一、检测马立克病毒新方法（论文文献综述）
隋程吉[1]（2020）在《基于WS2和C3N4的生物传感器检测5hmC的研究》文中进行了进一步梳理5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）是5-甲基胞嘧啶（5mC）经过TET蛋白氧化产生的,是5mC的羟基化形式。研究表明,5hmC在神经元细胞和胚胎干细胞中含量相对较高,表明其在哺乳动物胚胎发育、细胞核重编程、基因表达调控和癌症进展等方面发挥重要作用。作为去甲基化的中间产物,其在动植物的生命活动中发挥着至关重要的作用。因此,5hmC被视为DNA的第六碱基。但是,由于5hmC与5mC结构相似且在动植物中含量很低。因此,实现对其的检测需要较高的灵敏度与特异性。目前常用的检测5hmC的方法有单分子实时测序法、毛细管电泳法、高效液相色谱-质谱联用、薄层色谱法和荧光法等。尽管这些方法可以实现准确检测,但是仍然存在一些问题,比如需要大型精密仪器,操作步骤复杂,成本昂贵等。因此寻找操作简单,成本低廉,检测速度快,灵敏度高的检测是研究热点。本文利用WS2、MoS2/C3N4异质结、C3N4以及功能化的Fe3O4作为基底材料,并通过硼酸功能化碳点（B-CDs）、ZnO、二茂铁羧酸聚合物（PFc）和钌的衍生物（Ru）等实现信号扩增,构建了光电化学传感器和电致化学发光传感器完成对5hmC的检测。而且,我们还将制备的传感器应用于动植物体内5hmC含量的检测,为污染物对植物的生态毒理研究和动物疾病诊断研究提供新的思路和方法。（1）本研究以WS2纳米片为光电活性材料,以硼酸功能化碳点（B-CDs）为信号放大单元,研制了一种用于5hmC检测的新型光电生物传感器。这种生物传感器也可以用来对糖基转移酶（β-GT）活性进行评估。首先,将WS2纳米片和金纳米粒子（AuNPs）固定在ITO电极表面。接着,将探针DNA通过Au-S键固定在电极表面。然后,将含有5hmC的互补DNA杂交至修饰电极表面。随后,β-GT在5hmC的羟甲基位置引入糖基。经过糖基化后,B-CDs可以进一步固定在修饰电极表面,形成强光电流。此生物传感器具有良好的选择性、灵敏度和重现性,对于5hmC和β-GT的最低检出限位分别为0.00340 nM和0.0280 unit/mL。实验结果表明,此传感器不仅可用于5hmC和β-GT活性的检测,而且还可用于β-GT抑制剂的筛选。（2）基于ZnO对MoS2/C3N4异质结的光电流抑制作用,制备了一种新型的光电化学生物传感器实现对5hmC的检测。首先,以MoS2和C3N4为光电材料对ITO电极进行连续修饰,使其具有较强的光电流响应。接下来,5hmC的羟甲基（-CH2OH）被KRuO4氧化生成醛基（-CHO）,其中5hmC转化为5-甲酰基胞嘧啶（5fC）。然后,通过C3N4的氨基（-NH2）和5fC的醛基（-CHO）共价反应,可以在电极表面捕获5fC。最后,ZnO-PAMAM复合物共价连接在固定在电极的5fC磷酸基团上,其可以降低C3N4对MoS2的电子转移,降低光的吸收和消耗电子供体,从而导致光电流降低。在最佳条件下,0.01-200 nM浓度范围内光电流与5hmC浓度的对数呈线性关系,最低检出限为2.60 pM。该方法具有良好的选择性,可用于DNA中5hmC与5-甲基胞嘧啶（5mC）的鉴别。最后,利用光电生物传感器成功地研究了重金属离子(Cd2+)和植物激素（脱落酸、6-苄基嘌呤、3-吲哚乙酸）对水稻幼苗叶片中5hmC表达的影响。（3）本实验利用PFc对C3N4 ECL信号的抑制作用构建了一种用于5hmC检测的电致化学发光传感器。首先,以TiO2/MoS2/C3N4/GCE为基底电极（其中,C3N4为ECL活性材料,MoS2纳米片为助催化剂,TiO2为磷酸基捕获试剂）,在K2S2O8共反应试剂存在的情况下,基底电极获得较强的ECL信号。然后,在甲基转移酶（M.HhaI）的催化作用下,5hmC的-CH2OH与PFc的-SH发生共价反应,合成了5hmC和PFc复合物（5hmC-PFc）。最后,通过基底电极表面的TiO2与5hmC-PFc复合物的磷酸基团的特异性相互作用,5hmC-PFc被捕获在TiO2/MoS2/C3N4/GCE电极表面。在最佳条件下,5hmC在0.01-500 nM范围内,检出限为3.21 pM（S/N=3）。更重要的是,将5hmC与PFc的反应转移到溶液中进行,可以保持酶的高活性,确保5hmC的被捕获效率。此外,该生物传感器还成功应用于马立克氏病病毒感染的鸡胚成纤维细胞基因组DNA中5hmC的检测,为鸡马立克氏病的诊断提供新的方法。（4）本实验构建了一种基于巯基化的Fe3O4磁珠和5hmC特有的-CH2OH的共价化学反应的电致化学发光传感器用于5hmC的检测。首先制备了Fe3O4磁珠,并对其进行了改性引入-SH。然后,在M.HhaI的催化下,5hmC的-CH2OH与巯基化Fe3O4的-SH反应,在磁珠表面捕获5hmC。之后,通过一系列反应,钌的衍生物（Ru（bpy）2（phen-5-NH2）（PF6）2）（Ru）进一步固定在磁珠表面。而且,这些反应都转移到溶液中进行,保证生物分子活性,从而确保反应的充分进行。最后,通过Ru的引入产生ECL信号。5hmC浓度与ECL信号强度在0.01-500 nM范围内呈良好的线性关系,检出限为2.86 pM（S/N=3）。此外,我们还用该方法研究了J亚型禽白血病病毒感染的鸡胚成纤维细胞基因组DNA中5hmC含量的变化。
向华[2]（2018）在《可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究》文中研究指明禽白血病病毒（Avian leucosis virus,ALV）、马立克病病毒（Marerk’s disease virus,MDV）、传染性法氏囊病病毒（Infectious butsal disease virus,IBDV）是引发家禽免疫抑制病的主要病毒性病原。新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）、禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）、传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus,ILTV）是引发家禽呼吸道疾病的重要病毒性病原。由于传统的诊断检测方法难以进行多病原或多病原型的联合检测,使生产上发生的同类型疫病短时间内难以鉴别。考虑到家禽疫病防控急需,基于上述六种病原的高通量同步检测和部分病原同步分型检测方法尚未见报道。本研究结合金标银染显色技术,构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检可视化基因芯片,对芯片的制备及检测过程进行条件优化,并对临床初步应用进行评价。研究主要结果如下:一、ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价1.ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建与检测条件优化。以ALV、MDV、IBDV的全基因组为模板,克隆得到ALV-ENV、MDV-MEQ及IBDV-VP2基因序列,设计寡核苷酸探针,成功制备ALV-MDV-IBDV-AIV-NDV-ILTV共检基因芯片（简称共检芯片Ⅰ）。对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现寡核苷酸探针最优使用浓度为50μmol/L,40℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的使用浓度为4μg/mL,染色时间为5min,对阳性标本最终银染显色可见明显检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。芯片检测特异性试验显示,ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV之间无交叉反应,特异性好,且以IBV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅰ杂交;敏感性试验显示,芯片的最低检测浓度是1pg/μl。稳定性试验发现,基因芯片能在常温条件下进行有效保存不少于60 d,4℃条件下保存不少于75 d。二、禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价1.H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片构建与检测条件优化。以H5N6、H7N9和H9N2禽流感病毒毒株的全基因组,以及合成制备的H5N1毒株的NA保守序列片段,克隆得到H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA和N2-NA共6个靶基因,并成功制备出H5-H7-H9-N1-N9-N2共检基因芯片（简称共检芯片Ⅱ）;对基因芯片的制备过程和检测条件进行优化,发现使用浓度为50μmol/L的寡核苷酸探针与含有生物素标记的靶基因PCR产物45℃条件下杂交2h,Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液的最佳使用浓度为4μg/mL,银染7min,阳性标本银染显色可见明显的检测信号。2.对构建的此基因芯片进行质量评价。基因芯片的特异性试验显示芯片特异性高,无交叉反应,且以ALV、MDV、IBDV、NDV、IBV、ILTV为模板制备的PCR扩增标记不与共检芯片Ⅱ杂交;敏感性试验显示芯片的敏感性好,H5和N1亚型芯片的最低检测浓度是1×10-10ngul,H7亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,N9亚型检测芯片的最低检测浓度是1×10-7ngul,H9和N2亚型芯片的最低检测浓度是1×10-8ngul,均不同程度的高于RT-PCR检测技术;稳定性试验显示,本研究建立的可视化芯片4℃条件下可保存不少于90d。三、共检芯片Ⅰ和共检芯片Ⅱ的初步临床应用将本研究构建的两套基因芯片对四川安岳、彭州、泸州、广元、自贡、乐山、广汉、温江、重庆、山东等地区疑似患禽白血病、马立克病、传染性法氏囊病、禽流感、新城疫和传染性喉气管炎的155份临床送检样品进行检测,其中,六类禽病毒病基因芯片的检测结果为ALV、MDV、IBDV、NDV、AIV、ILTV的阳性检出率分别为7%、1.2%、0.6%、5.8%、14.8%、0%,其中混合感染ALV和AIV为4.5%,NDV和AIV为2.5%,ALV、MDV和IBDV为0.6%,ALV、AIV和NDV为1.2%,该检测方法的敏感性略高于PCR/RT-PCR检测方法,二者方法的符合率高于98%;H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型的同步共检芯片的检测结果为H5、H7、H9、N1、N9、N2的阳性检出率分别为4.3%、0%、43.4%、0%、34.7%、4.3%,其中H9N9亚型检出率为21.7%,H9N2亚型检出率为4.3%,H5和H9亚型共同感染检出率为4.3%,该检测方法与RT-PCR方法相比,敏感性为100%,特异性高于92.8%,符合率高于95.6%,对二者结果进行差方检验的Kappa值均>0.80,表明两种检测方法具有很好的一致性。综上,本研究成功构建ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV六种禽病毒病同步共检基因芯片和H5-H7-H9-N1-N9-N2六种禽流感病毒亚型同步共检基因芯片,两种基因芯片具备较好的特异性、灵敏性和稳定性,能有效应用于上述禽类疫病的临床样本检测,为此类禽疫病的快速鉴别诊检提供了新的先进手段。
朱娇娇[3]（2018）在《PI3K/Akt信号通路在MDV感染机制中的作用研究》文中进行了进一步梳理马立克氏病（Marek′s disease,MD）是由鸡的马立克氏病病毒（Marek′s disease virus,MDV）所引起鸡的一种淋巴组织增生性肿瘤病,具有较高的发病率和死亡率。随着MDV毒力的增强,其疫苗的免疫压力逐渐增大,不断有报道超强毒株能够突破现有疫苗CVI988的免疫保护,因此亟需研究MDV的致病机制以更有效的防治MD。PI3K/Akt信号转导通路作为细胞内重要的信号转导通路之一,在调控机体生物学活动方面发挥重要作用,尤其在多种病毒的感染过程中存在调控作用,但其在MDV感染中的研究还未见报道。因此,探索PI3K/Akt信号通路在MDV感染过程中能否被激活以及其在MDV感染过程中所发挥的作用,对于进一步揭示MDV的致病机制具有积极的意义。本研究所用病毒为马立克超强毒株Md5,将其体外感染CEF细胞,并利用荧光定量PCR方法从基因表达水平分析感染后不同时段的PI3K基因表达变化规律,结果显示,在感染MDV后CEF细胞内PI3K基因的表达量呈现上升趋势。接着,利用Western blot方法从蛋白质表达水平检测Akt磷酸化水平,我们发现,Akt的磷酸化水平在4 hpi（hours post-infection）显着升高,直至60 hpi仍能检测到较高水平的磷酸化Akt。LY294002作为PI3K的一种特异性抑制剂,用其处理细胞后再感染MDV,经Western blot检测发现,Akt磷酸化水平被显着性抑制。上述结果表明,PI3K/Akt信号通路在MDV体外感染CEF细胞的过程中被激活。为了明确PI3K/Akt信号转导通路对MDV复制增殖的影响,本研究将抑制接毒组细胞（即使用抑制剂LY294002作用后再感染MDV的CEF细胞）,与未使用抑制剂的正常接毒组细胞分别进行病毒滴度测定,结果显示,在感染后的不同时间段,抑制接毒组的病毒滴度均明显低于正常接毒组。为了进一步验证该结果,本研究建立起以Meq为靶基因的Real-time PCR检测方法,通过检测发现,抑制接毒组的Meq基因转录水平明显低于正常接毒组,综上表明,PI3K/Akt信号转导通路对MDV的复制增殖具有明显的促进作用。PI3K/Akt信号通路自身作用的发挥主要依赖于对下游多种因子活性的调控,因此本研究选取PI3K/Akt信号通路的下游关键因子进行检测。首先对MDV感染是否激活PI3K/Akt/GSK-3β通路进行Western blot测定,结果显示,MDV感染不同时段均检测到磷酸化的GSK-3β,且当抑制了PI3K/Akt信号通路时,磷酸化GSK-3β的蛋白表达水平明显下调,由此可知,MDV感染能够激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路。此外,我们利用荧光定量PCR技术观察PI3K/Akt下游关键因子GSK-3β、mTOR、p53、Bad表达量的变化规律。结果显示,抑制接毒组细胞内p53、mTOR的表达量与正常接毒组相比差异不显着。而GSK-3β与Bad基因的表达量则具有显着差异,且与正常接毒组相比,表现为显着上调。因此我们猜测,GSK-3β与Bad基因可能参与到MDV感染CEF细胞的病毒复制增殖过程中。该研究结果有利于进一步揭示病毒感染与宿主细胞的互作机制,有利于深入理解MDV的感染及致病机制,为MD的防控提供新的方法和思路。
高翔[4]（2017）在《家禽传染病时空特征与风险评估及基于WebGIS的监测预警系统的研究》文中研究说明据统计,对我国养禽业构成威胁和造成危害的传染性疾病已达80多种,我国家禽因传染性疾病导致的病死率15%20%,经济损失达数十亿元。家禽传染性疾病不仅阻碍了养殖业的发展,而且威胁着人类的健康。因此,近年来我国政府越来越重视对家禽传染性疾病的早期发现、早期控制。本研究的目的在于构建以网络地理技术（Web GIS）为基础的家禽传染病监测预警系统,实现对家禽传染性疾病数据的可视化展示、空间分析、应急管理、风险预测并形成各种统计图表。通过系统可以在疫情暴发前预测或在初期发现疫情,为有关部门尽早采取措施控制家禽传染性疾病提供科学依据。研究通过对全国1:400万电子矢量地图和遥感卫星测绘数据进行地理编辑,建立空间数据库。属性数据库则收集整理了2006.012015.12期间国家兽医局公布的各类家禽传染性疾病疫情信息以及国家气象局网站记录的各省气象数据。通过对多种数学方法进行学习评估,选取合适的分析模型对疾病时空流行特点进行提取。同时借鉴兽医流行病防控知识,对传统预测模型加以改造,建立针对家禽传染病的风险评估方程。最后,结合网络地理信息技术（Web GIS）技术与Arc GIS Sever二次开发软件,设计建立基于Web GIS的家禽传染性疾病监测预警系统。研究的具体内容包括:（1）通过季节性分析、时间序列分析方法,对我国家禽传染性疾病的分布特征进行描述。结果表明除禽流感因样本容量过小无法纳入分析外,兽医局公布的我国其它四种主要家禽传染性疾病包括禽霍乱、新城疫、马立克以及鸭瘟发病都存在明显的季节性并受上月发病数的影响。（2）通过局部自相关技术方法,对我国家禽传染性疾病的时空分布格局整体进行分析。结果表明我国家禽传染性疾病的发生存在空间自相关性;高-高聚集区主要集中在我国南方地区,同时整体传播范围有缩小的趋势。（3）通过构建零膨胀负二项模型,对气象因素与家禽传染性疾病发生之间的关系进行评估。结果表明气象因素确实影响家禽传染病的发生发展。气温较高、空气湿度较大、风速较小的气象通常是促进家禽传染性疾病发病的气候条件。同时,因素的滞后时间具有现实意义。（4）通过构建基于最大熵原理的生态位模型,对地理环境因素与禽流感发生发展之间的关系进行评估。结果表明所有土壤类型中主要以水域以及人类居住区与禽流感发生的关系最密切。同时,NDVI与地理高程（海拔）也与禽流感的发生表现出密切的关系。（5）利用Arc GIS二次开发与网络地理信息（Web GIS）技术,结合文中风险分析模型得到的结果,对家禽传染性疾病监测预警系统进行设计建设。系统最终完成疾病属性数据与地理空间数据的关联,信息管理功能与数学模型预测功能的关联,实现家禽传染性疾病信息紧急上报,时空监测、风险评估以及预测分析的功能。综上所述,本研究在国内首次利用季节分解模型、时间序列模型及局部自相关模型等时空分析技术对我国家禽传染性疾病分布的规律与特点进行了研究与探索;利用零膨胀负二项模型与最大熵模型数学风险评估方法,对气象、地理因素和家禽传染性疾病月发病相关关系进行了分析,找到影响家禽传染性疾病发生的主要风险因子,并论证了模型的有效性。最终,基于风险分析的结果并利用Arc GIS Server二次开发技术,初步建立了基于Web GIS的我国家禽传染性疾病监测预警系统,为我国动物疫病预警体系的建设提供了新思路与新方法。
赵朴[5]（2016）在《马立克氏病病毒miRNA的体内动态表达谱及对病毒基因的自我调控》文中提出血清1型马立克氏病病毒（Marek’s disease virus serotype 1,MDV-1）是致瘤性α-疱疹病毒,在鸡群中可引起以致死性T细胞淋巴瘤为特征的马立克氏病（Marek’s disease,MD）。虽然通过免疫接种可较好地控制MD,但MDV-1野毒分离株的毒力不断增强,并在免疫鸡群中引发MD,已给世界养禽业造成严重经济损失。作为典型的致瘤性病毒,MDV-1的感染也为研究疱疹病毒引起肿瘤的生物学、遗传学及免疫学提供了良好的动物模型。microRNA（miRNA）是一类新的基因表达调控子,在多数生物学过程中发挥重要的基因转录后调控作用。已有研究发现,在MDV-1的基因组中,14个miRNA前体基因,可加工成26个miRNA,并且集中分布于3个基因簇:Meq基因簇,Mid基因簇和LAT基因簇。目前,已有部分MDV-1 miRNA如miR-M4-5p、miR-M3-5p和miR-M7-5p被证明在MDV复制、潜伏、致病和/或致瘤过程中发挥重要调控作用。但对于其它大部分MDV-1 mi RNA,它们在MDV生物学中潜在的调控作用还不清楚。本研究首先系统分析MDV-1 miRNA在病毒感染宿主及MD淋巴瘤发生过程中的体内动态基因表达谱,并进一步研究MDV-1 miRNA对病毒基因的自我调控作用。本论文的研究内容和结果如下:1首先建立了检测4个MDV蛋白编码基因gB、ICP4、pp38、meq及全部26个病毒miRNA的实时荧光定量RT-PCR（realtime qRT-PCR）的方法,然后对MDV-1超强毒株GX0101感染宿主后3 d、7 d、14 d、21 d、30 d、45 d和60 d的体内动态基因表达谱进行了分析。结果表明,gB、ICP4、pp38、meq基因表达水平的第1个高峰出现在早期溶细胞感染阶段（7 dpi）,至潜伏阶段（14 dpi）下降,随后又上升,至晚期溶细胞感染阶段（21 dpi）达到高峰,但在转化与增生阶段（30–60 dpi）gB、ICP4和pp38的表达水平逐渐下降,但meq仍保持较高表达水平,这些结果与“Cornell Model”描述的MD疾病发展过程基本一致,表明GX0101感染宿主的动物实验是成功的。与gB、ICP4、pp38及meq基因的表达模式不同,依据26个MDV-1 miRNA在GX0101感染后的体内动态基因表达谱的差异,可将它们分为3类:第I类包括mi R-M4-5p、miR-M2-5p、miR-M2-3p等12个病毒miRNA,其表达水平自感染后即呈上升趋势,并在14–21 dpi达到第一个高峰,随后到30 dpi有所下降,然后在45–60 dpi又高水平表达,可能与MD致病过程中的潜伏、晚期裂解感染和/或肿瘤增生有关;另外12个miRNA如miR-M4-3p、miR-M7-5p和miR-M11-3p等组成第II类,尽管有些miRNA在45 dpi或60 dpi呈现稍微上升的趋势,但其中大部分miRNA攻毒后的前1-2周以高水平表达,随后以低水平表达,可能与MDV-1生活周期中的早期裂解感染和/或潜伏感染密切相关;第III类包括2个miRNA miR-M5-5p和miR-M5-5p,未表现出一致的表达特征。2利用生物信息学方法对病毒miRNA与MDV病毒基因组进行了预测分析,发现75个病毒蛋白编码基因中存在357个潜在的病毒miRNA结合靶位点。这些候选靶基因的功能涉及基因调节、转化、细胞凋亡、细胞周期控制、免疫调节、病毒复制与传播、蛋白磷酸化、DNA加工和修复等。本研究根据相关病毒基因功能及病毒miRNA的体内动态表达谱,优先选择了与蛋白磷酸化、DNA复制、基因调节和转化相关的候选靶基因10个,成功构建了11个miRNA前体表达载体和26个重组候选靶基因psiCHECKTM-2载体,然后共转染293T细胞,并利用双荧光素酶报告实验对30对候选靶基因3’-UTR靶点/mi RNA组合的相互作用分析,结果显示其中5对3’-UTR靶位点和miRNA组合（MDV025和miR-M4-5p、meq和mi R-M5-3p、meq和miR-M7-5p、meq和miR-M11-5p、meq和miR-M12-5p）中的病毒miRNA能够与对应的3’-UTR靶点相互作用。qRT-PCR进一步分析证实miR-M5-3p、miR-M7-5p、mi R-M11-5p和miR-M12-3p能够共同靶向调控MDV原癌基因meq的表达。综上所述,本研究系统揭示了MDV-1 mi RNA在病毒感染宿主的致病及淋巴瘤发展过程中的动态基因表达谱,为进一步评估和研究MDV-1 miRNA的功能提供了重要的线索。在此基础上,进一步研究证实miR-M5-3p、mi R-M7-5p、miR-M11-5p和miR-M12-3p能够共同靶向调节MDV最重要致瘤基因meq的表达,表明这些病毒miRNA在MEQ促进肿瘤形成的过程中可能发挥重要调节作用,为进一步揭示它们调控MDV感染并致瘤的分子机制奠定了重要基础。
李新[6]（2014）在《miR-26a和miR-181a在鸡马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制研究》文中认为miRNAs是一类高度保守的内源性非编码RNA,作为重要的转录后调节因子参与细胞增殖、细胞分化、细胞凋亡、免疫应答等多种生物过程。前期研究中,通过Solexa深度测序筛选得到多个与马立克氏病（MD）肿瘤形成相关的miRNA。本研究,选取上述试验中在肿瘤样本中显着下调的gga-miR-181a和gga-miR-26a作为研究对象,利用CCK-8和trans-well小室的方法检测gga-miR-181a和gga-miR-26a对MSB-1细胞增殖和迁移的影响。研究发现,MSB-1细胞过表达gga-miR-26a和gga-miR-181a后,MSB-1细胞增殖速度显着下调。同时,过表达gga-miR-26a和gga-miR-181a后,MSB-1细胞迁移能力也有所下降。该结果表明gga-miR-26a和gga-miR-181a;对马立克氏病肿瘤细胞的增殖和迁移具有抑制作用。为深入研究gga-miR-26a和gga-miR-181a在马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制,我们对gga-miR-26a和gga-miR-181a的靶基因进一步筛选验证。利用Targetscan和miRDB两个在线软件对gga-miR-26a和gga-miR-181a的靶基因进行生物预测分析,选定BTBD3、KIF3B、ANP32A、CNOT2等4个gga-miR-181a候选靶基因和NRC6B、NEK6、KPNA2、MAPK6、EZH2等5个gga-miR-26a候选靶基因进行双荧光素酶报告基因检测系统分析。研究发现,gga-miR-181a可显着抑制含KIF3B3’-UTR区、ANP32A3’-UTR区和BTBD33’-UTR的报告基因的活性,分别下调上述基因报告基因活性的20%、40%、15%。gga-miR-26a可显着抑伟JNEK63’-UTR区的报告基因活性,使其下调20%。说明gga-miR-181a与预测靶基因BTBD3、KIF3B、ANP32A之间存在相互作用,gga-miR-26a与NEK6基因间存在相互作用,可能参与肿瘤发生过程。研究进一步验证了上述miRNA靶基因的有效性。通过对MSB-1细胞进行转染处理,利用实时荧光定量PCR和western blot的方法测定细胞和组织样品中BTBD3、KIF3B、ANP32A和NEK6等4个预选靶基因的mRNA和蛋白表达情况。确定候选靶基因与miRNA之间的相互关系。结果表明,MSB-1细胞过表达gga-miR-26a后,NEK6的mRNA和蛋白表达显着下调。过表达gga-miR-181a后,ANP32A的mRNA和蛋白表达显着下调。此外,攻毒的肿瘤化脾脏和肝细胞淋巴瘤中ANP32A的mRNA表达水平显着高于对照组,而NEK6mRNA的表达水平呈增高的趋势,但差异不显着。两者与其相应靶基因的表达呈负相关趋势。综上可知,NEK6、ANP32A分别为gga-miR-26a和gga-miR-181a的直接靶基因。综上所述,本研究证明了gga-miR-26a和gga-miR-181a;对MSB-1细胞增殖和迁移具有抑制作用,同时,gga-miR-26a和gga-miR-181a通过对其靶基因NEK6、ANP32A的调控参与马立克氏病肿瘤形成过程。
叶染枫[7]（2012）在《八种禽类病毒基因芯片检测技术初步研究》文中进行了进一步梳理家禽养殖是我国畜牧业的重要支柱,随着养殖业的快速发展,各种禽类疾病特别是传染性的病毒疾病不断出现,严重的困扰着我国家禽养殖业的健康发展。新城疫、禽流感、禽传染性支气管炎、禽传染性法氏囊病、禽白血病、马立克氏病、禽痘以及减蛋综合症是禽养殖业中八种重要的病毒性疾病。建立这八种病毒的检测技术,来加强对这些病毒引起的禽病的流行动态及分布研究,对于有效的预防这些病毒性疾病,促进家禽养殖的健康发展,减少其经济损失具有极为重要的意义。DNA微阵列是上世纪90年代出现的一种基于核酸杂交的检测技术,具有具有高通量,快速,微量化,平行化等其他技术无法比拟的特点,被广泛的应用于致病微生物的快速诊断上。本论文希望针对这八种禽类病毒建立DNA微阵列检测技术,为禽病的防治和诊断提供有效手段和技术措施。本论文首先根据马立克氏病毒、禽痘病毒以及减蛋综合症病毒这三种DNA病毒的基因保守序列,设计引物,PCR扩增三种病毒基因保守片段并克隆后,将单酶切产物作为捕捉探针。将捕捉探针以高温烘烤结合紫外交联的方式固定在尼龙膜上。再通过多重PCR掺入Cy5-dCTP对待检标本中三种DNA病毒进行标记。与固定在尼龙膜上的捕捉探针进行杂交。杂交完毕后再用Odyssey近红外成像系统中检测结果。结果表明三种病毒检测灵敏度在104拷贝至105拷贝之间。该方法不仅可以对单一病毒进行检测,而且对两种病毒或三种病毒混合感染也能同步进行检测。再根据新城疫病毒、禽流感病毒、禽传染性支气管炎病毒、禽传染性法氏囊病毒、禽白血病病毒这五种RNA病毒的基因保守序列,设计引物,RT-PCR扩增五种病毒基因保守片段并克隆后,将单酶切产物作为捕捉探针。将捕捉探针以高温烘烤结合紫外交联的方式固定在尼龙膜上。再通过多重RT-PCR掺入Cy5-dCTP对待检标本中五种RNA病毒进行标记。与固定在尼龙膜上的捕捉探针进行杂交。杂交完毕后再用Odyssey近红外成像系统中检测结果。结果表明该方法不仅可以对单一病毒进行检测,而且对两种到五种病毒的混合感染也能同步进行检测。
孙亚妮[8]（2011）在《免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用》文中研究说明近几年来,随着饲养规模的扩大,禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症等肿瘤病的发病率越来越高,给养殖业带来巨大的经济损失,并且以前的流行病学调查发现,临床上三种肿瘤病的混合感染非常普遍,从而导致通过临床症状对这三种肿瘤病进行鉴别诊断非常困难,容易出现误诊。另外,目前该三种肿瘤病的实验室检测方法也存在许多不足之处。本研究结合免疫组织化学检测方法具有快速、特异性好、可鉴别诊断等优点,利用实验室保存的J亚群禽白血病病毒HN0001株、马立克氏病毒GX0101株和网状内皮组织增生症病毒SNV株分别攻毒1日龄SPF鸡,取攻毒后鸡的脏器,利用针对这三种病毒的单抗,分别建立这三种疾病的免疫组织化学检测方法;并且通过三种病毒共感染1日龄SPF鸡,对感染后不同周龄鸡的肝脏、肾脏和法氏囊等脏器进行HE染色和病理学观察,了解三种病毒共感染1日龄SPF鸡后不同脏器的动态病理学变化;同时通过免疫组化检测不同脏器内的病毒,研究三种病毒在不同脏器组织细胞内的动态分布,以及利用连续切片对病毒感染进行细胞定位,在同一视野下观察三种病毒是否能够感染同一个组织细胞。最后本研究利用建立的免疫组织化学方法,和特异性强的传统的病毒分离方法对来自北京、山东和河南部分养鸡场的肿瘤病死鸡进行了这三种病毒感染的调查,比较了两种检测方法在鸡肿瘤病诊断中的优缺点。1. J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立1.1 J亚群禽白血病免疫组织化学检测方法的建立J亚群禽白血病病毒HN0001株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周鸡只开始出现死亡,通过利用该病毒传统的实验室诊断技术IFA实验验证了HN0001成功感染鸡只。同时取病死鸡的不同脏器制作石蜡切片后,通过对免疫组化的关键步骤:抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、DAB显色时间等条件的优化,成功建立了ALV-J免疫组织化学检测方法。结果发现抗原修复采用柠檬酸盐缓冲液中92-98℃加热15min;过氧化氢消化为室温消化20-30min;DAB显色时间为室温下10min。ALV-J单克隆抗体JE9稀释比例为1:150,检测到的阳性染色主要出现在肝脏和法氏囊的胞核和胞浆中、脾脏的胞浆和肾脏的胞膜、胞浆中。1.2鸡马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立马立克氏病病毒GX0101株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第5周开始出现死亡,也利用IFA实验验证了GX0101成功感染鸡只。通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了MDV免疫组织化学染色方法。结果发现MDV单克隆抗体H19稀释比例为1:150,其它条件与ALV-J的方法一致;同时检测到阳性染色主要出现在肝脏、肾脏和法氏囊的胞核和胞浆、脾脏的胞浆中。1.3鸡网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立网状内皮组织增生症病毒SNV株腹腔攻毒1日龄SPF鸡,从攻毒后第4周开始出现死亡,也通过病毒分离实验验证了SNV株成功感染鸡只。同时也通过对抗原修复时间和方式、过氧化氢消化时间、一抗稀释比例、显色时间等条件的优化,成功建立了该病免疫组织化学染色方法。结果发现REV单克隆抗体11B118稀释比例为1:300,同样其他条件也与ALV-J的相同。可以从肝脏、肾脏、脾脏和法氏囊组织细胞的胞浆中观察到阳性染色。2.三种肿瘤病毒共感染SPF鸡的动态病理学观察本研究利用HN0001、GX0101和SNV株共感染1日龄SPF鸡,取感染后不同周龄鸡的脏器制作石蜡切片进行HE染色,了解三种病毒混合感染引起的鸡只不同脏器的动态病理学变化,同时利用建立的免疫组织化学方法研究三种病毒共感染鸡后在不同脏器组织细胞内的动态分布以及利用连续切片在同一视野下观察三种病毒能否感染同一组织细胞。三种病毒共感染1日龄SPF鸡后,每周剖杀3只鸡,取自然死亡和剖杀鸡只的肝脏、法氏囊和肾脏,制作石蜡切片,进行HE染色,观察其病理学变化,结果发现:肝脏:攻毒早期（1-42天）,肝细胞索并未消失,中期（42-120天）部分肝细胞索消失,到了攻毒晚期（120-180天）,肝细胞索基本全部消失。淋巴细胞浸润生长。随着肝细胞索的消失,肝脏上皮细胞胞核也发生溶解;肾脏:攻毒早期（1-42天）,肾小管上皮细胞萎缩,中期（42-120天）部分肾小管上皮细胞消失,到了攻毒晚期（120-180天）,大量上皮细胞发生崩解。法氏囊:攻毒后早期（1-42天）和中期（42-120天）,法氏囊滤泡未消失,滤泡髓质细胞部分发生崩解,攻毒晚期（120-180天）,法氏囊滤泡结构模糊,法氏囊滤泡髓质细胞几乎全部崩解。同时利用免疫组化方法检测三种病毒在感染后不同周龄鸡的脏器内分布发现,REV在感染后第7天首先在法氏囊被检测到;MDV和ALV-J在攻毒后第14天可以被检测到。对三种病毒在不同脏器内的动态分布研究发现:ALV-J阳性信号最早出现在肝脏中,随着感染日龄的增大,肝脏内阳性细胞的数量和阳性染色的深浅并没有发生显着变化,而法氏囊组织细胞内,随着日龄增大阳性细胞数量逐渐增多,染色也加深,肾脏中却是阳性细胞的数量变化不大,但是阳性染色随着感染日龄的增大而加深;REV阳性信号最早是出现在法氏囊中,并且随着感染日龄的增加,肝脏和法氏囊滤泡细胞和间质细胞内的阳性细胞数量发生一过性增多又降低,染色也是先加深又变浅,肾脏中阳性细胞数量和阳性染色随着感染日龄的增大而增加;MDV阳性信号与REV的一样,最早也是出现在法氏囊中,但是法氏囊滤泡细胞和间质细胞和肝脏内阳性细胞的数量随着感染日龄增加而增多,阳性染色深浅变化不大,而在肾脏中一直未发现阳性细胞。并且,阳性染色在细胞内出现的部位与单独感染时一致。利用连续组织切片,对三种病毒进行同视野观察发现,三种病毒共感染鸡后,可以共同感染脾脏和法氏囊的同一个组织细胞,还未发现可以感染肝脏和肾脏的同一组织细胞;而三种病毒可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏和法氏囊,不能感染同一只鸡的肾脏,REV和ALV-J可以感染同一只鸡的肝脏、脾脏、肾脏和法氏囊组织。3.中国部分地区肿瘤病死鸡三种肿瘤病毒的感染情况调查本实验收集了来自我国北京、山东和河南部分地区肿瘤病死鸡91只,利用特异性较强的IFA和免疫组化方法检测了J亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症的感染情况,比较了两种检测方法的优缺点。调查结果表明,肿瘤病死鸡中ALV-J的单独检出率最高,尤以北京地区最高,而MDV单独检出率则相对较低,REV位于两者之间,说明目前危害家禽的肿瘤病仍然是以J亚群禽白血病为主;同时发现,三种病毒的混合感染也是较为普遍的,其中ALV-J和REV的混合感染最为普遍,其次是MDV和REV,混合感染率较低的是MDV和ALV-J。免疫组化检测方法不仅可以观察脏器的病理学变化,而且还可以利用不同的单抗对三种疾病进行鉴别诊断,在临床病例的诊断中,这两者的结合可以更加有力的对疾病进行判断。另外,通过对临床肿瘤病料的显微病理学观察和三种肿瘤病毒的免疫组化检测发现,ALV-J引起肿瘤类型越来越复杂多样,不仅仅局限于以前的髓细胞瘤和肾瘤等,近期还出现了血管瘤、纤维肉瘤等新的类型。
于洋[9]（2010）在《蟾酥注射液的免疫调节作用及其预防马立克氏病的应用研究》文中研究表明病毒病和肿瘤病是严重危害人畜健康的重要疾病,而且在肿瘤病中有一部分是由病毒疾病引起的。目前的抗病毒和抗肿瘤药物具有许多副作用,因此,寻找更好疗效和更低毒副作用的治疗病毒病和肿瘤病的药物是医学工作者普遍关心的问题。中药资源丰富,疗效确实和低毒副作用,在治疗病毒病和肿瘤疾病上具有明显的优势。近几十年的研究表明,中医中药防治病毒性传染病的优势在于:（1）具有一定的广谱杀灭或抑制病毒的作用;（2）调动机体防御能力,调节机体的免疫功能;（3）用药安全,无明显毒副作用及无菌群失调、二重感染等弊端。现在有研究证明,中药蟾酥具有免疫调节、抗肿瘤、抗炎、局部麻醉、升压等作用,正是它的抗肿瘤与免疫调节方面等多种作用,决定了在临床应用方面有着重要的地位。蟾酥的化学成分复杂,具体具有免疫活性的成分和化学结构不清楚,给蟾酥中具有免疫活性的成分的研究带来重重困难,不利于在分子水平上来阐明它的作用机制,临床用药不好控制,药效不稳定,重复性低。近年来只是对蟾酥的免疫活性研究进行过一些报道,而且只是检测对免疫系统功能指标的影响,并未从分子水平上来研究其的作用机制。蟾酥注射液具有免疫增强作用,能够刺激体外脾淋巴细胞增殖,提高腹腔巨噬细胞能量代谢水平,提高NK细胞的杀伤能力。另外通过用ELISA方法检测蟾酥注射液对Th细胞分泌细胞因子的影响,发现蟾酥注射液能够明显促进Th1细胞因子（IL-2、IL-12、IFN-γ）和Th2细胞因子IL-4的分泌,同时降低IL-10细胞因子的分泌。此外蟾酥注射液能够提高CD4+ CD8—和CD4+ CD8—单阳性亚群细胞的比例,同时促进脾淋巴细胞进入DNA合成期S期。结果表明,蟾酥注射液具有免疫增强作用。目前研究发现,蟾酥注射液在不同剂量时,对脾细胞和腹腔巨噬细胞增殖作用明显,在协同LPS或者Con A刺激下,作用更加明显。蟾酥注射液够刺激脾淋巴细胞增殖,提示蟾酥注射液具有调节机体细胞免疫和体液免疫功能,但是结果表明对细胞免疫功能的调节作用更明显。这些结论与蟾酥注射液能够增加CD4+、CD8+细胞比例和细胞周期的结果相符。NK细胞是天然免疫系统的重要组成部分,在动物机体抗病毒和抗肿瘤方面发挥着重要作用。所以本试验检测了NK细胞的杀伤能力,结果表明蟾酥注射液具有显着增强NK细胞杀伤靶细胞Yac-1的功能。从以上结论中表明蟾酥注射液不仅能够增强获得性免疫反应,而且能够激活天然免疫反应。由于体内和体外存在一定的差异性,所以应该在体内试验上进一步证实蟾酥注射液具有提高细胞免疫和抗病毒的作用。蟾酥注射液作为中国的传统中药,对各种疾病的治疗作用已经得到国内外的认可。它的抗肿瘤和增强免疫功效的作用是世界公认的。但是全世界对蟾酥注射液的研究从未涉及抗病毒以及病毒引发的肿瘤方向上,这为今后对蟾酥注射液的开发和利用遗留了很多空白。无法让蟾酥注射液这一宝贵的中药资源为人类抗击各种疾病发挥作用。鸡马立克氏病（Marek’s Disease,MD）是由马立克氏病病毒（Marek’s diseasevirus,MDV）引起的一种淋巴细胞增生性传染病,通常以在各种器官和组织引起的单核细胞浸润为特征。目前,马立克氏病仍然是养禽业的重要威胁,疫苗虽然可以预防马立克氏病的发生,但免疫失败时有发生,导致本病的局部爆发。而且,鸡马立克氏病作为研究病毒性肿瘤发生、发展和免疫的重要动物模型,在兽医学、基础医学和比较肿瘤学的研究方面已经作出了重要的贡献。本课题着重研究了蟾酥注射液的体内抑制病毒作用。通过MD动物模型观察蟾酥注射液的体内抑制病毒作用。比较蟾酥注射液组和病毒对照组的发病率、死亡率、平均生存日期、肿瘤阳性率和体重的变化,评价药物的抑制病毒效果。试验结果显示,蟾酥注射液具有良好的抑制MDV的作用,保护率的结果显着高于病毒对照组。在肿瘤检出率上,蟾酥注射液的肿瘤阳性率也显着低于病毒对照组。说明,蟾酥注射液具有显着的抗肿瘤作用,表明蟾酥注射液能够显着促进机体免疫器官的发育,增强其抵抗力。本试验我们从特异性免疫因素、非特异性免疫因素、免疫细胞和免疫分子等方面研究了蟾酥注射液的免疫活性,为进一步研究蟾酥注射液对雏鸡感染马立克氏病病毒和有效的接种马立克氏疫苗,以及作为马立克疫苗的免疫佐剂研究具有指导意义,并为科学的组方和使用蟾酥免疫增强剂,更好的发挥免疫调节作用,提供了科学的试验依据。
陈欣虹[10]（2010）在《马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究》文中指出马立克氏病毒（Marek’s disease virus,MDV）属疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科,它是鸡的一种高度传染性肿瘤疾病——马立克氏病（MD）的病原,该病以外周神经以及性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单核性细胞浸润和肿瘤形成为特征。MDV致病机理非常复杂,病毒感染与肿瘤产生相互影响。MD是兽医学、基础科学及比较医学研究的良好材料。MDV致瘤机理是MDV的研究中最令人感兴趣的,且MD是动物癌症中第一个能用疫苗来预防的疾病,它已成为人类癌症的一个理想的研究模型。此外,MDV是严格的细胞结合毒,唯一可以获得感染性的、脱离细胞的带囊膜病毒的组织是羽毛囊上皮细胞（Feather follicle epithelium, FFE）,游离的有囊膜的病毒在FFE形成后,通过皮肤或羽屑释放到环境中,成为感染其他鸡的传染源。但病毒在皮肤羽囊上皮细胞中如何组装成完全病毒,病毒蛋白与宿主蛋白如何相互作用,目前仍知之甚少。本研究对感染MDV鸡皮肤和羽髓进行了蛋白组学分析,通过质谱鉴定了病毒感染后表达差异显着的蛋白和新出现的蛋白,并对这些蛋白进行了生物信息学分析。本文首次从蛋白水平上报导了鸡皮肤和羽髓对MDV感染的宿主应答,可望在分子水平为研究MDV游离病毒形成和病毒致病机理提供新的资料。1.雏鸡感染马立克氏病毒的临床观察与病理鉴定56只一日龄SPF雏鸡腹腔注射感染马立克氏病毒（MDV）超强毒株RB1B（RB1B-CEF 0.2mL,1000PFU）,对照组40只鸡注射同等体积DMEM培养基。从感染后7天起（7dpi）,每隔一周每组取4只鸡扑杀,采血分离血清、采集羽毛、皮肤及内脏等,冻存于-70℃。试验结果发现SPF鸡感染两周后开始出现可见临床症状如消瘦、毛色苍乱等,用PCR可以从羽毛扩增出病毒基因pp38；3周后有劈叉、瘫痪等现象,剖检可见脾、肾等内脏肿大,法氏囊萎缩；4-5周后症状更加明显,并陆续有鸡死亡,剖检可见多数鸡内脏产生肿瘤,病理切片显示皮肤及羽毛有淋巴细胞浸润,琼脂扩散实验证实感染鸡血清中产生了MDV抗体,羽毛中含MDV抗原。这些结果说明SPF鸡已成功感染MDV,并发展成马立克氏病（MD）,为进一步开展羽囊和皮肤蛋白质组学研究提供了条件。2.鸡羽髓蛋白二维电泳方法的建立禽类的羽髓是多种病毒复制、包装以及释放的部位。其取样十分方便,是研究病毒复制、基因表达及宿主应答等的良好样本。本研究从SPF鸡羽根挤出羽髓,并提取其蛋白进行二维电泳（two-dimensional electrophoresis,2-DE），对不同裂解液、IPG胶条pH值范围、一向等电聚焦（IEF）条件、二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）凝胶浓度、蛋白上样量、染色方法等进行优化。结果表明以400μg羽髓蛋白样品,用17cm, pH 5-8 IPG胶条进行2-DE,第一向IEF聚焦条件为8000V,60000伏特小时,第二向SDS-PAGE凝胶浓度为11%,胶体考染法染色时可获得图谱最佳。2-DE图谱经PDQuest8.0.1分析,可检测到700个以上蛋白点,不同鸡只来源样本间的匹配率大于92%。本研究建立了鸡羽髓蛋白重复性较好、分辨率较高的二维电泳方法,该方法的建立为利用蛋白质组学方法研究禽类病毒的致病机理及病毒与宿主的相互作用等提供了技术基础。3.马立克氏病毒感染鸡的羽髓差异蛋白质组学研究羽毛是细胞游离马立克病毒释放的部位,是感染其他鸡的传染源,同时也是检测马立克氏病毒非常方便的材料,但感染马立克氏病毒鸡羽髓中宿主基因表达的变化及对病毒感染的应答仍不清楚。本研究用SPF鸡人工感染马立克氏病毒超强毒RB1B株,感染后21天采集鸡羽毛,按第二章所述方法提取羽髓蛋白,以17cm,pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡羽髓蛋白为对照,使用PDQuest软件对二维电泳图谱分析,寻找表达差异蛋白。结果攻毒组和对照组之间表达差异大于两倍的蛋白点有41个,其中攻毒组表达上调的蛋白点25个,下调的蛋白点7个,新出现的蛋白点有9个。选取差异较大的25个斑点进行质谱鉴定,共成功鉴定了21个斑点,对应于20个蛋白。分别是：载脂蛋白AI（apolipoproteinAI）、免疫球蛋白λ链（Immunoglobulin lambda chain）、肌动蛋白胞浆5型（Actin, cytoplasmic type 5）、调宁蛋白-1（Calponin-1）、14-3-3 sigma（两个斑点均为该蛋白）、ATP合酶α亚基（ATP synthase alpha subunit）、S100钙结合蛋白A11（S100calcium binding protein A 11）、卵转铁蛋白前体（Ovotransferrin precursor）、磷酸丙糖异构酶1（triosephosphate isomerase 1, TPI1）、D样异质性胞核核糖核蛋白（RCJMB04291737 kDa protein）、癌蛋白18（STMN1 13 kDa protein）、蛋白酶体激活因子（PSMC6 46 kDa protein）、真核生物翻译起始因子5A （Eukaryotic translation initiation factor 5A-1）、电子传递黄素蛋白α链（ETFA 34 kDa protein）、硫氧还蛋白（TXN Thioredoxin）、丙酮酸激酶M2 （PKM2 58 kDa protein）、超氧化物歧化酶2（Superoxidedismutase, SOD2）、蛋白质酪氨酸磷酸酶（ACP1 Low molecular weight phosphotyrosine protein phosphatase）等。功能分析表明这些蛋白涉及到物质代谢、细胞骨架成分、细胞增殖相关及免疫相关等,差异最明显的蛋白是代谢相关蛋白（40%）和细胞增殖相关蛋白（25%）4.马立克氏病毒感染鸡皮肤蛋白质组学研究1日龄SPF雏鸡人工接种马立克氏病毒超强毒RB1B株,感染后28天取皮肤,二维电泳裂解液提取蛋白,以17cm, pH5-8的IPG胶条进行二维电泳,以未感染病毒的SPF鸡皮肤蛋白为对照,电泳图谱用PDQuest软件进行比对。结果共发现表达差异大于两倍的斑点23个,其中上调13个,下调3个,新出现7个。选取分辨清晰、差异显着的斑点20个进行质谱分析,共成功鉴定出16个斑点,对应于14个蛋白。其中三个上调斑点均鉴定为载脂蛋白AI（Apolipoprotein AI, Apo AI）,经蛋白翻译后修饰软件预测,Apo AI有潜在的磷酸化和糖基化位点,因此三个斑点应为Apo AI的不同修饰状态。此外,β2微球蛋白（β2-microglobulin, BMG）、磷酸甘油酸激酶（Phosphoglycerate kinase, PGK1）等13个为新增或上调表达蛋白；转甲状腺素蛋白（TTR 15Kd protein）为下调表达蛋白。经功能分析,这些蛋白分别属于免疫相关蛋白,调节蛋白,细胞骨架蛋白,代谢相关蛋白及转运蛋白等。为验证蛋白质组学中发现的不同蛋白表达差异,本研究在mRNA水平对部分差异蛋白进行了分析。以β-actin为内参,通过半定量RT-PCR测定了差异表达蛋白Apo AI及β2微球蛋白的mRNA水平,并通过Western blot测定了Apo AI的蛋白水平。结果证明攻毒组与对照组之间Apo AI及β2微球蛋白的mRNA水平、Apo AI蛋白水平均有显着性差异,该结果与2-DE一致,进一步证明,本研究的蛋白组学结果正确。本研究结果也提示马立克病毒感染后使皮肤产生炎症并有淋巴细胞浸润,可能正是因为这些蛋白的改变,使得细胞的代谢紊乱,细胞周期异常,导致皮肤病变及肿瘤细胞大量繁殖。本研究结果为进一步了解病毒的致病机理、传播、诊断及预防提供了基础资料。
二、检测马立克病毒新方法（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、检测马立克病毒新方法（论文提纲范文）
（1）基于WS2和C3N4的生物传感器检测5hmC的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 1 前言 |
| 1.1 表观遗传学 |
| 1.2 DNA羟甲基化 |
| 1.2.1 DNA羟甲基化概述 |
| 1.2.2 DNA羟甲基化检测技术 |
| 1.3 光电化学生物传感器 |
| 1.4 电致化学发光生物传感器 |
| 1.5 纳米材料信号扩增 |
| 1.6 本课题的提出以及主要研究内容 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器与试剂 |
| 2.1.1 仪器 |
| 2.1.2 试剂 |
| 2.1.3 实验中主要缓冲溶液的配置 |
| 2.2 试验方法 |
| 2.2.1 基于WS_2和碳量子点的光电化学传感器检测DNA羟甲基化 |
| 2.2.1.1 WS_2 纳米片的制备 |
| 2.2.1.2 AuNPs的制备 |
| 2.2.1.3 碳量子点的制备 |
| 2.2.1.4 电极预处理 |
| 2.2.1.5 传感器的构建 |
| 2.2.1.6 PEC信号检测 |
| 2.2.1.7 糖基转移酶活性抑制研究 |
| 2.2.2 基于ZnO对 MoS_2/C_3N_4 异质结的光电流抑制作用的光电化学传感器检测5hmC |
| 2.2.2.1 MoS_2 的制备 |
| 2.2.2.2 C_3N_4 的制备 |
| 2.2.2.3 ZnO-PAMAM的制备 |
| 2.2.2.45 hmC的预处理 |
| 2.2.2.5 ITO电极预处理 |
| 2.2.2.6 生物传感器的制备 |
| 2.2.2.7 光电化学信号检测 |
| 2.2.2.8 实际样品检测 |
| 2.2.3 基于二茂铁对C_3N_4 电致发光信号抑制作用的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 2.2.3.1 C_3N_4 的制备 |
| 2.2.3.2 MoS_2 的制备 |
| 2.2.3.3 TiO2 的制备 |
| 2.2.3.4 巯基功能化PFc的制备 |
| 2.2.3.5 电极的预处理 |
| 2.2.3.6 生物传感器的制备 |
| 2.2.3.7 ECL信号检测 |
| 2.2.3.8 实际样品中5hmC含量检测 |
| 2.2.4 基于功能化的Fe_3O_4 磁珠和共价化学反应的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 2.2.4.1 巯基修饰Fe_3O_4 的制备 |
| 2.2.4.2 电极的预处理 |
| 2.2.4.3 生物传感器的制备 |
| 2.2.4.4 ECL检测 |
| 2.2.4.5 实际样品检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 基于WS_2和碳量子点的光电化学传感器检测DNA羟甲基化 |
| 3.1.1 检测策略 |
| 3.1.2 材料的表征 |
| 3.1.3 可行性分析 |
| 3.1.4 条件优化 |
| 3.1.5 羟甲基化DNA检测性能 |
| 3.1.6 β-GT检测性能 |
| 3.2 基于ZnO对 MoS_2/C_3N_4 异质结的光电流抑制作用的光电化学传感器检测5hmC |
| 3.2.1 检测策略 |
| 3.2.2 材料的表征 |
| 3.2.3 实验可行性分析 |
| 3.2.4 条件优化 |
| 3.2.5 传感器的检测性能 |
| 3.2.6 实际样品的检测 |
| 3.3 基于二茂铁对C_3N_4 电致发光信号抑制作用的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 3.3.1 检测策略 |
| 3.3.2 材料的表征 |
| 3.3.3 不同修饰电极的交流阻抗图与ECL响应图 |
| 3.3.4 条件优化 |
| 3.3.5 传感器的检测性能 |
| 3.3.6 实际样品的检测 |
| 3.4 基于功能化的Fe_3O_4 磁珠和共价化学反应的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 3.4.1 检测策略 |
| 3.4.2 材料的表征 |
| 3.4.3 可行性分析 |
| 3.4.4 条件优化 |
| 3.4.5 传感器的检测性能 |
| 3.4.6 实际样品检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 基于WS_2和碳量子点的光电化学传感器检测DNA羟甲基化 |
| 4.2 基于ZnO对 MoS_2/C_3N_4 异质结的光电流抑制作用的光电化学传感器检测5hmC |
| 4.3 基于二茂铁对C_3N_4 电致发光信号抑制作用的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 4.4 基于功能化的Fe_3O_4 磁珠和共价化学反应的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 5 结论 |
| 5.1 基于WS_2和碳量子点的光电化学传感器检测DNA羟甲基化 |
| 5.2 基于ZnO对 MoS_2/C_3N_4 异质结的光电流抑制作用的光电化学传感器检测5hmC |
| 5.3 基于二茂铁对C_3N_4 电致发光信号抑制作用的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 5.4 基于功能化的Fe_3O_4 磁珠和共价化学反应的电致化学发光传感器检测5hmC |
| 6 创新之处 |
| 7 参考文献 |
| 8 致谢 |
| 9 攻读学位期间发表论文情况 |
（2）可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 主要缩写说明 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 六种禽类疫病及其病原学特征 |
| 1.1.1 禽白血病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.2 禽白血病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.3 马立克病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.4 马立克病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.5 传染性法氏囊病概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.6 鸡传染性法氏囊病的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.7 新城疫概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.8 新城疫的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.9 禽流感概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.10 禽流感的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.1.11 传染性喉气管炎概述及病原靶基因特征 |
| 1.1.12 传染性喉气管炎的发病机理、临床症状及危害 |
| 1.2 禽类病毒病诊断方法 |
| 1.3 基因芯片检测技术在禽类病原检测方面的研究进展 |
| 1.3.1 基因芯片检测技术的概述 |
| 1.3.2 基因芯片技术在禽类病原检测方面的应用 |
| 1.3.3 可视化基因芯片技术的起源及分类 |
| 1.3.4 可视化基因芯片技术在目前疾病诊断中的应用及展望 |
| 1.4 研究目的及意义 |
| 第二章 ALV-MDV-IBDV-NDV-AIV-ILTV共检基因芯片构建、检测条件优化和质量评价 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 生物材料 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 方法 |
| 2.2.1 引物的设计与合成 |
| 2.2.2 ALV-ENV、MDV-MEQ、IBDV-VP2靶基因的扩增及鉴定 |
| 2.2.3 靶基因的复苏及鉴定 |
| 2.2.4 寡核苷酸探针设计 |
| 2.2.5 可视化基因芯片的制备 |
| 2.2.6 可视化基因芯片的检测步骤 |
| 2.2.7 可视化基因芯片的条件优化 |
| 2.2.8 可视化基因芯片的质量评价 |
| 2.3 结果与分析 |
| 2.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 2.3.2 基因芯片制备的初检 |
| 2.3.3 可视化基因芯片的条件优化结果 |
| 2.3.4 可视化基因芯片的质量评价结果 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第三章 禽流感H5-H7-H9-N1-N9-N2六种亚型联合共检可视化基因芯片的构建、检测条件优化和质量评价 |
| 3.1 材料 |
| 3.1.1 生物材料 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 方法 |
| 3.2.1 H5-HA、H7-HA、H9-HA、N1-NA、N9-NA、N2-NA基因的克隆鉴定 |
| 3.2.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测 |
| 3.2.3 寡核苷酸探针设计与芯片制备 |
| 3.2.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的检测 |
| 3.2.5 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型可视化基因芯片的质量评价 |
| 3.3 结果与分析 |
| 3.3.1 靶基因的扩增、克隆及重组质粒菌复苏鉴定结果 |
| 3.3.2 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型靶基因特异性的检测结果 |
| 3.3.3 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片制备的初检 |
| 3.3.4 H5-H7-H9-N1-N9-N2亚型基因芯片的质量评价结果 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第四章 六种禽病毒病及禽流感分型的可视化共检基因芯片检测技术的临床应用 |
| 4.1 材料 |
| 4.1.1 生物材料 |
| 4.1.2 主要试剂和仪器 |
| 4.2 方法 |
| 4.2.1 临床样本核酸的提取及PCR扩增标记 |
| 4.2.2 阳性质粒的提取 |
| 4.2.3 可视化基因芯片的制备 |
| 4.2.4 PCR/RT-PCR和可视化基因芯片检测临床样本的比较 |
| 4.2.5 RT-PCR和可视化基因芯片检测禽流感病毒亚型的比较 |
| 4.3 结果与分析 |
| 4.3.1 PCR/RT-PCR检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.2 可视化基因芯片检测六种禽病毒病结果 |
| 4.3.3 两种检测六种禽病毒病方法的符合率 |
| 4.3.4 RT-PCR检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.5 可视化芯片检测禽流感H5、H7、H9、N1、N9、N2亚型结果 |
| 4.3.6 两种检测禽流感六种亚型方法的符合率 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 结论 |
| 全文创新点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简历 |
| 附录 |
（3）PI3K/Akt信号通路在MDV感染机制中的作用研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 英文缩略表 |
| 1 前言 |
| 1.1 马立克氏病研究进展 |
| 1.1.1 血清型与致病性 |
| 1.1.2 MDV基因组及病毒结构 |
| 1.1.3 致病机制研究 |
| 1.1.4 国内流行现状 |
| 1.2 PI3K/Akt信号通路的研究进展 |
| 1.2.1 PI3K的结构与功能 |
| 1.2.2 Akt的结构与功能 |
| 1.2.3 PI3K/Akt信号通路的分子生物学功能 |
| 1.2.4 PI3K/Akt信号通路与病毒感染 |
| 1.3 目的和意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 材料 |
| 2.1.1 细胞与毒株 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 MDV感染激活PI3K/Akt信号通路的研究 |
| 2.2.1 细胞制备 |
| 2.2.2 病毒培养及毒力测定 |
| 2.2.3 RNA提取及反转录 |
| 2.2.4 Real-timePCR检测MDV感染后PI3K基因的变化规律 |
| 2.2.5 Westernblot检测MDV感染激活PI3K/Akt信号通路 |
| 2.3 PI3K/Akt信号通路对MDV复制增殖的影响 |
| 2.3.1 病毒滴定测定 |
| 2.3.2 病毒DNA合成水平检测 |
| 2.4 PI3K/Akt信号通路下游相关因子检测 |
| 2.4.1 MDV感染激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路 |
| 2.4.2 Real-timePCR检测PI3K/Akt信号通路下游相关因子 |
| 3 结果 |
| 3.1 MDV感染CEF细胞观察及病毒感染力测定结果 |
| 3.2 MDV感染前后RNA提取和常规PCR结果 |
| 3.3 Real-timePCR检测MDV感染后PI3K基因的变化规律结果 |
| 3.4 不同浓度LY294002对CEF细胞毒性检测结果 |
| 3.5 BCA法测定蛋白浓度结果 |
| 3.6 Westernblot检测MDV感染激活PI3K/Akt信号通路结果 |
| 3.7 病毒滴度测定LY294002对MDV复制增殖的影响 |
| 3.8 病毒DNA合成水平检测LY294002对MDV复制增殖的影响 |
| 3.8.1 MDVMeq全基因扩增结果 |
| 3.8.2 标准曲线和溶解曲线 |
| 3.8.3 Real-timePCR检测LY294002对MDV复制增殖的影响 |
| 3.9 MDV感染激活PI3K/Akt/GSK-3β信号通路检测 |
| 3.10 Real-timePCR检测PI3K/Akt信号通路下游相关因子结果 |
| 3.10.1 常规PCR结果 |
| 3.10.2 Real-timePCR检测结果 |
| 4 讨论 |
| 4.1 MDV感染激活PI3K/Akt信号通路的研究 |
| 4.2 PI3K/Akt信号通路对MDV复制增殖的影响 |
| 4.3 PI3K/Akt信号通路下游相关因子检测 |
| 5 结论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 附录 |
（4）家禽传染病时空特征与风险评估及基于WebGIS的监测预警系统的研究（论文提纲范文）
| 摘要 英文摘要 1 引言 |
| 1.1 选题背景 |
| 1.2 GIS在传染性疾病监测预警系统中的应用 |
| 1.3 数学模型在传染病监测预警领域的应用 |
| 1.4 我国几种主要传染性禽病 |
| 1.5 研究意义与目的 |
| 1.6 研究方法内容与技术路线 2 我国家禽传染性疾病的时空分布特征研究 |
| 2.1 数据 |
| 2.2 分析方法 |
| 2.2.1 季节性及长期趋势分析 |
| 2.2.2 时间序列分析 |
| 2.2.3 空间聚集性分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 季节性及长期趋势分析 |
| 2.3.2 时间序列分析 |
| 2.3.3 空间分布特征分析 |
| 2.4 本章小结 3 我国家禽传染性疾病与气象相关因素研究 |
| 3.1 数据 |
| 3.2 分析方法 |
| 3.2.1 模型介绍 |
| 3.2.2 自变量的确定 |
| 3.2.3 模型评估 |
| 3.2.4 统计分析软件 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 气象因素的相关性分析 |
| 3.3.2 禽霍乱 |
| 3.3.3 新城疫 |
| 3.3.4 马立克 |
| 3.3.5 鸭瘟 |
| 3.3.6 模型评估 |
| 3.4 本章小结 4 我国禽流感与地理、环境因素相关关系研究 |
| 4.1 数据 |
| 4.2 分析方法 |
| 4.2.1 模型介绍 |
| 4.2.2 最大熵模型构建 |
| 4.2.3 最大熵模型评估 |
| 4.3 结果 |
| 4.3.1 Jackknife曲线 |
| 4.3.2 风险分析地图 |
| 4.3.3 模型评估 |
| 4.4 本章小结 5 基于WebGIS的家禽传染性疾病监测预警系统的设计与实现 |
| 5.1 预警系统需求分析 |
| 5.1.1 监测预警系统需求概述 |
| 5.1.2 监测预警系统建设目标 |
| 5.1.3 功能需求分析 |
| 5.1.4 用户角色分析 |
| 5.1.5 系统建设可行性分析 |
| 5.2 疾病WebGIS预警系统设计 |
| 5.2.1 监测预警系统的设计原则 |
| 5.2.2 监测预警系统的结构与组成 |
| 5.2.3 系统功能目标 |
| 5.3 系统数据库设计 |
| 5.3.1 空间数据库 |
| 5.3.2 属性数据库 |
| 5.3.3 图形数据库 |
| 5.3.4 模型库 |
| 5.4 系统模块实现 |
| 5.4.1 地图基本操作 |
| 5.4.2 紧急疫情管理 |
| 5.4.3 决策辅助 |
| 5.4.4 历史监测数据管理 |
| 5.4.5 用户管理 |
| 5.5 本章小结 6 讨论 |
| 6.1 我国家禽传染性疾病时空特征分析 |
| 6.2 我国家禽传染性疾病与气象因素相关性分析 |
| 6.3 我国家禽传染性疾病与地理环境风险因素相关性分析 |
| 6.4 家禽传染性疾病监测预警系统的设计 7 结论 致谢 参考文献 攻读博士学位期间发表的学术论文 |
（5）马立克氏病病毒miRNA的体内动态表达谱及对病毒基因的自我调控（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马立克氏病 |
| 1.2 MD的病原学 |
| 1.2.1 MDV及其分类 |
| 1.2.2 MDV的基因组 |
| 1.2.3 MDV编码的蛋白与功能 |
| 1.2.4 MDV生活周期及致病进程 |
| 1.2.5 MDV进化及毒力增强 |
| 1.3 MDV编码的miRNA及功能 |
| 1.3.1 病毒编码的miRNA概述 |
| 1.3.2 病毒miRNA的功能 |
| 1.3.3 MDV编码的miRNA |
| 1.4 本研究的目的和意义 |
| 第二章 MDV-1 miRNA在病毒感染及致瘤过程中的动态基因表达谱 |
| 2.1 材料和方法 |
| 2.1.1 毒株、菌株和SPF鸡胚 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 引物设计与合成 |
| 2.1.4 CEF制备 |
| 2.1.5 MDV的增殖及效价测定 |
| 2.1.6 动物攻毒实验 |
| 2.1.7 病料采集 |
| 2.1.8 RNA提取 |
| 2.1.9 去除基因组DNA |
| 2.1.10 Poly(A)加尾及cDNA合成 |
| 2.1.11 qPCR |
| 2.1.12 数据分析 |
| 2.2 结果与分析 |
| 2.2.1 MDV的增殖及攻毒实验结果 |
| 2.2.2 RNA提取结果 |
| 2.2.3 MDV-1 蛋白编码基因gB、ICP4、pp38和meq的相对表达水平 |
| 2.2.4 26个MDV-1 miRNA的体内动态基因表达谱 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 MDV-1 miRNA对MDV蛋白编码基因的自我调控作用 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.1.1 软件和数据库 |
| 3.1.2 miRNA候选靶基因的预测方法 |
| 3.1.3 毒株、细胞和载体 |
| 3.1.4 主要试剂 |
| 3.1.5 引物设计与合成 |
| 3.1.6 载体的构建与鉴定 |
| 3.1.7 双荧光素酶报告实验 |
| 3.1.8 MDV感染CEF及样品采集 |
| 3.1.9 RNA提取 |
| 3.1.10 cDNA合成 |
| 3.1.11 qPCR |
| 3.1.12 数据分析 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.2.1 MDV-1 miRNA的病毒自身候选靶基因的预测分析结果 |
| 3.2.2 MDV-1 miRNA调控病毒自身靶基因的鉴定结果 |
| 3.2.3 MDV-1 miRNA对病毒靶基因的体内调控作用分析结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.3.1 RNAhybrid可有效用于MDV-1 miRNA的候选靶基因预测和分析 |
| 3.3.2 双荧光素酶报告实验是鉴定miRNA靶基因的有效方法 |
| 3.3.3 多个MDV-1 miRNA共同调节MDV-1 最重要致癌基因meq |
| 全文总结 |
| 创新 点 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（6）miR-26a和miR-181a在鸡马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 目录 |
| 主要缩略词表 |
| 引言 |
| 本研究的目的与意义 |
| 总体试验设计与技术路线 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 马立克氏病概述 |
| 1.1.1 马立克氏病病毒 |
| 1.1.2 马立克病感染阶段 |
| 1.1.3 马立克氏病与miRNA |
| 1.2 miRNA研究概述 |
| 1.2.1 miRNA的生成与作用机制 |
| 1.2.2 miRNA的特征 |
| 1.2.3 miRNA的功能 |
| 1.2.4 miRNA靶基因预测验证 |
| 1.3 miRNA-181a研究概述 |
| 1.3.1 miR-181a与组织器官发育 |
| 1.3.2 miR-181a与血细胞生成 |
| 1.3.3 miR-181a与固体肿瘤 |
| 1.3.4 miR-181a与血液肿瘤 |
| 1.3.5 miR-181a与自身免疫紊乱 |
| 1.4 miRNA-26a研究概述 |
| 1.4.1 miRNA-26a的抑癌作用 |
| 1.4.2 miRNA-26a的其他作用 |
| 第二章 miRNA对马立克氏病肿瘤细胞增殖和迁移影响研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料和方法 |
| 2.2.1 试验细胞系 |
| 2.2.2 主要试剂及药品 |
| 2.2.3 主要仪器设备 |
| 2.2.4 主要试剂配置 |
| 2.2.5 试验方法与流程 |
| 2.2.6 数据分析 |
| 2.3 结果 |
| 2.3.1 细胞增殖试验结果 |
| 2.3.2 细胞迁移试验结果 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 miRNA靶基因筛选与体外验证 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料和方法 |
| 3.2.1 试验样本 |
| 3.2.2 主要试剂及药品 |
| 3.2.3 主要仪器与设备 |
| 3.2.4 主要试剂配置 |
| 3.2.5 引物设计与合成 |
| 3.2.6 试验方法与流程 |
| 3.2.7 数据分析 |
| 3.3 结果 |
| 3.3.1 miRNA靶基因生物学预测 |
| 3.3.2 靶基因野生型载体构建 |
| 3.3.3 双荧光素酶试验 |
| 3.3.4 靶基因突变型载体构建 |
| 3.3.5 突变载体双荧光素酶试验 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 miRNA对靶基因表达的影响 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料和方法 |
| 4.2.1 试验样本 |
| 4.2.2 主要试剂及药品 |
| 4.2.3 主要仪器与设备 |
| 4.2.4 主要试剂配置 |
| 4.2.5 蛋白抗体 |
| 4.2.6 引物设计与合成 |
| 4.2.7 Western Blot相关试剂配制 |
| 4.2.8 试验方法与流程 |
| 4.2.9 数据分析 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 总RNA质量检测 |
| 4.3.2 细胞总蛋白抽提测定 |
| 4.3.3 细胞和组织样品cDNA质量检测 |
| 4.3.4 miRNA对MSB-1细胞中靶基因mRNA表达的影响 |
| 4.3.5 miRNA对MSB-1细胞中靶基因蛋白表达的影响 |
| 4.3.6 miRNA对MSB-1组织中靶基因mRNA表达的影响 |
| 4.4 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 5.1 gga-miR-26a与马立克氏病肿瘤形成 |
| 5.2 gga-miR-181a与马立克氏病肿瘤形成 |
| 第六章 结论 |
| 6.1 结论 |
| 6.2 创新点 |
| 6.3 展望 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）八种禽类病毒基因芯片检测技术初步研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第一章 家禽养殖中八种重要病毒性疾病及检测技术 |
| 1 禽流感及检测技术 |
| 2 新城疫及检测技术 |
| 3 禽痘及检测技术 |
| 4 马立克氏病及检测技术 |
| 5 禽白血病及检测技术 |
| 6 禽传染性法氏囊病及检测技术 |
| 7 禽传染性支气管炎病毒及检测方法研究进展 |
| 8 减蛋综合征病毒及检测方法研究进展 |
| 第二章 基因芯片技术及其在病毒性疾病中的应用 |
| 1 基因芯片技术简介 |
| 2 基因芯片技术在DNA病毒检测中的应用 |
| 3 基因芯片技术在RNA病毒检测中的应用 |
| 第三章 DNA微阵列同步检测马立克氏病毒、禽痘病毒、减蛋综合症病毒研究 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒和主要试剂 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒增殖 |
| 1.4 病毒核酸提取 |
| 1.5 PCR扩增MDV、EDSV-76、APV目的片段 |
| 1.6 目的基因的克隆 |
| 1.7 三重PCR标记三种DNA病毒 |
| 1.8 对照 |
| 1.9 捕捉探针的制备 |
| 1.10 芯片制备 |
| 1.11 结果读取 |
| 2 结果 |
| 2.1 PCR扩增结果及酶切鉴定 |
| 2.2 多重PCR检测结果 |
| 2.3 固定三种DNA病毒捕捉探针量的优化 |
| 2.4 三种DNA病毒芯片制备 |
| 2.5 三种DNA芯片灵敏度测定 |
| 3 讨论 |
| 第四章 DNA微阵列同步检测新城疫病毒、禽流感病毒、禽支气管炎病毒、禽法氏囊病毒、禽白血病病毒 |
| 摘要 |
| 1 材料和方法 |
| 1.1 病毒和主要试剂 |
| 1.2 引物设计与合成 |
| 1.3 病毒增殖 |
| 1.4 病毒核酸提取 |
| 1.5 RT-PCR扩增NDV、AIV、IBDV、IBV、ALV目的片段 |
| 1.6 目的基因的克隆 |
| 1.7 五重RT-PCR标记RNA病毒 |
| 1.8 对照 |
| 1.9 捕捉探针的制备 |
| 1.10 芯片制备 |
| 1.11 结果读取 |
| 2 结果 |
| 2.1 RT-PCR扩增结果及酶切鉴定 |
| 2.2 多种RT-PCR检测结果 |
| 2.3 固定五种RNA病毒捕捉探针量的优化 |
| 2.4 五种RNA病毒芯片制备 |
| 3 讨论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 在校期间发表的和待发的论文、科研成果等 |
| 致谢 |
（8）免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 1.1 禽白血病的研究进展 |
| 1.1.1 病原学 |
| 1.1.2 禽白血病病毒的细胞培养 |
| 1.1.3 流行病学 |
| 1.1.4 临床症状和病理变化 |
| 1.1.4.1 临床症状 |
| 1.1.4.2 病理变化 |
| 1.1.5 发病机理 |
| 1.1.6 禽白血病的诊断 |
| 1.1.7 禽白血病的预防和控制 |
| 1.1.7.1 加强种鸡群的监控 |
| 1.1.7.2 保持种鸡群对ALV 的高度洁净状态 |
| 1.1.7.3 强化弱毒疫苗中ALV 污染的检测和监控 |
| 1.2 马立克氏病的研究进展 |
| 1.2.1 病原学 |
| 1.2.2 流行病学 |
| 1.2.3 临床症状和病理变化 |
| 1.2.4 致病机理 |
| 1.2.4.1 病毒复制和早期溶细胞性感染期 |
| 1.2.4.2 潜伏感染期 |
| 1.2.4.3 转化和肿瘤形成 |
| 1.2.5 诊断技术 |
| 1.2.5.1 病毒分离 |
| 1.2.5.2 病毒抗原的检测 |
| 1.2.5.3 聚合酶链反应（PCR）技术 |
| 1.2.5.4 DNA 探针技术 |
| 1.2.5.5 病理学诊断 |
| 1.2.6 防治策略 |
| 1.3 网状内皮组织增生症的研究进展 |
| 1.3.1 病原学 |
| 1.3.2 流行病学 |
| 1.3.3 诊断技术 |
| 1.3.4 REV 感染的鉴别诊断 |
| 1.3.4.1 临床诊断 |
| 1.3.4.2 病毒分离与鉴定 |
| 1.3.4.3 血清学检测 |
| 1.3.4.4 病理学检查 |
| 1.3.4.5 鉴别诊断 |
| 1.3.5 防控策略 |
| 1.4 免疫组织化学技术 |
| 1.4.1 概念 |
| 1.4.2 免疫组织化学技术的分类 |
| 1.4.3 免疫组化的判断标准 |
| 1.4.4 免疫组织化学技术在人类肿瘤病理诊断中的应用 |
| 1.4.4.1 肿瘤的诊断与鉴别诊断 |
| 1.4.4.2 确定原发性肿瘤的组织来源和转移性恶性肿瘤的原发部位 |
| 1.4.4.3 对某类肿瘤进行进一步的病理分型 |
| 1.4.4.4 在肿瘤分期上的应用 |
| 1.4.4.5 发现微小病灶 |
| 1.4.4.6 为临床治疗方案的选择和肿瘤的预后提供依据 |
| 1.4.5 免疫组织化学技术在兽医学诊断中的应用 |
| 1.4.5.1 对组织中常规或特殊病原的检测 |
| 1.4.5.2 病原在机体的定位 |
| 1.4.5.3 病原在机体的动态分布研究 |
| 1.4.5.4 新病原的发现 |
| 1.4.5.5 活体动物中病原的检测 |
| 1.5 本研究的目的及意义 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 2.1.1 材料 |
| 2.1.1.1 病毒及单抗来源 |
| 2.1.1.2 主要试剂 |
| 2.1.1.3 主要仪器 |
| 2.1.1.4 主要试剂的配制 |
| 2.1.2 试验方法 |
| 2.1.2.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立 |
| 2.1.2.2 马立克氏病免疫组织化学检测方法的建立 |
| 2.1.2.3 网状内皮组织增生症免疫组织化学检测方法的建立 |
| 2.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 2.2.1 材料 |
| 2.2.1.1 病毒及单抗来源 |
| 2.2.1.2 主要试剂 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.2.2.1 病毒扩增 |
| 2.2.2.2 病毒的定量 |
| 2.2.2.3 实验动物及攻毒 |
| 2.2.2.4 病毒分离 |
| 2.2.2.5 石蜡切片的制备 |
| 2.2.2.6 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 2.2.2.7 病理学观察 |
| 2.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 2.3.1 材料与方法 |
| 2.3.1.1 材料 |
| 2.3.1.1.1 病料来源 |
| 2.3.1.1.2 主要试剂 |
| 2.3.1.1.3 主要仪器 |
| 2.3.1.2 试验方法 |
| 2.3.1.2.1 病毒分离 |
| 2.3.1.2.2 石蜡切片的制备 |
| 2.3.1.2.3 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 2.3.1.2.4 免疫组化检测 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.1 J 亚群禽白血病免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.1.1 病毒扩增 |
| 3.1.1.2 病毒TCID50 的测定 |
| 3.1.1.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.1.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.1.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.1.2 马立克氏病免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.2.1 病毒扩增 |
| 3.1.2.2 病毒的定量 |
| 3.1.2.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.2.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.2.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.1.3 网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 3.1.3.1 病毒扩增 |
| 3.1.3.2 病毒的定量 |
| 3.1.3.3 实验动物及攻毒 |
| 3.1.3.4 间接免疫荧光（IFA） |
| 3.1.3.5 免疫组织化学染色方法的建立 |
| 3.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 3.2.1 病毒扩增 |
| 3.2.2 病毒的定量 |
| 3.2.3 实验动物及攻毒 |
| 3.2.4 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 3.2.5 病理学观察 |
| 3.2.5.1 三种病毒在组织细胞内的动态变化 |
| 3.2.5.2 三种病毒对同一组织细胞的感染情况 |
| 3.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 3.3.1 病毒分离 |
| 3.3.2 HE（苏木精-伊红）染色 |
| 3.3.3 免疫组化检测 |
| 4 讨论 |
| 4.1 J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症免疫组化检测方法的建立 |
| 4.2 三种肿瘤病毒共感染SPF 鸡的动态病理学观察 |
| 4.3 中国部分地区J 亚群禽白血病、马立克氏病和网状内皮组织增生症感染率调查 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表论文情况 |
| 博士学位论文内容简介及自评 |
（9）蟾酥注射液的免疫调节作用及其预防马立克氏病的应用研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一篇 文献综述 |
| 第一章 中药免疫机理概述及中药蟾酥药理作用研究进展 |
| 1 中药免疫机理概述 |
| 2 蟾酥 |
| 3 蟾酥的化学成分 |
| 4 蟾酥的药理作用 |
| 第二章 癌症和炎症相关细胞因子研究进展 |
| 1 炎症反应和肿瘤形成的关系 |
| 2 主要炎性细胞因子 |
| 3 IL-6 与癌症 |
| 4 其他的细胞因子 |
| 5 血管源性细胞因子 |
| 6 化学增活素 |
| 7 细胞因子是癌症治疗的靶点之一 |
| 8 结论 |
| 第三章 鸡马立克氏病研究进展 |
| 1 病毒特征及感染方式 |
| 2 病理变化 |
| 3 马立克氏病的防治 |
| 4 小结 |
| 第二篇 研究内容 |
| 第一章 蟾酥注射液对小鼠主要免疫活性细胞的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第二章 蟾酥注射液对T 淋巴细胞分泌细胞因子、膜表面标志和周期的影响 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第三章 蟾酥注射液对马立克氏病疫苗的保护作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 第四章 蟾酥注射液对马立克氏病的预防作用 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（10）马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 中英对照缩略词 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 马立克氏病(Marek’s Disease,MD)及马立克氏病病毒(MDV)概况 |
| 参考文献 |
| 综述二 MDV致病因子及致病机理研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述三 蛋白质组学的研究和应用 |
| 参考文献 |
| 第二部分 研究内容 |
| 第一章 雏鸡接种马立克病毒及攻毒后病毒分离与病理鉴定 |
| 摘要 |
| 1. 主要试剂与仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第二章 SPF鸡羽髓蛋白双向电泳方法的建立 |
| 摘要 |
| 1. 主要仪器与设备 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第三章 感染马立克病毒的鸡羽髓蛋白质组分析 |
| 摘要 |
| 1. 主要试剂与仪器设备 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 第四章 感染马立克病毒鸡皮肤蛋白质组差异表达分析 |
| 摘要 |
| 1. 主要试剂与仪器 |
| 2. 方法 |
| 3. 结果 |
| 4. 讨论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士期间发表论文 |
四、检测马立克病毒新方法（论文参考文献）
- [1]基于WS2和C3N4的生物传感器检测5hmC的研究[D]. 隋程吉. 山东农业大学, 2020
- [2]可视化同步共检六种禽传染病基因芯片检测技术研究[D]. 向华. 四川农业大学, 2018(02)
- [3]PI3K/Akt信号通路在MDV感染机制中的作用研究[D]. 朱娇娇. 华南农业大学, 2018(08)
- [4]家禽传染病时空特征与风险评估及基于WebGIS的监测预警系统的研究[D]. 高翔. 东北农业大学, 2017(04)
- [5]马立克氏病病毒miRNA的体内动态表达谱及对病毒基因的自我调控[D]. 赵朴. 西北农林科技大学, 2016(08)
- [6]miR-26a和miR-181a在鸡马立克氏病肿瘤形成过程中的作用机制研究[D]. 李新. 中国农业大学, 2014(08)
- [7]八种禽类病毒基因芯片检测技术初步研究[D]. 叶染枫. 华中师范大学, 2012(11)
- [8]免疫组织化学技术在鸡三种病毒性肿瘤病鉴别诊断中的应用[D]. 孙亚妮. 山东农业大学, 2011(08)
- [9]蟾酥注射液的免疫调节作用及其预防马立克氏病的应用研究[D]. 于洋. 吉林大学, 2010(05)
- [10]马立克氏病毒感染鸡羽髓及皮肤蛋白质组学研究[D]. 陈欣虹. 扬州大学, 2010(11)