVE基因核苷酸同源性在97.3%-100%之间,氨基酸同源性为97.2%-100%。与疫苗株SA14-14-2 E基因核苷酸同源性为87.2%-88.1%,氨基酸同源性为96.4-97.2。与JE减毒活疫苗SA14-14-2株在E基因区段存在11处共同氨基酸位点差异,但决定抗原性和毒力的重要氨基酸位点未发生变化。新分离GETV的3’UTR基因区段全长为401nt,存在GETV特有的长约53nt的3个重复序列元件和19nt的保守序列,第45-54nt间存在10nt缺失,与我国其它省份及蒙古和俄罗斯分离株一致。对新分离BAV基于第12片段的分子生物学特征分析,发现其与我国东北地区分离株（LN0688,LN0689）的氨基酸同源性最高,为97.6%。系统进化显示,山东省新分离BAV位于A1亚组,即位于中国北方分离组。10株CppDNV利用基于NS1和部分NS2基因进行测序分析,这些序列与中国辽宁,云南,新疆及贵州等省份的分离株（JZ-16;YN05217;XJ0545;GZWN1）的同源性均高于99%。3.对山东省蚊虫携带JEV的情况进行检测。在2008年采集的93批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性34份,2009年采集的149批蚊虫标本中检出JEV核酸阳性18份。从地域分布来看,山东省东、中、西部蚊虫标本的JEV感染率均较高。分析不同蚊种JEV的携带情况,在三带喙库蚊、淡色库蚊、中华按蚊和伊蚊标本中均检测到JEV的核酸阳性。JEV平均感染率在20%左右。分别为24.3%（35/144）,25%（1/4）,20%（2/10）和17.5%（14/80）。本文还对各采集点蚊虫JEV病毒感染率与当地乙脑病例的流行分布进行了分析。结论本研究首次在山东省比较系统而全面地进行了虫媒病毒传播媒介的调查。采集到了5属6种蚊虫标本。证实了库蚊为当地的优势蚊种。从3种蚊虫标本中分离到了JEV.GETV.BAV和CppDNV等4种虫媒病毒。提示山东省存在多种适宜虫媒病毒循环的媒介蚊虫及存在多种虫媒病毒的循环。并在山东省多个地区,多个蚊种中都检测到了JEV的感染,提示山东省自然界中存在着高风险的JEV感染。
方美玉,黄平[10]（2010）在《新发与再发虫媒病毒病》文中提出虫媒病毒病是指被节肢动物（如蚊、白蛉、蜱、螨等）叮咬而感染发病的一类传染病,它有别于呼吸道传染病和肠道传染病,是以媒介的生物学或机械性将虫媒病毒从宿主动物传播给健康动物
二、新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文提纲范文）
（1）海南鼠源性细小病毒、多瘤病毒及Gemycycrularvirus的基因组分析（论文提纲范文）
| 缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 海南鼠源性细小病毒的基因组分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试剂和仪器 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.1.2.2 病毒核酸的提取 |
| 1.1.2.3 细小病毒PCR验证 |
| 1.1.2.4 细小病毒全基因组扩增 |
| 1.1.2.5 PCR产物目的条带的胶回收 |
| 1.1.2.6 回收产物的连接 |
| 1.1.2.7 连接产物转化感受态细菌及培养 |
| 1.1.2.8 病毒基因组注释与进化分析 |
| 1.1.2.9 细小病毒NestedPCR检测扩增技术初步建立 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 细小病毒基因组全长扩增 |
| 1.2.2 细小病毒基因组序列比较结果 |
| 1.2.2.1 基因组结构分析 |
| 1.2.2.2 细小病毒同源性分析 |
| 1.2.2.3 细小病毒进化树分析 |
| 1.2.3 细小病毒NestedPCR检测扩增技术初步建立 |
| 1.2.3.1 NestedPCR的扩增 |
| 1.2.3.2 NestedPCR产物序列分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 海南鼠源性多瘤病毒的基因组分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试剂和仪器 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.1.2.2 病毒核酸的提取 |
| 1.1.2.3 多瘤病毒PCR验证 |
| 1.1.2.4 多瘤病毒全基因组扩增 |
| 1.1.2.5 PCR产物目的条带的胶回收 |
| 1.1.2.6 回收产物的连接 |
| 1.1.2.7 连接产物转化感受态细菌及培养 |
| 1.1.2.8 病毒基因组注释与进化分析 |
| 1.1.2.9 多瘤病毒Nested PCR检测扩增技术初步建立 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 多瘤病毒基因组全长扩增 |
| 1.2.2 多瘤病毒基因组序列比较结果 |
| 1.2.2.1 基因组结构分析 |
| 1.2.2.2 多瘤病毒同源性分析 |
| 1.2.2.3 多瘤病毒进化树分析 |
| 1.2.3 多瘤病毒NestedPCR检测扩增技术初步建立 |
| 1.2.3.1 NestedPCR的扩增 |
| 1.2.3.2 Nsted PCR产物序列分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第三章 海南鼠源性Gemycirularvirus的基因组分析 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.1.1 试剂和仪器 |
| 1.1.2 方法 |
| 1.1.2.1 引物设计与合成 |
| 1.1.2.2 病毒核酸的提取 |
| 1.1.2.3 Gemycirularvirus PCR验证 |
| 1.1.2.4 Gemycirularvirus全基因组扩增 |
| 1.1.2.5 PCR产物目的条带的胶回收 |
| 1.1.2.6 回收产物的连接 |
| 1.1.2.7 连接产物转化感受态细菌及培养 |
| 1.1.2.8 病毒基因组注释与进化分析 |
| 1.2 结果 |
| 1.2.1 Gemycirularvirus基因组全长扩增 |
| 1.2.2 Gemycycrularvirus基因组序列比较结果 |
| 1.2.2.1 基因组结构分析 |
| 1.2.2.2 Gemycircularvirus同源性分析 |
| 1.2.2.3 Gemycircularvirus进化树分析 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述 鼠类携带主要病毒性病原的研究进展 |
| 综述参考文献 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（2）蜱传森林脑炎病毒（TBEV）荧光定量PCR检测方法的建立与应用（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 蜱与蜱传病 |
| 1.1 蜱简介 |
| 1.2 蜱的生物学特征 |
| 1.3 蜱的分布 |
| 1.4 蜱传疾病 |
| 1.5 蜱的防治措施 |
| 第二章 森林脑炎简介 |
| 2.1 TBEV的基因结构 |
| 2.2 TBEV的传播特点 |
| 2.3 TBEV的危害 |
| 2.4 TBEV的检测方法 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 TBEV标准质粒DNA的制备 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果 |
| 1.4 讨论 |
| 1.5 小结 |
| 第二章 荧光定量PCR检测方法的建立 |
| 2.1 方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 荧光定量PCR检测方法的应用 |
| 3.1 方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（3）新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1 新疆地区虫媒病毒调查研究状况 |
| 1.1 新疆主要虫媒病毒 |
| 1.2 新疆虫媒病毒研究的发展与展望 |
| 2 黄病毒研究进展 |
| 2.1 基因组及复制周期 |
| 2.2 黄病毒的检测方法 |
| 2.3 黄病毒属主要诊断抗原的研究进展 |
| 2.4 黄病毒的流行情况 |
| 3 研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第二章 新疆地区啮齿动物（鼠）携带虫媒病毒的分子生物学初步检测及分离 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.2 采集方法 |
| 1.2.3 样品研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的制备 |
| 1.2.6 引物设计与合成 |
| 1.2.7 PCR |
| 1.2.8 病毒的分离与检测 |
| 2 结果 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 新疆蜱中新病毒的发现、分离及蜱中分子流行病学调查 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 采集时间与采集地点 |
| 1.2.3 样本研磨 |
| 1.2.4 RNA的提取 |
| 1.2.5 cDNA的合成 |
| 1.2.6 454高通量测序检测样本的准备 |
| 1.2.7 PCR检测 |
| 1.2.8 组织细胞培养法分离病毒 |
| 1.2.9 电镜观察 |
| 2 结果 |
| 2.1 捕蜱数量及种类 |
| 2.2 454高通测序结果 |
| 2.3 蜱样本分毒结果 |
| 2.4 电镜观察实验 |
| 2.5 蜱样本中XJTV的流行病学调查 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 新疆蜱携带XJTV基因组序列信息分析与克隆 |
| 前言 |
| 1 材料及方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.2.1 454高通量测序序列分析与拼接 |
| 1.2.2 RNA-seq高通测序序列分析与拼接 |
| 1.2.3 XJTV序列的 5'与 3'两端序列信息的获取 |
| 1.2.4 XJTV每节段中的片段克隆到pGEM-Teasy |
| 1.2.5 XJTV每节段全长克隆至pGEM-Teasy载体中 |
| 1.2.6 序列的拼接及分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 454高通量测序结果分析 |
| 2.2 RNA-seq高通量测序结果分析 |
| 2.3 XJTV全序列信息的克隆 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第五章 XJTV序列的生物信息学分析 |
| 前言 |
| 1 方法 |
| 1.1 基因序列选取 |
| 1.2 二级结构预测 |
| 1.3 三级结构预测 |
| 1.4 系统发育进化分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 XJTV二级结构分析结果 |
| 2.1.1 糖基化位点分析 |
| 2.1.2 信号肽分析 |
| 2.1.3 跨膜区域 |
| 2.1.4 黄病毒科保守的模体分析 |
| 2.2 非结构蛋白三级结构预测 |
| 2.3 NS3与NS5的进化分析 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 第六章 XJTV的CP蛋白基因原核与真核载体构建及抗体制备 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 材料 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 CP蛋白基因引物的设计、合成与PCR反应 |
| 1.2.2 重组表达载体的构建 |
| 1.2.3 CP蛋白的原核表达 |
| 1.2.4 真核质粒转染实验 |
| 1.2.5 重组CP蛋白的大量诱导及纯化 |
| 1.2.6 重组CP蛋白兔多克隆抗体的制备 |
| 1.2.7 Western Blotting分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2.1 CP蛋白基因原核与真核质粒构建结果 |
| 2.2 重组CP蛋白基因原核表达结果 |
| 2.3 重组CP基因在真核细胞中表达结果 |
| 2.4 Western Blotting检测抗重组CP蛋白的兔多克隆抗体 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 结论与展望 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）新疆地区虫媒病毒调查研究状况（论文提纲范文）
| 1新疆主要虫媒病毒 |
| 1.1黄病毒科 |
| 1.1.1乙脑病毒(Japanese encephalitis virus,JEV) |
| 1.1.2蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus,TBEV) |
| 1.1.3西尼罗病毒(west nile virus,WNV) |
| 1.2 披膜病毒科 |
| 1.2.1辛德毕斯病毒(Sindbis virus) |
| 1.2.2西方马脑炎病毒(western equine encephalitis,WEE) |
| 1.2.3东方马脑炎病毒(eastern equine encephalitis,EEE) |
| 1.3 呼肠孤病毒科 |
| 1.3.1辽宁病毒(Liaoning virus,LNV) |
| 1.3.2新环状病毒(new orbivirus) |
| 1.4 布尼亚病毒科 |
| 1.4.1 Tahyna病毒(Tahyna virus,TAHV) |
| 1.4.2克里米亚刚果出血热(Criean Congo hemorrhagic fever,CCHF) |
| 2 新疆虫媒病毒研究的发展与展望 |
（5）新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的假病毒阳性对照品制备（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1. 1 材料 |
| 1.1.1菌株和细胞株 |
| 1.1.2慢病毒载体和慢病毒包装系统 |
| 1.1.3试剂 |
| 1.1.4仪器 |
| 1. 2 方法 |
| 1. 2. 1核酸提取与实时荧光RT-PCR鉴定假病毒 |
| 1. 2. 2 目的基因的合成与重组慢病毒载体的构建 |
| 1.2.3阳性对照假病毒颗粒的包装 |
| 1.2.4阳性对照品的制备 |
| 1.2.5阳性对照品的稳定性试验 |
| 2 结果 |
| 2.1重组模板质粒慢病毒载体鉴定 |
| 2.2阳性对照假病毒的鉴定 |
| 2.3阳性对照品假病毒浓度的确定 |
| 2.4阳性对照品的热稳定性 |
| 3 讨论 |
（6）乙脑病毒时空动力学分析（论文提纲范文）
| 目录 |
| 英文缩略语 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一部分 乙脑病毒的时空动力学分析 |
| 前言 |
| 第一节 乙脑病毒分布研究及乙脑病毒基因序列分析数据集的构建 |
| 第二节 乙脑病毒系统进化和种群历史分析 |
| 第三节 乙脑病毒的空间动力学分析 |
| 第二部分 湖北省蚊传虫媒病毒调查与病毒分子特征分析 |
| 前言 |
| 第一节 湖北省蚊虫标本采集和病毒分离 |
| 第二节 湖北省蚊传虫媒病毒分离物的鉴定和分子特征研究 |
| 第三部分 病毒性脑炎病人脑脊液标本病原体的检测 |
| 1.材料方法 |
| 2.结果与分析 |
| 3.讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 我国新分离虫媒病毒及其感染 |
| 附表 湖北省蚊虫标本采集记录表 |
| 个人简历 |
| 致谢 |
（7）脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 1. 引言 |
| 1.1 脑炎/脑膜炎病原体简介 |
| 1.1.1 虫媒性脑炎/脑膜炎病毒 |
| 1.1.2 脑炎/脑膜炎细菌 |
| 1.2 病毒性出血热病原体简介 |
| 1.2.1 拉沙热病毒(lassa fever virus.Lassa) |
| 1.2.2 胡宁病毒(junin virus.Junin) |
| 1.2.3 马秋波病毒(machupo virus.Machupo) |
| 1.2.4 汉坦病毒(hanta virus.Hanta) |
| 1.2.5 新疆出血热病毒(crimeancongo hemorrhagic fever virus.CCHFV) |
| 1.2.6 马尔堡病毒(marburg virus.Marburg) |
| 1.2.7 埃博拉病毒(ebola virus.Ebola) |
| 1.2.8 登革病毒(dengue virus.DENV) |
| 1.2.9 裂谷热病毒(rift valley fever virus.RVFV) |
| 1.2.10 肺综合征出血热病毒(sin nombre virus.SNV) |
| 1.2.11 黄热病毒(yellow fever virus.YFV) |
| 1.3 病原体检测技术 |
| 1.3.1 传统生物学技术 |
| 1.3.2 现代分子生物学技术 |
| 1.4 多重PCR-Mass ARRAY简介 |
| 1.4.1 MALDI TOF MS |
| 1.4.2 Mass ARRAY |
| 1.4.3 iPLEX基因型分析法的工作原理 |
| 1.4.4 多重PCR-Mass ARRAY的优势及应用 |
| 1.5 研究内容与意义 |
| 2. 膜炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 样本 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 设备与耗材 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 脑膜炎病原体保守序列分析与筛选 |
| 2.2.2 内参基因的选择 |
| 2.2.3 引物的设计、配制与测试 |
| 2.2.4 质粒构建及验证 |
| 2.2.5 病毒培养液的预处理 |
| 2.2.6 临床标本的预处理 |
| 2.3 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 2.3.1 前PCR扩增 |
| 2.3.2 SAP消化 |
| 2.3.3 iPLEX延伸反应 |
| 2.3.4 树脂纯化 |
| 2.3.5 质谱检测 |
| 2.4 多重PCR-Mass ARRAY检测技术的特异性与灵敏度 |
| 2.4.1 峰图判读分析 |
| 2.4.2 特异性结果分析 |
| 2.4.3 灵敏度结果分析 |
| 2.4.4 重复性结果分析 |
| 2.5 病毒培养物的检测步骤与结果分析 |
| 2.5.1 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程 |
| 2.5.2 纯病毒标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析 |
| 2.6 临床标本检测步骤与结果分析 |
| 2.6.1 脑炎临床标本cDNA多重PCR-Mass ARRAY实验标准流程 |
| 2.6.2 临床标本多重PCR-Mass ARRAY实验结果分析 |
| 2.7 小结 |
| 2.7.1 特异性 |
| 2.7.2 灵敏度 |
| 2.7.3 实用性 |
| 3. 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 出血热病毒质粒标准品 |
| 3.1.2 试剂 |
| 3.1.3 设备与耗材 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 出血热病毒保守序列分析、筛选以及内参基因的选择 |
| 3.2.2 引物设计及测试 |
| 3.2.3 构建重组质粒 |
| 3.2.4 方法特异性、灵敏度及重复性验证 |
| 3.3 出血热病毒多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立 |
| 3.3.1 前PCR扩增 |
| 3.3.2 SAP消化 |
| 3.3.3 iPLEX延伸反应 |
| 3.3.4 树脂纯化 |
| 3.3.5 质谱检测 |
| 3.4 实验结果分析 |
| 3.4.1 特异性结果分析 |
| 3.4.2 出血热病毒重组质粒灵敏度结果分析 |
| 3.4.3 体系重复性结果分析 |
| 3.5 小结 |
| 3.5.1 特异性 |
| 3.5.2 灵敏度 |
| 3.5.3 可重复性 |
| 4. 讨论与结论 |
| 4.1 讨论 |
| 4.1.1 病原体保守序列选择的关键点 |
| 4.1.2 引物设计的关键点 |
| 4.1.3 实验结果的判定 |
| 4.2 结论 |
| 4.2.1 脑炎/脑膜炎病原体多重PCR-Mass ARRAY检测 |
| 4.2.2 出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测 |
| 4.2.3 展望 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 致谢 |
| 攻读硕士学位期间科研成果 |
（8）青藏高原（青海省）蚊虫和蚊传虫媒病毒及其与当地疾病关系的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 青海省蚊虫和蚊传虫媒病毒 |
| 第一节 青海省蚊虫分布特征 |
| 第二节 病毒分离鉴定与分子特征分析 |
| 第二章 青海省Tahyna病毒表型和分子特征 |
| 第三章 青海省Tahyna病毒自然感染状况 |
| 第一节 青海省健康人群Tahyna病毒感染状况 |
| 第二节 青海省家养动物Tahyna病毒感染状况 |
| 第四章 Tahyna病毒与人类疾病的关系 |
| 第一节 青海省发热病人Tahyna病毒感染状况 |
| 第二节 青海省Tahyna病毒感染病例证实 |
| 结论 |
| 创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
（9）山东省蚊虫及蚊传虫媒病毒分布研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一章 山东省蚊传虫媒病毒分离鉴定 |
| 第一节 山东省蚊虫标本采集 |
| 第二节 山东省虫媒病毒分离 |
| 第三节 山东省虫媒病毒鉴定及分子特征分析 |
| 第二章 山东省蚊虫标本乙脑病毒感染率调查 |
| 总结 |
| 创新之处 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 致谢 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
四、新疆出血热病毒分类地位的血清学鉴定（论文参考文献）
- [1]海南鼠源性细小病毒、多瘤病毒及Gemycycrularvirus的基因组分析[D]. 王珊珊. 海南医学院, 2019(02)
- [2]蜱传森林脑炎病毒（TBEV）荧光定量PCR检测方法的建立与应用[D]. 陆兴洁. 吉林农业大学, 2019(03)
- [3]新疆准噶尔盆地周边地区蜱与鼠类携带虫媒病毒的调查研究[D]. 寇春. 新疆大学, 2016(06)
- [4]新疆地区虫媒病毒调查研究状况[J]. 寇春,段晓梅,张渝疆,孙素荣. 中国人兽共患病学报, 2016(03)
- [5]新疆出血热病毒实时荧光RT-PCR检测方法的假病毒阳性对照品制备[J]. 郑夔,袁帅,黎东红,丁国允,李小波,师永霞,戴俊,黄吉城. 华南预防医学, 2016(01)
- [6]乙脑病毒时空动力学分析[D]. 高晓艳. 中国疾病预防控制中心, 2013(12)
- [7]脑炎/脑膜炎及出血热病原体多重PCR-Mass ARRAY检测技术的建立[D]. 王晓宏. 陕西师范大学, 2012(02)
- [8]青藏高原（青海省）蚊虫和蚊传虫媒病毒及其与当地疾病关系的研究[D]. 李文娟. 山东大学, 2011(11)
- [9]山东省蚊虫及蚊传虫媒病毒分布研究[D]. 陈维欣. 山东大学, 2011(04)
- [10]新发与再发虫媒病毒病[A]. 方美玉,黄平. 新发和再发传染病防治热点研讨会论文集, 2010