一、FasL抗体对人白血病细胞株(K562/ADM)多柔比星耐药性的逆转作用（论文文献综述）
于海涛,付明娟[1]（2019）在《中药逆转肿瘤多药耐药性的研究进展》文中指出在肿瘤化疗过程中多药耐药性（Multidrug resistance,MDR）是一大难题,也是导致化疗失败的主要原因。MDR的形成是多方面原因导致的。克服多药耐药性,提高化疗药物的疗效成为当今肿瘤研究的主要课题。目前很多西药在逆转耐药性方面多针对单一机制入手,而且其不良反应却很大,在临床应用中有很大的局限性。中药在治疗肿瘤方面越来越得到广泛的应用,因其具有多途径、多环节、多靶点的特点,不仅能明显提高化疗药物的细胞毒作用而且在逆转肿瘤多药耐药性方面的作用也越来越突出。本文从MDR机制入手,综述了近几年来一些单体中药及中药成方制剂逆转MDR的新进展。
柴冬亚[2]（2019）在《重楼皂苷Ⅰ逆转人乳腺癌细胞耐药的作用及机制研究》文中进行了进一步梳理[目的]课题组前期研究发现重楼皂苷Ⅰ（PPI）对MCF-7、MCF-7/ADM细胞具有明显的抑制作用。本研究拟检测重楼皂苷I的逆转耐药作用,初步探讨PPI逆转MCF-7/ADM细胞耐药的机制。检测PPI的溶血活性,了解其毒性作用。[方法]1.采用改良MTT法检测MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU的多药耐药性;选取低细胞浓度的PPI,测试其逆转MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU的耐药性作用;同时,检测MAPK信号通路抑制剂逆转MCF-7/ADM细胞对ADM的耐药作用。2.采用流式细胞术检测PPI联合ADM对MCF-7/ADM细胞凋亡的影响。3.采用荧光分光光度法检测PPI对MCF-7/ADM细胞内ADM蓄积的影响;并在荧光显微镜下观察细胞内ADM的荧光强度。4.采用 qPCR 法检测 MCF-7、MCF-7/ADM 细胞株中 ABCB1、ABCC1、ABCG2基因表达以及Western blot法检测两株细胞中MAPK信号通路相关蛋白、P-gp蛋白表达情况,确认MCF-7/ADM与MCF-7细胞在分子水平的差异性。5.采用Western blot法检测PPI作用于MCF-7/ADM细胞24、48 h后,对MAPK信号通路蛋白 ERK、P-ERK、JNK、P-JNK、p38、P-p38、以及 P-gp 蛋白表达的影响,以及MAPK信号通路抑制剂对上述蛋白表达的影响。6.采用荧光漂白恢复技术,使用激光共聚焦显微镜检测PPI对MCF-7/ADM细胞荧光漂白恢复率的影响,了解PPI对耐药细胞膜流动性的影响。7.采用比色法测定PPI的体外溶血作用。[结果]1.MCF-7/ADM细胞对ADM、DDP、5-FU均产生耐药性,耐药指数分别为304.43、2.00、7.63。2.PPI 0.3、1、2 μM（低细胞毒浓度）和VER 10μM分别与不同浓度ADM、DDP、5-FU联合,作用MCF-7/ADM细胞48 h后,对ADM的逆转倍数分别为4.67、2.30、32.73 和 29.83;对 DDP 的逆转倍数分别为 1.42、2.32、4.66 和 2.29;对5-FU的逆转倍数分别为2.23、2.69、121.32和1.25。p38通路抑制剂SB20358010、20、40、80μM,对 ADM 的逆转倍数分别为 1.96、3.51、4.64、4.77;JNK通路抑制剂SP600125 10、20、40 μM,对ADM的逆转倍数分别为1.25、1.86、1.82;ERK通路抑制剂U0126 10、20、40、80μM,对ADM的逆转倍数分别为 0.82、0.61、2.25、1.60。3.ADM 5μM 作用 MCF-7、MCF-7/ADM 细胞 48h 后,凋亡率分别为 85.13（P<0.01）、9.40%;对于MCF-7/ADM细胞,经PPI3μM作用后,凋亡率为18.17%（P<0.05）;PPI 与 ADM 联合作用,凋亡率上升至 25.87%（P<0.01）,ADM联合VER组,凋亡率为24.03%（P<0.01）。4.与ADM共培养3h,MCF-7细胞内ADM的荧光强度为359.63,显着高于MCF-7/ADM细胞内的荧光强度值56.34（P<0.01）;经PPI 15、45 μM作用3h后,MCF-7/ADM细胞内ADM蓄积增加,荧光强度分别为136.08（P<0.01）、209.63（P<0.01）,经 VER 10 μM 作用 3 h 后,荧光强度增加至 66.28（P<0.01）。5.与 MCF-7 细胞相比,MCF-7/ADM 细胞 ABCB1、ABCC1、ABCG2 基因均高表达,其基因相对表达量分别为4862.931（P<0.001）、1.524（P<0.01）、135.96（P<0.001）;MCF-7细胞P-gp、P-p38、P-ERK蛋白的相对表达量分别为0.19、0.61、0.62,显着低于MCF-7/ADM细胞蛋白的相对表达量3.23（P<0.001）、1.40（P<0.001）和 1.18（P<0.01）。6.经PPI 3μM作用MCF-7/ADM细胞24 h,ERK蛋白相对表达量由1.53上调至2.40（P<0.05）;作用48h,P-JNK蛋白相对表达量由1.90下调至0.87（P<0.01）。PPI与ADM联合作用24、48h后,P-gp蛋白表达量由3.01、2.72下调至 2.18（P<0.05）、1.96（P<0.001）;P-ERK 蛋白表达量由 1.94、1.29下调至1.08、0.91（均P<0.05）,P-JNK蛋白表达量由1.95、1.68下调至1.37（P<0.05）、0.7（P<0.001）。MAPK 信号通路抑制剂作用 MCF-7/ADM 细胞 48h,与 Control 组比较,ERK 通路抑制剂 U0126 40 μM,使 P-ERK、P-gp蛋白表达量由1.56、2.61下调至1.17、2.15（均P<0.05）;JNK通路抑制剂SP600125 20 μM,使 P-JNK、P-gp 蛋白表达量由 1.87、2.64 下调至 1.45、2.12（均P<0.05）;p38 通路抑制剂 SB203580 20 μM,使 P-p38、P-gp 蛋白表达量由1.27、2.91下调至0.84、2.46（均P<0.01）7.MCF-7/ADM细胞荧光漂白恢复率为43.52%,明显高于MCF-7细胞的荧光漂白恢复率 33.14%（P<0.05）。经 PPI 10 μM 作用 1 h 后,MCF-7/ADM 细胞的荧光漂白恢复率下降至26.80%（P<0.01）,提示膜流动性降低。8.PPI具有较强的溶血活性,其溶血的半数有效量（ED50）为4.26μM。[结论]1.MCF-7/ADM细胞对化疗药ADM、DDP、5-FU均有耐药性,且对ADM高度耐药,对5-FU中度耐药,对DDP低度耐药。耐药机制可能为:高表达膜转运蛋白P-gp,使药物在细胞内的蓄积明显减少,p38MAPK、ERK信号通路高度激活,细胞膜流动性增加。2.PPI低细胞毒浓度（0.3、1、3 μM）能逆转MCF-7/ADM对3种化疗药的耐药性,3 μM PPI逆转作用强于VER或与VER相当。逆转机制可能为:增加药物在细胞内的蓄积、直接或间接下调P-gp蛋白、抑制JNK、ERK信号通路激活、降低耐药细胞的膜流动性。3.PPI3μM与ADM联合,能诱导MCF-7/ADM凋亡,但与PPI单用差别不大,表明PPI逆转耐药的机制可能不是通过诱导凋亡实现的。4.PPI具有较强的体外溶血活性。
王俊敏,王慧杰,孙彦君,陈辉,郝志友[3]（2019）在《逆转肿瘤细胞多药耐药活性的天然产物研究进展》文中认为肿瘤细胞多药耐药是肿瘤化疗失败的主要原因,故寻找高效低毒的相关逆转剂是该领域急需解决的难题。体外实验被证明具有逆转肿瘤细胞多药耐药活性的化合物或生物制剂很多,但真正进入临床研究的只有异搏定、环孢菌素A等极少数,而且疗效不理想,近年来许多研究者将多药耐药逆转剂的研究转到低毒的天然产物,并从中发现具有相关作用的活性成分,本文将对此进行概述。
孙静[4]（2018）在《间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究》文中进行了进一步梳理研究背景和意义慢性粒细胞性白血病（chronic myeloid leukemia,CML）是以多能造血干细胞不受控制的增殖为特点的严重的血液系统恶性肿瘤。约有95%的CML患者表达具有酪氨酸激酶活性的BCR-ABL融合蛋白,异常的BCR-ABL酪氨酸激酶信号激活下游靶点,对细胞进行重新编程,使其异常增殖,导致髓样增生。因此,酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors,TKIs）成为慢性粒细胞性白血病分子靶向治疗的最有效药物。但是,随着TKIs药物的临床广泛使用,患者对TKIs出现耐受现象。叉头框蛋白O（forkhead box class O,FOXO）转录因子亚家族（FOXO1,FOXO3,FOXO4,FOXO6）作为PI3K-AKT信号级联通路的下游靶点。有研究结果显示FOXO3a可通过PI3K/AKT、ERK、JNK和P38信号通路介导抗肿瘤化学药物的作用效应,并能调控增强耐药基因mdr-1/P-gp的表达,在抗肿瘤药物的敏感性及耐受性中发挥着重要调控作用。脐带间充质干细胞（Human umbilical cord devrived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）来源于曾被作为医疗废弃物处理的脐带,无需侵入性手术获得,不存在伦理学问题,具有低免疫原性和良好的扩增能力,近几年来被广泛研究和使用。虽然UC-MSCs在肿瘤及其它疾病治疗领域的应用得到广泛研究,但有关UC-MSCs影响肿瘤细胞对化疗药物及分子靶向药物耐受的研究少见。综上所述,本课题拟建立人白血病K562伊马替尼耐药细胞株,研究其耐药性及可能的分子机制。从新鲜脐带组织分离、制备MSCs,通过表面分子标记和多向分化能力进行鉴定。通过UC-MSCs与伊马替尼耐药的K562细胞及亲本K562细胞共培养,研究UC-MSCs与白血病细胞的相互作用和对其药物敏感性的影响,探讨应用UC-MSCs逆转白血病耐药性的可能性及机制,为临床干预白血病靶向药物耐受性提供新的思路。研究内容及方法1.人白血病K562伊马替尼耐药细胞株的建立采用低浓度起始,长时间阶段性提高伊马替尼诱导浓度的方法诱导人白血病K562细胞获得耐药性（命名为K562/R细胞）,MTS法检测K562亲本细胞及K562/R细胞对伊马替尼的敏感性及细胞形态学的变化,以及对其他抗肿瘤药物的交叉耐药性。Western-blot法检测P-gp和BCR-ABL等的表达。流式细胞术检测伊马替尼作用下K562细胞和K562/R细胞的凋亡水平。2.UC-MSCs的原代分离、培养和鉴定取无菌新鲜人脐带组织,通过组织块贴壁法分离UC-MSCs。倒置显微镜下观察分离所获得细胞的形态是否符合MSCs的细胞形态,流式细胞术检测分离所获得细胞的表面分子标志。通过成脂、成骨和成神经元样细胞定向分化评价所制备的MSCs。3.UC-MSCs与白血病细胞共培养后耐药性改变及凋亡、耐药相关基因和蛋白变化将分离并鉴定的UC-MSCs与建立的K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养,以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。MTS法检测与UC-MSCs共培养48 h、72 h、96 h后,K562/R细胞和K562细胞对伊马替尼的敏感性变化。RT-PCR法检测共培养前后K562/R细胞和K562细胞耐药及凋亡相关基因mdr-1、CD44、FOXO3a、Bax、Caspase-3表达。Western-blot法检测共培养前后P-gp、CD44、FOXO3a、Bax、Caspase-3等蛋白表达。流式细胞术检测共培养细胞的凋亡率。4.UC-MSCs与白血病细胞共培养后细胞群中肿瘤干细胞含量变化将UC-MSCs与K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养,以单独培养的K562/R.细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。流式细胞术检测共培养前后K562/R细胞和K562细胞群体中肿瘤干细胞含量变化。5.短发夹RNA干扰沉默K562/R细胞FOXO3a基因表达构建针对FOXO3基因的短发夹RNA干扰质粒,HEK293T细胞中进行慢病毒包装,FOXO3慢病毒（sh-FOXO3）细胞感染K562/R细胞,筛选培养获得稳定沉默细胞（K562/R-shFOXO3）。MTS法检测细胞增殖活性及药物敏感性,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western-blot技术检测FOXO3a、P-gp和CD44的表达。6.与UC-MSCs共培养前后K562/R细胞内PI3K/AKT和MAPKs通路的变化将UC-MSCs与K562/R细胞和K562亲本细胞分别共培养后,以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为各自对照组细胞。Western-blot法检测共培养前后细胞内AKT、PI3K、p38、磷酸化p38、磷酸化ERK、磷酸化c-Jun、c-Abl和磷酸化c-Abl的蛋白表达变化。结果1.伊马替尼耐药性K562细胞株的建立及特性采用低浓度起始,长时间阶段性提高伊马替尼诱导浓度的方法诱导人白血病K562/R细胞,通过MTS法检测对伊马替尼的半数抑制浓度（IC50）,结果显示:伊马替尼作用24 h、48 h、72 h后,K562/R细胞的耐药倍数是K562细胞的64.22、40.52、31.58倍,且与ADM、PXL、MMC、THP、CHOEP、HHT、AMN107化疗药物均产生交叉耐受。伊马替尼作用K562和K562/R细胞24 h后,AnnexinⅤ-FITC和PI双染法示K562/R的凋亡率低于K562细胞,表明K562/R细胞对伊马替尼具有较强的抗凋亡能力。显微镜下观察细胞形态,伊马替尼作用48 h,K562细胞出现细胞皱缩、染色质边集现象,而相同浓度下K562/R细胞未发生明显的形态学变化。Western-blot结果显示,随着伊马替尼诱导浓度与时间增加,BCR-ABL及P-gp蛋白表达水平也随之增加,上述研究结果证实,通过伊马替尼长时间间歇性诱导,成功建立了稳定的具有伊马替尼耐药性且具备多药耐药特点的K562/R耐药细胞株。2.UC-MSCs的分离、培养及鉴定从志愿者足月剖腹产后获取的无菌脐带中制备UC-MSCs。采用组织块法贴壁2-3周,成功分离并获得UC-MSCs,分离的UC-MSCs增殖稳定,外形符合UC-MSCs的形态特征。流式细胞术检测细胞表面表达CD44和CD90,不表达造血干细胞标记CD34和人类共同白细胞抗原CD45,符合UC-MSCs表面免疫分子表型标准。具有成脂、成骨和成神经元样细胞定向分化能力。通过形态学、细胞表面免疫分子表型及体外定向诱导多向分化能力的鉴定,证实本课题从脐带组织中成功分离制备出了UC-MSCs细胞。3.UC-MSCs逆转K562/R白血病细胞对伊马替尼和阿霉素的耐受性UC-MSCs与K562/R及K562亲本株分别进行直接共培养,并以单独培养的K562/R细胞和K562细胞作为对照组细胞。倒置显微镜下观察,无论是K562细胞还是K562/R细胞,共培养48 h后,细胞都出现向UC-MSCs黏附、梭状变形、融合入UC-MSCs现象。MTS法检测K562/R共培养后对伊马替尼及阿霉素的敏感性增加。共培养48 h、72 h、96 h后凋亡相关基因Bax和Caspase-3表达增加;耐药相关基因mdr-1、CD44、FOXO3a表达水平较共培养前下降。流式细胞仪检测共培养的K562/R细胞经伊马替尼诱导的凋亡率水平较单独培养的K562/R细胞为高。Western-blot结果显示K562/R细胞与UC-MSCs共培养后Caspase-3及Bax凋亡相关蛋白表达增高,耐药相关蛋白P-gp、CD44、FOXO3a水平降低。上述研究结果充分证实UC-MSCs可逆转K562/R细胞对伊马替尼和阿霉素的耐药性。4.UC-MSCs与白血病细胞共培养后减少K562/R及K562细胞群中肿瘤干细胞含量K562与K562/R细胞与UC-MSCs共培养48 h、72 h、96 h后,以K562细胞和K562/R细胞作为各自的阴性对照,流式细胞仪检测以CD34+CD38-为特异性标志的肿瘤干细胞在共培养之后在K562及K562/R群体中的含量变化,结果显示:与对照组相比,共培养之后K562/R细胞群体中肿瘤干细胞的含量减少,同样的趋势也见于共培养前后的K562细胞中。5.UC-MSCs通过调控PI3K/AKT和MAPK/JNK信号通路下调FOXO3a/P-gp逆转K562/R细胞耐药性采用shRNA干扰技术沉默K562/R细胞的FOXO3基因建立的sh-FOXO3沉默细胞株,伊马替尼作用48 h的IC50水平较K562/R细胞降低,细胞凋亡率增高。Western-blot检测显示FOXO3被有效沉默后,K562/R细胞的耐药相关蛋白P-gp和CD44的表达水平也显着降低。上述结果提示UC-MSCs通过降低K562/R细胞FOXO3a表达,进而抑制P-gp和CD44的表达而逆转K562/R细胞对伊马替尼及阿霉素的耐药性。将K562细胞和K562/R细胞分别和UC-MSCs共培养48 h、72 h及96 h后,采用Western-blot技术检测AKT、PI3K及MAPKs三条并行通路p38和磷酸化p38、磷酸化c-Jun、磷酸化ERK蛋白变化。结果显示K562/R伊马替尼耐药株和UC-MSCs共培养后,AKT及PI3K相对表达量均降低,相同的趋势也见于与UC-MSCs共培养后的K562细胞。K562/R细胞及K562的p38水平在共培养前后没有明显改变,但磷酸化p38水平在共培养的K562细胞中是增加的。磷酸化c-Jun蛋白表达量在共培养后的K562/R细胞中下降,而western-blot技术检测共培养前后K562/R和K562细胞中c-Abl及磷酸化c-Abl蛋白表达水平的变化量没有明显改变。结论1.通过低浓度起始、渐进提高浓度和长时间诱导的方法成功建立了具有伊马替尼稳定耐药性且具备多药耐药特点的K562/R耐药细胞株。2.采用脐带组织块贴壁法从新鲜人脐带组织中成功分离制备出了具有MSC形态特点和表面标志以及定向多向分化能力、且能体外稳定扩增培养的UC-MSCs细胞。3.UC-MSCs通过与K562/R细胞的直接接触作用,有效增强K562/R细胞对伊马替尼和阿霉素的敏感性、逆转其耐药性,减少白血病细胞群体中肿瘤干细胞含量。机制可能与UC-MSCs调控PI3K/AKT和MAPK/JNK通路从而降低K562/R细胞FOXO3a表达,进而抑制耐药相关蛋白P-gp及CD44的表达有关。
马乾章[5]（2018）在《小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究》文中指出目的:近年来,新兴的化学生物学学科发展非常迅猛。该学科利用现有的数量庞大而且化学结构多样的小分子化合物库,针对研究者所需要的化合物的生物活性进行筛选,并以此为依据进行相关的作用机制研究。本研究所选药物为小白菊内酯和大黄素,二者是从天然植物中提取的小分子化合物。其生物活性均具有明显的抗癌作用,尤其是肠腺癌,近年来的研究逐渐增多。因此,延续我们前期对小白菊内酯和大黄素抗肠腺癌生物活性的研究,本课题采用体外实验的方式,对小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用机制靶点,以及大黄素诱导CACO-2细胞凋亡和调控PI3K/AKT信号通路的作用机制靶点进行了相关研究。通过对小白菊内酯和大黄素抗癌活性及作用机制的研究,为天然植物药物来源的小分子化合物抗癌作用提供基础,为天然植物药物用于临床肿瘤的治疗开拓市场。后续,我们将针对前期的研究成果,对两种小分子化合物的生物活性与其结构的相关性进行分析,对于不理想的结构进行修饰,为新的抗癌小分子药物的研发做出贡献。研究方法:一、小白菊内酯诱导HCT-8/VCR细胞凋亡和耐药逆转作用研究1、MTT法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用培养结肠癌细胞株HCT-8、HCT-8/VCR细胞株,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理12、24、48小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。消化收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、吖啶橙（AO）/溴化乙锭（EB）荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设小白菊内酯浓度5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、AO/EB染色、、封片,荧光显微镜观察,每组分别计数,每次计数细胞300个,计算凋亡率。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2、蛋白表达的影响。收集对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8、HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）取对数生长期HCT-8、HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别加入不同浓度的VCR,处理24小时后,MTT法检测HCT-8、HCT-8/VCR细胞VCR的半数抑制浓度,及HCT-8/VCR对VCR的耐药指数。（2）取对数生长期HCT-8/VCR细胞,加入96孔板,分别设对照组、PTL5μmol/L、VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）、PTL5μmol/L+VCR各浓度组,处理24小时后,MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。消化收集对照组、PTL5μmol/L、VCR2μg/ml、PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞,AnnexinV/FITC染色后,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。收集HCT-8对照组、HCT-8/VCR对照组、PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理24h的HCT-8/VCR细胞蛋白,用western blot方法检测P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达。二、大黄素诱导CACO-2细胞凋亡及对PI3K/AKT信号通路的调控作用研究1、MTT法检测大黄素对CACO-2细胞增殖抑制的影响对数生长期的CACO-2细胞,加入96孔板,实验组加入不同浓度的PTL,对照组则加等量不含药物的培养液,处理24小时后,MTT法检测各孔吸光度（OD）值,计算细胞增殖抑制率。2、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。消化收集对数生长期的CACO-2细胞,以大黄素处理CACO-2细胞24h,终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L,然后以AnnexinV/FITC染色,流式细胞仪检测,分析细胞凋亡百分比。3、DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响取对数生长期CACO-2细胞,每孔1×104个/ml、2ml接种于6孔板中,孔内放入盖玻片。设大黄素浓度15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L、及对照组共4组,每组3个复孔,,每组给药24h后,取出盖玻片,固定、DAPI染色、碳酸盐缓冲甘油封片,荧光显微镜观察,激发波长为359 nm。观察细胞凋亡情况。4、流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响取对数生长期的CACO-2细胞,用RPMI-1640完全培养基制成2×104个/m1的单细胞悬液,接种于6孔培养板中,每孔2ml,37℃培养12小时,更换培养液,加入药物。大黄素物终浓度分别为0μmol/L、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L;对照组为加入完全培养基组,空白对照为只加入完全培养基,置培养箱中培养24h后,用胰酶消化细胞,调整细胞浓度为1x106个/ml,取0.25ml细胞,PBS清洗,1000rpm,4℃离心5分钟,弃上清（重复两次）;将细胞重悬于0.25ml结合缓冲液中,取0.1ml细胞悬液置于5ml流式管中,加入PI 20ul至终浓度50ug/ml,锡箔纸包住,避光4度染色30min,24h内上机检测。用流式细胞仪进行细胞周期检测,重复实验3次。5、Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响收集对照组、15μmol/L、30μmol/L和60μmol/L大黄素处理24h的CACO-2细胞蛋白,用western blot方法检测Bax、Bcl-2蛋白的表达。结果:1、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用小白菊内酯对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用,并呈浓度及时间依赖关系,PTL12h半数抑制浓度IC50分别为20.21±2.63μmol/L,21.52±3.25μmol/L。PTL24h半数抑制浓度IC50分别为15.46±1.22μmol/L,17.05±2.78μmol/L。PTL48h半数抑制浓度IC50分别为11.44±1.65μmol/L,10.85±2.02μmol/L。2、PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。对照组HCT-8细胞凋亡率4.23%±0.75%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.23%±1.45%,22.46%±2.75%,38.16%±3.25%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡率4.42%±1.16%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为8.43%±0.95%,21.67%±3.53%,39.16%±3.51%。上述结果表明PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。3、荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响荧光染色结果显示,PTL以浓度依赖方式诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。对照组HCT-8细胞凋亡细胞比率为10.33%±2.05%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为20.55%±3.55%,32.46%±3.76%,46.8%±4.28%。对照组HCT-8/VCR细胞凋亡细胞比率9.42%±1.25%,与对照组比较,经5、10、20μmol/L的PTL处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率显着增加（p<0.05）,分别为18.66%±2.15%,30.65%±2.87%,45.44%±3.81%。4、Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bax低表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着增加（p<0.05）。对照组HCT-8、HCT-8/VCR细胞可见Bcl-2高表达,与对照组比较,PTL 5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L组Bax表达显着减少（p<0.05）。上述结果表明,PTL通过以浓度依赖方式增加HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax的表达,降低Bcl-2的表达,诱导HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡。5、MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用（1）VCR对结肠癌HCT-8、HCT-8/VCR细胞株有增殖抑制作用（p<0.05）,并呈浓度依赖关系（p<0.05）,VCR半数抑制浓度IC50分别为2.21±0.24μg/ml、38.9±3.04μg/ml,HCT-8/VCR对VCR的耐药指数为17.6倍。（2）VCR0.25、0.5、1、2、4μg/ml对HCT-8/VCR细胞无显着增殖抑制作用（p>0.05）,VCR 6、10μg/ml对HCT-8/VCR细胞有轻度增殖抑制作用（p<0.05）,PTL5μmol/L与VCR（0.25、0.5、1、2、4、6、10μg/ml）联用可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用（p<0.05）。联用后VCR IC50为3.01±0.45μg/ml,与VCR单独应用时比较,IC50显着降低（p<0.05）,PTL可显着降低HCT-8/VCR对VCR的耐药指数（p<0.05）。上诉结果说明,PTL可显着增加显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用,逆转HCT-8/VCR的耐药。6、流式细胞仪（Annexin V-FITC/PI染色）检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用。Annexin V-FITC/PI染色检测凋亡结果显示,对照组细胞凋亡率5.01%±0.47%,经VCR2μg/ml处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为6.93%±1.45%,与对照组比较,无显着差异（p>0.05）,经PTL5μmol/L处理24h后,HCT-8/VCR细胞的凋亡率为10.02%±0.86%,与对照组比较,凋亡率显着增加（p<0.05）,PTL5μmol/L+VCR2μg/ml处理24h的HCT-8/VCR细胞凋亡率为34.7%±2.33%,与VCR2μg/ml组及PTL5μmol/L组比较,凋亡率均显着性增加（p<0.05）。结果表明,PTL可显着增加VCR诱导HCT-8/VCR细胞凋亡能力,逆转HCT-8/VCR细胞对VCR的耐药。7、Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响。western blot方法检测结果显示,HCT-8对照组可见P-gp、MRP、GST-π蛋白的低表达;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着增加（p<0.05）;与HCT-8对照组比较,HCT-8/VCR对照组PTL5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L处理HCT-8/VCR细胞24h后,P-gp、MRP、GST-π蛋白表达显着减少（p<0.05）,且PTL浓度越大蛋白表达越低。8、随着大黄素浓度的逐渐提高,CACO-2细胞生存率逐渐降低,至200μmol/L,细胞生存率几乎接近0。而大黄素对CACO-2细胞培养24h的IC 50值为30μmol/L。9、随着大黄素浓度的逐渐升高,CACO-2细胞凋亡率也随之升高,从对照组的1.85%,升至60μmol/L大黄素组的42.66%。大黄素对CACO-2细胞诱导凋亡的作用呈剂量依赖趋势。10、30μmol/L和60μmol/L的大黄素干预后,细胞核明显浓缩,染色加深,偶见核染色质呈新月形聚集于核膜一边。尤其是60μmol/L的大黄素干预后,凋亡细胞核碎裂成大小不等的圆形小体,并被细胞膜所包绕,疑似凋亡小体。11、对照组细胞大部分处于G0/G1期,为62.3%,处于S期33.7%,处于G2/M期4.0%;大黄素干预后,细胞周期在G2/M期明显发生停滞,该期细胞数显着增多。并且随着大黄素浓度的提高,停滞于G2/M期的细胞也逐渐增多。以60μmol/L的大黄素组G2/M细胞周期阻滞最为明显。12、对照组细胞Bax呈低水平表达,而随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐上调;Bcl-2表达水平与Bax正好相反,对照组细胞Bcl-2、p-PI3K和p-AKT呈高水平表达,随着大黄素浓度的增高,表达水平逐渐下调。而非磷酸化PI3K、AKT表达水平各组间无明显差异。结论:1、小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞具有抑制增殖及诱导凋亡作用,小白菊内酯对结肠癌细胞增殖抑制及诱导凋亡作用不受HCT-8/VCR细胞耐药性的影响,小白菊内酯可通过增加Bax的表达,降低Bcl-2的表达来诱导结肠癌细胞凋亡。2、小白菊内酯可显着增加VCR对HCT-8/VCR细胞的增殖抑制能力及凋亡诱导能力,小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞具有耐药逆转作用。其机制主要是通过PTL降低HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白的表达,逆转HCT-8/VCR细胞的耐药性。3、大黄素对CACO-2结肠癌细胞的生长具有明显的抑制作用。其抗癌作用主要是由于诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞。此外,它还能抑制CACO-2细胞的PI3/AKT信号级联,提示大黄素在结肠癌治疗中的潜在应用。
刘秀妃[6]（2018）在《姜黄素联合维拉帕米逆转人胆管癌细胞多药耐药性的实验研究》文中研究表明目的:本实验旨在探讨姜黄素、维拉帕米联合应用对人胆管癌多药耐药细胞株QBC939/ADM的逆转作用及其可能机制。方法:用浓度递增法诱导建立人胆管癌多药耐药细胞模型QBC939/ADM,采用CCK-8法检测不同浓度的阿霉素、丝裂霉素对细胞QBC939和耐药细胞QBC939/ADM的细胞抑制率,得出IC50值及耐药指数,来证明耐药模型的建立。以单独使用化疗药阿霉素作为对照,实验组为姜黄素、维拉帕米以及姜黄素联合维拉帕米分别与阿霉素联合作用,采用CCK-8法检测各组对耐药细胞毒作用,流式细胞仪检测耐药细胞凋亡率,RT-PCR检测MDR基因的表达。结果:CCK-8法分别检测不同浓度的阿霉素、丝裂霉素对细胞QBC939和耐药细胞QBC939/ADM的细胞抑制率,经计算耐药指数得出,与QBC939相比,QBC939/ADM细胞对阿霉素、丝裂霉素的耐药指数分别为9.3和4.26;CCK-8检测化疗药阿霉素对于实验组与对照组细胞的毒性,单独使用阿霉素组的细胞生存率为（11.97±1.08）%;阿霉素分别联合维拉帕米、姜黄素、姜黄素+维拉帕米,细胞存活率分别为（9.35±0.37）%、（8.07±0.53）%、（6.58±0.69）%,实验组与对照组相比较,P<0.05,差异有统计学意义;流式细胞仪检测化疗药阿霉素对两组细胞的凋亡率,单独使用阿霉素组的细胞凋亡率为（6.45±0.78）%;阿霉素联合维拉帕米、姜黄素、姜黄素+维拉帕米,细胞凋亡率分别为（10.78±0.73）%、（14.68±0.42）%、（26.69±2.22）%,实验组与对照组相比较,P<0.05,差异有统计学意义。RT-PCR检测MDR的表达,与单独使用阿霉素组（1.00）相比,姜黄素、维拉帕米、姜黄素+维拉帕米组的MDRmRNA值分别为（0.92±0.06）、（0.88±0.06）、（0.66±0.10）,表达均有降低。结论:初步探讨了姜黄素、维拉帕米对人胆管癌多药耐药性具有逆转作用,能够增加化疗药阿霉素对耐药细胞的毒性,使人胆管癌耐药细胞凋亡率明显增加,MDR表达降低,姜黄素与维拉帕米联合使用具有联合增效作用。但具体机制仍不明确,还需要进一步的研究和探索。
汤婷婷[7]（2018）在《斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究》文中进行了进一步梳理目的:本论文选用课题组前期筛选出的人口腔上皮癌KB细胞及耐药株KB/ADM,采用斑马鱼异位移植瘤模型,研究氯化两面针碱（NC）对KB/ADM细胞的耐药逆转作用及NC对Topo m RNA和蛋白表达的影响,探讨NC逆转耐药的作用机制。方法:（1）斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:使用红色荧光染料（CM-Dil）标记人口腔上皮癌细胞,以显微注射的方式移植到受精后2天（2dpf）野生型AB品系斑马鱼卵黄囊内,每尾移植约800个细胞,建立斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型;将注射了人口腔上皮癌细胞的斑马鱼放置35℃培养至3dpf,在显微镜下挑选出移植肿瘤一致性较好的斑马鱼,在注射肿瘤细胞后的0天、1天、2天和3天分别观察、拍照并保存图片,观察人口上皮癌细胞是否能在斑马鱼体内存活并增殖。（2）NC对人口上皮癌耐药性的逆转作用研究:（1）确定NC的最大耐受浓度（MTC）、依托泊苷（VP-16）MTC和NC联用VP-16的浓度:随机选取3dpf野生型AB品系斑马鱼180尾于六孔板中,分别水溶给予NC0.1μM、1μM、5μM、10μM和50μM浓度;VP-16C/1000、C/500、C/100、C/50和C/10浓度（C为原液浓度）;NC联用VP-16时,NC选择其MTC进行检测,VP-16选择MTC、1/2 MTC和1/4MTC进行检测;每孔（浓度组）斑马鱼尾数为30尾,每孔容量为3 m L,同时设置正常对照组。药物处理期间,每天对死亡的斑马鱼计数并移除死鱼;2天后,观察记录斑马鱼的表型和死亡情况,确定NC和VP-16对斑马鱼的MTC及NC联用VP-16时的浓度。（2）斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立:参见“方法（1）”。（3）分组及给药:按“方法（1）”操作,在显微镜下挑选出移植肿瘤细胞一致性较好的斑马鱼,随机分配至6孔板中,以水溶给药方法分别给予单用VP-16C/100浓度、单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度、NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100,阳性对照组为维拉帕米（VRP）联用VP-16,同时设置模型对照组,每实验组均处理30尾模型斑马鱼,给药2d后,用荧光显微镜拍照获取移植瘤的荧光图片,分析各实验组斑马鱼移植瘤荧光强度,评价NC对斑马鱼KB/ADM移植瘤的多药耐药逆转作用。计算肿瘤多药耐药逆转作用。（3）NC对肿瘤组织中Topo I、TopoⅡα、TopoⅡβm RNA及蛋白表达的影响:（1）Real time PCR检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβm RNA表达的影响;（2）Western blot检测NC对Topo I、TopoⅡα和TopoⅡβ蛋白表达的影响。结果:（1）在注射肿瘤细胞0天、1天、2天、3天斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤荧光强度总和（mean±SE）分别为（0.59±0.03）×105、（1.82±0.08）×105、（2.07±0.12）×105、（1.21±0.06）×105像素。（2）（1）NC对斑马鱼的MTC为10μM、VP-16对斑马鱼的MTC为C/100、NC联用VP-16的MTC为NC10μM+VP-16C/100。?模型对照组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.85×105像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB移植瘤荧光强度为4.79×105像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为14.63%。模型对照组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.75×105像素,VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为4.66×105像素,与模型对照组比较p>0.05,移植瘤转移抑制率为1.87%。单用NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为3.94×105、3.34×105、2.79×105像素,肿瘤抑制率分别为17.06%、29.60%、41.25%,与模型对照组比较,单用NC1.1μM浓度组p>0.05,单用NC3.3μM、10μM浓度组存在统计学差异（p<0.01&p<0.001）。NC1.1μM、3.3μM和10μM浓度分别联用VP-16C/100浓度组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度分别为2.80×105、2.42×105、2.13×105像素,肿瘤抑制率分别为41.12%、48.99%、55.19%,与模型对照组比较,具有显着差异（p<0.001,p<0.001,p<0.001）。阳性对照VRP联用VP-16组斑马鱼KB/ADM移植瘤荧光强度为2.46×105像素,与模型对照组相比,具有显着性差异（p<0.001）,肿瘤抑制率为48.30%。NC1.1μM+VP-16C/100、NC3.3μM+VP-16C/100、NC10μM+VP-16C/100、VRP联用VP-16组的肿瘤多药耐药逆转率分别为40.00%、48.01%、54.33%、47.31%,与模型对照组相比,具有显着性差异（p<0.001,p<0.001,p<0.001,p<0.001）。（3）?Topo I m RNA相对表达结果,敏感组中Topo I m RNA表达水平上调,无统计学意义,在耐药组中表达水平均上调（P<0.05,P<0.05,P<0.05）;TopoⅡαm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡαm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组中依次呈下调趋势（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡβm RNA相对表达结果,敏感组中TopoⅡβm RNA表达水平下调,无统计学意义,在耐药组表达水平均下调（P<0.05,P<0.05,P<0.05）;?Topo I蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平上调（P<0.01）,在耐药组中表达水平均上调（P<0.05,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡα蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调（P<0.01）,在耐药组中依次呈下调趋势（P<0.01,P<0.01,P<0.01）;TopoⅡβ蛋白相对表达结果,敏感组中该蛋白表达水平下调（P<0.05）,在耐药组中表达水平均下调（P<0.05,P<0.05,P<0.01）。结论:（1）人口腔上皮癌细胞能够在斑马鱼体内存活并繁殖,说明造模成功,可进行后续实验。（2）NC在体内能够明显抑制人口腔上皮癌移植瘤的生长,同时可逆转KB/ADM细胞MDR的作用。（3）NC逆转KB/ADM细胞MDR作用的机制可能是通过抑制TopoⅡα、TopoⅡβ实现,对Topo I的作用有待研究。
张坤[8]（2018）在《浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响》文中研究表明目的对小鼠急性髓系白血病模型进行干预,明晰浙贝黄芩汤通过调控Wip1对髓系白血病化疗效果的影响。方法1.探索白血病病情进展与Wip1、野生型p53表达的相关性。采集复发/难治急性髓系白血病患者、初诊/敏感急性髓系白血病患者、健康成年人3-5ml外周血,提取中性粒细胞、单个核细胞的总RNA,应用定时定量PCR检测Wip1、野生型p53表达量,检测急性髓系白血病患者p53热点突变情况。2.尾静脉接种构建急性髓系白血病小鼠模型。应用4-5周龄雌性SCID beige小鼠,2GyX射线预处理后,经尾静脉接种不同浓度的HL60、HL60/ADR细胞悬液。通过观察一般情况,照射前、造模第10、18、28天全血细胞分析、外周血白细胞分类、外周血CD33阳性细胞比例、骨髓形态学检查和组织切片病理检查鉴定模型。3.浙贝黄芩汤联合阿霉素体内干预白血病动物模型,对比化疗敏感株与耐药株的疗效差异,明晰Wip1、P53的表达与疗效的相关性。将上述课题组构建HL60白血病模型,随机分为4组:模型组、浙贝黄芩汤灌胃（中药）组、阿霉素腹腔注射（化疗）组、浙贝黄芩汤灌胃+阿霉素腹腔注射（中药+化疗）组。模型组灌胃等量蒸馏水;中药组灌胃浙贝黄芩汤（7.58g/d/kg）每天一次,化疗组腹腔注射盐酸阿柔比星（1mg/kg）隔日一次,中药+化疗组应用浙贝黄芩汤联合盐酸多柔比星进行干预,周期14天。HL60/ADR白血病模型分组及给药处理方式均同上。实验过程中观察小鼠生存状态,于给药第15天或濒死前处死动物,取材进行各项指标检查,对比HL60白血病模型及HL60/ADR白血病模型各项指标及疗效的差异,包括全血细胞分析、外周血CD33阳性细胞比例、骨髓白血病细胞比值、脾脏重量、组织切片病理检查、Wip1及P53的表达情况,评价浙贝黄芩汤调控Wip1对化疗敏感性的影响。结果1.白血病病情进展者,Wip1表达升高,野生型p53表达降低。白血病发病不同阶段Wip1的表达情况。共采集25例复发/难治性急性髓系白血病患者（复发/难治组）外周血、10例初诊或化疗敏感的急性髓系白血病患者（初诊/缓解组）、7例健康成年人（正常对照组）,检测结果如下（正态分布以均值±标准差表示,非正态分布以中位数（四分位间距）表示）:①Wip1mRNA:正常对照组、初诊/缓解组、复发/难治组中性粒细胞 Wip1mRNA 相对β-actin 的表达量分别为 0.0021（0.0016,0.0116）、0.0109（0.0050,0.0207）、0.0092（0.0037,0.0278）,单个核细胞 Wip1mRNA 相对 β-actin 的表达量分别为 0.0024±0.0011、0.0080±0.0063、0.0042（0.0024,0.0100）;复发/难治急性髓系白血病患者Wip1表达升高。②野生型p53mRNA:正常对照组、初诊/缓解组、复发/难治组单个核细胞p53mRNA相对β-actin的表达量分别为0.0056（0.0022,0.0063）、0.0060（0.0041,0.0359）、0.0018（0.0008,0.0045）;复发/难治急性髓系白血病患者野生型p53mRNA表达下降。③检测了 8例急性髓系白血病患者p53热点突变,突变率为25%,分别位于6、7外显子,p53突变患者预后差。2.尾静脉接种成功构建急性髓系白血病小鼠模型。各模型组于接种细胞7-10天,出现竖毛、萎靡少动、脊背弓起、步态不稳、偏侧或转圈,接种HL60、HL60/ADR细胞悬液高浓度（1×107个/只）发病进展更快,通过比较全血细胞分析、外周血CD33阳性细胞比例、组织病理检查鉴定动物模型,而骨髓形态学检查因随实验进程,小鼠疾病进入终末期,极度消瘦,生存状态极差,处死取材时未能吹出骨髓细胞,未能得到有效制片获得实验数据。根据其余相关检测结果显示:接种浓度为1×107个/只的HL60、HL60/ADR两模型组白血病浸润更明显,可满足下一步实验需求。3.浙贝黄芩汤可减轻白血病模型肿瘤负荷、增强化疗敏感性、部分逆转耐药,与降低Wip1的表达有关。HL60、HL60/ADR模型均分为模型组、中药组、化疗组、中药+化疗组,每组6只。①生存期（天）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为17.83±6.88、20.00±6.23、22.00±4.43、23.00±2.00;HL60/ADR 模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为20.83±5.00、21.33±4.55、23.17±2.04、24.00±0.00,单用浙贝黄芩汤即可延长生存期,中药联合化疗生存期最长。②给药第15天小鼠体重（g）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:9.80±2.60、10.24± 1.59、11.03±1.31、11.62±1.96;HL60/ADR 模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为 1 0.94±0.92、11.67±2.03、13.52±1.65、15.56±0.87,仅HL60/ADR中药+化疗组的体重较造模时（13.16±1.04g）增加,其余组均较造模前下降,说明耐药白血病模型应用化疗时联合中药可改善恶病质状态。③给药第15天外周血白细胞计数（×109/L）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为3.36±1.08、1.39±0.39、0.45±0.24、0.45±0.23,化疗、中药+化疗组较其余两组明显下降。HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为0.96±0.40、1.24± 1.04、0.66±0.44、0.81±0.72,差异无统计学意义。④给药第15天外周血CD33阳性细胞比例（%）:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:55.21±7.29、39.24±2.94、31.49±2.36、25.52±0.81。浙贝黄芩汤具有减轻白血病负荷、化疗增敏的作用。HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:77.42±0.73、75.65±0.18、72.74±1.18、67.03±3.83,耐药株 HL60/ADR 各实验组化疗耐药,浙贝黄芩汤联合化疗可部分逆转耐药。⑤脾脏重量（g）:脾脏为髓外白血病细胞增殖浸润的主要场所,通过观察脾脏的重量可反映体内白血病负荷。HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组:0.1637±0.0359、0.1132±0.0075、0.0662±0.0152、0.0854±0.0008,HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:0.1768±0.0226、0.1765±0.0191、0.0828±0.0074、0.0968±0.0052,耐药株各组脾脏重量明显高于敏感株,中药联合化疗可减轻白血病模型脾脏肿瘤负荷。⑥脾脏病理切片HE染色:HL60模型组小鼠脾脏镜下可见,脾脏正常组织结构被完全破坏,弥漫性白血病细胞浸润灶,中药联合化疗能明显减少白血病细胞浸润;HL60/ADR模型组脾脏正常结构亦完全破坏,镜下白血病细胞弥漫浸润,且耐药株各组小鼠脾脏浸润灶均明显多于敏感株相应组别。⑦Wip1mRNA相对表达量:HL60模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:1.3733±0.4347、0.4525±0.2298、0.4700±0.3220、0.1825±0.1410;HL60/ADR模型、中药、化疗、中药+化疗组分别为:0.8166±0.6886、0.7193±0.3412、0.1061±0.1074、0.1011 ±0.0976。随着白血病病情的控制,Wip1表达量减低,中药联合化疗可进一步下调Wip1表达。结论浙贝黄芩汤可通过下调Wip1减轻白血病负荷、增强化疗敏感性、部分逆转白血病耐药,白血病病情进展与Wip1表达升高相关。
李旸[9]（2017）在《miR-199a-5p调控自噬参与急性髓细胞白血病化疗耐药及机制研究》文中进行了进一步梳理目的:急性白血病是一类源于骨髓造血干/祖细胞的恶性克隆性疾病,死亡率较高。其中,急性髓细胞白血病（Acute myeloid leukemia,AML）是成年人常见的白血病类型,约占急性白血病的60%-70%。AML的治疗目前临床仍主要依赖于联合化疗,然而白血病细胞对化疗药物耐药是白血病复发难治的关键,也是临床上化疗失败的最重要原因。miRNA是一类长度为19-25个核苷酸的内源性非编码RNA,在遗传学上高度保守。它通过与靶基因3’非翻译序列的特异性结合在转录后水平调控靶基因的表达,与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关。miR-199a-5p是机体的一个重要miRNA,其功能涉及心肌肥大、骨骼发育、肿瘤的发生和肿瘤细胞耐药等方面。有研究显示miR-199a-5p低表达与肝细胞癌对化疗药物耐药有关。另有研究表明miR-199a-5p转基因小鼠经雷帕霉素处理提高心肌细胞自噬活性能够显着降低心肌细胞肥大的水平。这些研究提示miR-199a-5p在调控肿瘤细胞多药耐药以及自噬活性中发挥重要的作用。细胞自噬是真核细胞内广泛存在的一种高度保守的生命现象,是细胞在应激条件下通过自我分解受损蛋白质和细胞器以维持细胞内环境的稳态和基因组稳定性的一种重要方式。诸多研究表明,对肿瘤细胞使用化疗药物可以诱发自噬反应,大多数肿瘤细胞中自噬作为保护性机制参与多药耐药的产生和维持。文献报道急性白血病初发患者、复发难治患者、完全缓解患者的骨髓单个核细胞的自噬活性存在显着差异,提示自噬参与调节急性白血病多药耐药。综上,为了研究miR-199a-5p和自噬活性在AML耐药中的调控作用,本研究以AML患者与AML耐药和敏感细胞株为研究对象,检测miR-199a-5p的表达水平及自噬活性,探索二者对白血病多药耐药的调控作用及相关信号转导通路,进一步寻找miR-199a-5p调控自噬和耐药的功能性靶基因。本研究阐明了miR-199a-5p在AML耐药中的生物学作用,为临床多药耐药白血病的治疗提供新的靶点。研究方法:1、采用实时定量RT-PCR方法对16例复发难治和7例完全缓解的急性髓细胞白血病患者的骨髓单个核细胞miR-199a-5p表达进行检测。2、采用实时定量RT-PCR方法对急性髓细胞白血病细胞株K562、HL60及其耐药细胞株K562/ADM、HL60/ADM中miR-199a-5p表达进行检测。3、K562/ADM和K562细胞中采用lipo2000转染miR-199a-5p的mimic和inhibitor,验证转染效率,CCK-8法检测细胞增殖率。4、Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中自噬相关蛋白LC3-II/I和Beclin1的表达。5、3-MA预处理K562和K562/ADM细胞后,采用Western blot检测细胞中LC3-II/I和Beclin1的表达变化。6、3-MA与阿霉素联合处理K562/ADM细胞,采用CCK-8法检测细胞增殖率。7、K562/ADM和K562细胞中采用lipo2000转染miR-199a-5p的mimic和inhibitor,Western blot方法检测LC3-II/I,Beclin1和P62蛋白表达。8、采用细胞转染方法上调和下调miR-199a-5p表达,mGFP-RFP-LC3串联荧光腺病毒法在荧光显微镜下观察K562和K562/ADM细胞中LC3荧光。9、采用细胞转染的方法上调和下调miR-199a-5p表达后,Western blot检测细胞中磷酸化和非磷酸化的AKT,mTOR以及P70S6K1蛋白表达。10、生物信息学预测miR-199a-5p调节自噬的下游靶基因。11、采用实时定量RT-PCR和Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中DRAM1基因和蛋白的表达。12、采用细胞转染的方法上调和下调miR-199a-5p表达,实时定量RT-PCR和Western blot方法检测K562和K562/ADM细胞中DRAM1基因和蛋白表达。13、双荧光素酶报告基因实验验证miR-199a-5p与DRAM1 3’UTR区直接结合。14、采用siRNA法下调K562/ADM细胞中DRAM1基因表达,Western blot检测LC3-II/I的表达。15、采用siRNA法下调K562/ADM细胞中DRAM1基因表达,CCK-8法检测细胞的增殖率。结果:1、采用RT-PCR方法对16例复发难治AML患者（RR1-RR16）和7例完全缓解AML患者（CR1-CR7）骨髓单个核细胞miR-199a-5p的表达进行检测。结果显示,与完全缓解期患者相比,复发难治AML患者miR-199a-5p呈低表达趋势。2、miR-199a-5p在急髓白血病耐药细胞K562/ADM、HL60/ADM中的表达显着低于其敏感细胞K562、HL60（P<0.05）。3、miR-199a-5p转染效率验证:在K562/ADM细胞中,与转染阴性对照组相比较,转染miR-199a-5p mimic的细胞株miR-199a-5p表达水平显着升高（P<0.05）;在K562细胞中,与转染阴性对照组相比,转染miR-199a-5p inhibitor的细胞株中miR-199a-5p表达水平明显下降（P<0.05）。CCK-8实验显示,K562/ADM细胞转染miR-199a-5p mimic后,细胞增殖活性下降;K562细胞转染miR-199a-5p inhibitor后,细胞增殖活性明显升高（P<0.05）。4、基础状态下,K562/ADM中LC3-II/I和Beclin1的表达均高于K562细胞;进一步加入不同剂量阿霉素诱导后,两组细胞中LC3-II/I和Beclin1表达均升高,此效应在K562/ADM中更为显着和迅速（P<0.05）。5、K562和K562/ADM细胞加入3-MA处理后,细胞中LC3-II/I和Beclin1蛋白表达均显着下降（P<0.05）。6、CCK-8实验显示,3-MA预处理后,K562/ADM细胞的增殖活性明显下降（P<0.05）。7、miR-199a-5p表达下调后,K562细胞中LC3-II/I和Beclin1表达增强,P62表达减弱;miR-199a-5p表达上调后,K562/ADM细胞中LC3-II/I和Beclin1表达减弱,P62表达增强（P<0.05）。8、K562细胞miR-199a-5p表达下调后,荧光显微镜下观察LC3黄色及红色荧光颗粒数量增加,自噬增强;K562/ADM细胞miR-199a-5p表达上调后,黄色及红色荧光颗粒数量明显减少,自噬减弱。9、K562细胞中miR-199a-5p表达下调后,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K1表达增强;K562/ADM细胞中miR-199a-5p表达上调后,p-AKT、p-mTOR、p-P70S6K1表达减弱（P<0.05）。10、生物信息学预测DRAM1为miR-199a-5p下游靶基因。11、K562/ADM细胞中DRAM1在基因和蛋白水平表达均高于K562细胞（P<0.05）。12、K562/ADM转染miR-199a-5p mimic后,DRAM1在mRNA和蛋白水平较未转染组和转染阴性对照组明显下降（P<0.05）;相反,K562细胞转染miR-199a-5p inhibitor后,DRAM1在mRNA和蛋白水平的表达显着升高（P<0.05）。13、双荧光素酶报告基因检测实验证实miR-199a-5p mimic可显着降低DRAM1的野生型3’UTR质粒的荧光强度,突变该结合位点可阻断此现象的发生。14、在K562/ADM中,通过siRNA降低DRAM1表达,LC3-II/I蛋白表达明显下降（P<0.05）。15、在K562/ADM中,通过siRNA降低DRAM1表达,细胞增殖活性下降（P<0.05）,K562/ADM对阿霉素的敏感性增强。结论:1、miR-199a-5p在急髓白血病耐药细胞株以及复发难治急髓白血病患者骨髓标本中呈低表达。miR-199a-5p表达与细胞对化疗药物的敏感性相关。2、与K562细胞相比,K562/ADM细胞在一般情况下即表现较高的基础自噬活性;采用阿霉素处理后,两组细胞都表现出自噬活性增强以应对环境变化,K562/ADM自噬活性增强更为显着。3-MA能够抑制白血病细胞的自噬活性。抑制自噬后白血病耐药细胞K562/ADM对化疗药物的敏感性增强。3、miR-199a-5p高表达抑制白血病细胞的自噬活性。该效应是由于抑制自噬的启动,而非阻断自噬流。PI3K/AKT/mTOR/P70S6K1信号转导通路参与miR-199a-5p对急髓白血病耐药细胞自噬的调控。DRAM1是miR-199a-5p调控急性髓细胞白血病自噬和耐药的功能性靶基因。
卢菲[10]（2014）在《急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究》文中研究指明研究背景：急性髓性白血病（acute myeloid leukemia, AML）是一种异质性很强的恶性克隆性疾病,严重影响人类的健康。近年来,随着化疗、造血干细胞移植、基因靶向治疗以及生物免疫治疗等多种治疗方法的发展,AML患者的完全缓解率及5年无病生存率均较前有所改善,但是仍有大部分患者出现耐药和复发,预后不良。白血病多药耐药（multidrug resistance, MDR）的产生是导致化疗失败的关键因素,也是造成白血病患者复发、难治的重要原因。白血病多药耐药是指白血病细胞对一种化疗药物产生耐药后,同时对不同化学结构和不同作用机理的多种化疗药物产生交叉耐药的现象,包括原发性耐药与继发性耐药。MDR产生机制非常复杂,包括药物外排介导的耐药、MDR相关酶类异常所致耐药、药物作用靶点基因突变、肿瘤干细胞、细胞凋亡受抑、周期阻滞、药代动力学的改变等。因此从多个角度阐明AML多药耐药的机制,寻找有效逆转多药耐药的方法,不仅是克服AML多药耐药的重要思路,也是准确评估预后、改善患者生存率的必由之路。MicroRNA （miRNAs）是一类长度为19-25nt,序列高度保守的内源性非编码小RNA分子。成熟miRNA通过与目的基因3’端非编码（3’-UTR）区结合促使靶基因抑制或蛋白降解,在转录或转录后水平调控基因表达,广泛参与细胞的增殖、凋亡、分化、免疫系统、个体发育以及机体代谢等一系列生命过程。近年来研究发现,白血病中miRNA表达谱存在差异表达,在白血病形成及疾病进展过程中,miRNA参与癌细胞生物程序的调控,表现出癌基因或抑癌基因的作用。但是,关于miRNA在AML耐药过程中的作用机制尚不十分明确,有待于进一步研究。因此,筛选在AML耐药中起关键作用的miRNA并阐明其具体作用机制,研究急性髓性白血病中miRNA的异常表达与临床化疗敏感性、预后的关系,可以为难治/复发AML的早期预警和检测提供新的生物学标记物,对于提高难治/复发AML诊疗水平具有重要的临床意义。研究目的：筛选并鉴定出参与AML多药耐药的miRNA分子；研究该miRNA分子在成人AML骨髓标本中的表达,分析其与临床特征的关系；明确该miRNA分子在AML多药耐药中的作用；进一步确定该miRNA分子的靶基因,并探讨其参与AML多药耐药的机制,从而为逆转AML耐药带来全新的治疗思路和方案。研究方法：1.应用miRNA芯片技术筛选AML敏感与耐药细胞株之间差异表达的miRNA分子,选取差异倍数较高的miRNA分子作为候选分子。2.标本采集：收集120例AML患者和40例健康对照者的骨髓标本,其中AML患者标本分为初诊组（56例）,完全缓解组（44例）以及复发／难治组（20例）。采用淋巴细胞分离液密度梯度离心法分离收集标本中骨髓单个核细胞,-80℃保存备用。3.实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（Real-time RT-PCR）法检测miR-29b的表达情况：采用mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株中miRNA,应用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒将miRNA逆转录为cDNA,应用TaqMan探针Real-time RT-PCR方法检测AML患者骨髓单个核细胞及AML细胞株miR-29b表达水平,验证芯片结果。4. miR-29b, AFlq和CD44分子在AML耐药中的作用。4.1细胞转染：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b模拟物（mimic）或抑制剂（inhibitor）及各自阴性对照转染AML敏感与耐药细胞株,48小时后收集各组细胞,Real time RT-PCR检测转染后miR-29b表达情况。4.2病毒包装及细胞感染：分别包装携带AF1q表达载体或AF1q shRNA的慢病毒,感染AML敏感或耐药细胞株,上调或下调AF1q表达,48小时后荧光显微镜观测感染效率,应用Blastin药物筛选获得稳定感染细胞,Real timeRT-PCR、Western blot方法检测病毒感染稳筛后AF1q表达情况。4.3载体构建：构建携带CD44shRNA的真核表达载体,转染AML耐药细胞株,Real time RT-PCR和Western blot实验方法检测转染后CD44表达情况。4.4CCK8法检测药物敏感性：将稀释成一定浓度梯度的化疗药物阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML敏感及耐药株细胞对化疗药物的敏感性,分别计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.5流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的阿霉素（DOX）,阿糖胞苷（Ara-C）,去甲氧柔红霉素（IDA）分别加入改变miR-29b, AF1q和CD44分子表达后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色流式细胞仪检测细胞凋亡率。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究。5.1生物信息学方法预测miR-29b分子可能调控的下游靶基因AF1q, Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对靶基因AF1q表达水平影响。5.2双荧光素酶报告实验验证miR-29b与下游靶基因AF1q结合作用：构建AF1q基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告载体,检测miR-29b上调后荧光素酶活性的改变。5.3Real-time RT-PCR、Western blot实验检测AF1q、CD44在AML细胞株及上述收集AML骨髓标本中mRNA及蛋白水平的表达情况,统计分析miR-29b和AF1q、CD44表达相关性。5.4AF1q对下游基因CD44表达水平影响：收集稳定筛选后AFlq上调或下调AML细胞株,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测AF1q分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.5MiR-29b对下游基因CD44表达水平影响：应用Lipofectamine2000分别将miR-29b mimic或miR-29b inhibitor及各自阴性对照转染AML细胞株,48小时后收集各组细胞,Real-time RT-PCR, Western blot实验检测miR-29b分子表达变化对下游基因CD44在mRNA及蛋白表达水平影响。5.6将DOX作用与AML细胞并分别于12h,24h,48h收集细胞,设不加药对照组。利用Real-time RT-PCR和Western blot方法检测AFlq和CD44表达。5.7细胞分组：①miR-29b mimic转染组；②miR-NC转染组；③AF1q表达载体转染组；④AF1q表达载体对照转染组；⑤miR-29b mimic+AF1q表达载体同时转染组；⑥miR-29b mimic+AF1q表达载体对照同时转染组；⑦miR-NC+AF1q表达载体对照同时转染组。CCK8法检测上述各组细胞药物敏感性,Western blot实验检测CD44表达水平。5.8双荧光素酶报告实验检测AFlq对CD44的转录调控作用：构建含有CD44启动子区域的荧光素酶报告载体,上调AFlq表达检测荧光素酶活性变化。5.9免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation, Co-IP）实验检测AFlq蛋白与TCF7L2结合作用：构建携带有6myc标签AFlq基因全长表达载体,同时构建带有FLAG标签的TCF7L2表达载体,应用Lipofectamine2000共转染HEK293细胞,Co-IP实验检测验证AFlq蛋白与TCF7L2结合作用。5.10蛋白染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation, CHIP）实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用：通过生物信息学软件预测TCF7L2与CD44分子启动子区域具体结合位点,设计CD44引物序列,将TCF7L2分子表达载体转染HEK293细胞,CHIP实验检测TCF7L2与CD44分子启动子区域结合作用。6.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据分别进行差异性分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.芯片结果：应用miRNA芯片技术在K562与耐药株K562/A02、HL60与耐药株HL60/ADM间筛选出24种表达明显差异的miRNA分子,选择表达明显差异的miR-29b、miR-181b作为候选miRNA分子。2.验证芯片结果：Real time RT-PCR结果表明与AML敏感株K562、HL60相比较,miR-29b在耐药株K562/A02、 HL60/ADM中表达明显下调。3. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML患者骨髓标本中的表达水平：3.1miR-29b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-29b表达水平明显高于难治／复发组患者；完全缓解组AML患者miR-29b表达水平明显高于初诊组和难治／复发组患者；而健康对照组与完全缓解组相比较miR-29b表达水平无明显差异。3.2与健康对照组相比较,AFlq在AML初诊组和难治/复发患者组中表达明显上调；初诊组和难治/复发组AML患者AF1q表达水平明显高于完全缓解组患者；初诊AML患者AFlq表达水平明显低于难治/复发组患者；健康对照组与完全缓解组相比较AFlq表达水平无明显差异。3.3CD44分子在AML初诊组和难治/复发患者中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治/复发组AML患者CD44表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者CD44表达水平较难治/复发组AML患者显着降低；完全缓解组与健康对照组与相比较CD44表达水平无明显差异。4. miR-29b, AF1q和CD44分子在AML多药耐药中的作用：4.1Real time RT-PCR结果证实miR-29b mimic可明显上调miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平,miR-29b inhibitor可显着下调miR-29b在AML敏感细胞株中的表达水平。4.2Real time RT-PCR、Western blot结果显示携带AFlq表达载体的慢病毒可有效上调AF1q表达,携带AF1q shRNA的慢病毒可有效下调AFlq表达。4.3将CD44shRNA真核表达载体转染AML耐药细胞后,Real time RT-PCR、 Western blot结果显示CD44表达水平较对照组明显下调。4.4miR-29b,AF1q和CD44分子表达变化对AML细胞药物敏感性的影响：CCK8检测发现,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调均明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达明显降低了AML敏感细胞株（K562、HL60）对化疗药物的敏感性。4.5miR-29b, AF1q和CD44分子表达变化后对化疗药物诱导AML细胞凋亡的影响：AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率显示,miR-29b表达上调,AFlq或CD44表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、 HL60/ADM）凋亡率明显升高；抑制miR-29b表达或上调AFlq表达后,化疗药物诱导的AML敏感细胞株（K562、HL60）凋亡率明显下降。5. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控机制研究：5.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测AFlq为miR-29b下游靶基因。在AML耐药细胞株中有效上调miR-29b表达水平后,AF1q蛋白表达水平均明显降低; miR-29b表达水平明显下调后,AFlq蛋白表达水平明显升高。5.2双荧光素酶报告实验证实miR-29b直接结合与AF1q3’-UTR区的预测靶位点。5.3Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq和CD44分子在AML耐药株K562/A02. HL60/ADM中表达水平显着高于AML敏感株K562、HL60。Spearman秩相关分析结果显示：miR-29b和AF1q的表达水平呈显着负相关关系；miR-29b和CD44的表达水平呈显着负相关；AF1q和CD44的表达水平呈显着正相关关系。5.4Real time RT-PCR、Western blot结果显示AFlq表达上调后,CD44分子表达明显上调；AFlq表达下调后,CD44分子表达亦明显下调。5.5Real time RT-PCR、Western blot结果显示,在AML耐药株中过表达miR-29b可明显下调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达；抑制miR-29b表达可显着上调CD44分子在mRNA和蛋白水平表达。5.6CCK8. Western blot实验结果显示：AFlq表达上调可减弱miR-29b的逆转耐药作用以及对CD44的正调控作用。5.7Real time RT-PCR、Western blot结果显示：化疗药物作用于AML耐药细胞后,AF1q和CD44表达水平显着降低；并且随着时间延长,AF1q和CD44表达均逐渐下调,呈正相关关系。5.8双荧光素酶报告实验结果显示AFlq结合于CD44启动子区域,在转录水平调控CD44表达活性。5.9Co-IP实验证实AFlq蛋白与TCF7L2存在结合作用。5.10CHIP实验证实TCF7L2作用于CD44分子启动子区域。结论：1. MiRNA分子在AML敏感细胞株及耐药细胞株之间表达谱存在明显差异,提示miRNA分子可能参与AML耐药过程。2.逆转miR-29b在AML耐药细胞株中的表达水平后,明显增加了AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. MiR-29b, AF1q和CD44分子形成miR-29b/AF1q/CD44作用轴在AML耐药发生、发展过程中发挥重要作用,有望成为AML治疗的新靶点。4.AFlq通过与Wnt/β-catenin信号通路TCF7L2转录因子共同作用,在转录水平激活CD44表达。MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究研究目的：检测niR-181b在AML细胞株中的表达水平,验证芯片结果；检测miR-181b在成人AML骨髓标本及健康对照组中的表达,分析其与临床特征的关系；明确miR-181b在AML耐药中的作用；预测并验证miR-181b的靶基因,进一步探讨miR-181b参与AML耐药发生发展的分子机制,为白血病治疗提供新的靶点。研究方法：1.标本采集：收集AML病患共80例,健康对照20例。AML患者骨髓标本包括初诊组（31例）,完全缓解组（37例）和复发/难治组（12例）。采用淋巴细胞分离液（Ficoll）密度梯度离心法分离骨髓标本中单个核细胞,-80℃保存备用。2. Taqman探针Real-time RT-PCR法检测miR-181b的表达情况：mirVanaTM miRNA Isolation试剂盒提取AML细胞株miRNA, MicroRNA Reverse Transcription （RT）试剂盒逆转录获得cDNA, Taqman探针Real-time RT-PCR方法检测AML敏感及耐药细胞株miR-181b表达水平,验证芯片结果。3. miR-181b在AML骨髓标本中表达情况检测：Taqman探针Real-time RT-PCR法检测AML患者及健康对照骨髓单个核细胞中miR-181b表达水平,分析miR-181b表达与临床疗效、病程及预后的相关性。4. miR-181b在AML耐药中的生物学作用研究。4.1细胞转染：分别将miR-181b mimic及其阴性对照miR-NC, miR-181b inhibitor及其阴性对照miR-inNC转染AML耐药细胞株K562/A02与HL60/ADM,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR方法检测转染后miR-181b表达情况。4.2CCK8法检测药物敏感性：将不同浓度梯度的DOX、Ara-C和IDA分别加入转染后的各组细胞,孵育48小时,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性并计算各组细胞对三种化疗药物的IC50值。4.3流式细胞术检测细胞凋亡：选取一定浓度的DOX、Ara-C和IDA分别作用与转染后各组细胞,作用48小时后,经AnnexinV/PI染色,流式细胞仪检测细胞凋亡率。5.确定miR-181b分子的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制。5.1生物信息学方法预测miR-181b分子可能调控的下游靶基因。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验检测miR-181b分子表达上调或是下调后下游靶基因HMGB1和Mcl-1表达水平。5.3双荧光素酶报告实验验证miR-181b与下游靶基因结合作用：分别构建HMGB1和Mcl-1基因3’-UTR区野生及突变型荧光素酶报告基因载体,转染HEK293细胞检测miR-181b上调后对荧光素酶活性的影响。6. HMGB1在AML耐药中的生物学作用研究。6.1Real-time RT-PCR、Western blot实验检测HMGB1在AML细胞株及上述收集AML患者及健康对照标本中mRNA及蛋白的表达情况,分析HMGB1与临床疗效、病程及预后的相关性。6.2设计合成HMGB1siRNA,转染AML耐药细胞株,48小时后收集细胞,应用Real time RT-PCR和Western blot检测转染后HMGB1表达情况。6.3CCK8实验检测转染后AML细胞药物敏感性：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物与各组细胞共孵育48小时后,CCK8法检测AML耐药细胞株对化疗药物敏感性的变化并比较各组细胞对三种化疗药物的IC50值。6.4流式细胞术检测转染后AML细胞凋亡：将DOX、Ara-C和IDA三种化疗药物作用于各组细胞48小时后, AnnexinV/PI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率。7.统计分析：应用SPSS17.0软件处理数据,采用t检验和Mann-Whitney U秩和检验对数据进行统计分析,P<0.05为差异有统计学意义。研究结果：1.验证芯片结果：miR-181b在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达较AML敏感株K562、HL60明显下降。2. miR-181b在AML患者骨髓标本中的表达水平：Real time RT-PCR结果显示miR-181b在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显低于健康对照组；初诊AML患者miR-181b表达水平较难治／复发组AML患者明显升高；完全缓解组AML患者miR-181b表达水平较初诊组和难治／复发组AML患者显着上调；健康对照组与完全缓解组相比较miR-181b表达水平无明显差异。3. miR-181b分子在AML多药耐药中的作用：3.1Real time RT-PCR结果显示：miR-181b mimic转染组AML细胞niR-181b表达水平较转染miR-NC组明显升高；miR-181b inhibitor转染组AML细胞miR-181b表达水平较转染miR-181binNC组明显降低。3.2miR-181b表达变化后对AML细胞药物敏感性的影响：miR-181b表达上调后,CCK8实验结果显示AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）对化疗药物的敏感性显着增强。3.3miR-181b表达变化后对化疗药物诱导的AML细胞凋亡影响：miR-181b表达上调后,AnnexinV/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率明显升高。4.确定miR-181b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的分子机制。4.1采用生物信息学软件（target scan和pictar）预测HMGB1和Mcl-1为miR-181b下游靶基因。4.2在AML耐药细胞株中过表达miR-181b可在转录后水平抑制HMGB1和Mcl-1表达。4.3双荧光素酶报告实验证实miR-181b直接结合于HMGB1和Mcl-13’-UTR区预测靶位点。5. HMGB1分子在AML耐药中的作用：5.1Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML耐药株K562/A02、HL60/ADM中表达水平明显高于AML敏感株K562、HL60。5.2Real-time RT-PCR、Western blot实验结果显示：HMGB1在AML初诊组和难治／复发患者组中表达明显高于健康对照组；初诊组和难治／复发组AML患者HMGB1表达水平较完全缓解组AML患者明显升高；初诊AML患者HMGB1表达水平低于难治／复发组AML患者；完全缓解组与健康对照组相比较HMGB1表达水平无明显差异。5.3Real-time RT-PCR、Western blot结果显示：设计合成的HMGB1siRNA转染AML耐药细胞株48小时后可有效下调HMGB1表达。5.4CCK8实验结果显示：HMGB1表达下调明显增加了AML耐药细胞株（K562/A02. HL60/ADM）对化疗药物的敏感性。5.5AnnexinV/PI染色流式细胞术检测细胞凋亡率显示：HMGB1表达下调后,化疗药物诱导的AML耐药细胞株（K562/A02、HL60/ADM）凋亡率显着升高。结论：1. miR-181b在AML耐药株和难治/复发病患骨髓标本中表达明显下调,提示miR-181b可能在AML耐药过程中有潜在抑癌基因作用。2.在AML耐药细胞株过表达miR-181b可明显增加AML耐药细胞对化疗药物的敏感性和化疗药物诱导的细胞凋亡。3. HMGB1和Mcl-1表达下调为miR-181b发挥逆转耐药作用的可能机制之一。
二、FasL抗体对人白血病细胞株(K562/ADM)多柔比星耐药性的逆转作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FasL抗体对人白血病细胞株(K562/ADM)多柔比星耐药性的逆转作用（论文提纲范文）
（1）中药逆转肿瘤多药耐药性的研究进展（论文提纲范文）
| 1 肿瘤MDR产生的机制 |
| 1.1 膜蛋白的异常改变 |
| 1.1.1 P-糖蛋白高度表达 |
| 1.1.2 多药耐药相关蛋白 |
| 1.1.3 乳腺癌耐药蛋白 |
| 1.1.4 肺耐药相关蛋白 |
| 1.2 凋亡调控基因介导的多药耐药 |
| 1.3 酶介导的多药耐药性 |
| 1.3.1 谷胱甘肽S转移酶 |
| 1.3.2 蛋白激酶C |
| 1.3.3 拓扑异构酶Ⅱ |
| 2 中药单体化合物对肿瘤MDR的逆转作用 |
| 2.1 黄酮类化合物 |
| 2.2 皂苷类化合物 |
| 2.3 生物碱类 |
| 2.4 中药成方制剂对肿瘤MDR的逆转作用 |
| 2.5 其他类 |
| 3 结语 |
（2）重楼皂苷Ⅰ逆转人乳腺癌细胞耐药的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 展望 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（3）逆转肿瘤细胞多药耐药活性的天然产物研究进展（论文提纲范文）
| 1 生物碱 |
| 1.1 苦参碱 |
| 1.2 粉防己碱 |
| 1.3 川芎嗪 |
| 1.4 甲基莲心碱 |
| 1.5 贝母素乙 |
| 1.6 蝙蝠葛碱 |
| 1.7 麻黄碱 |
| 1.8 乌头碱 |
| 1.9 千金藤素 |
| 1.10 龙葵碱 |
| 1.11 其他 |
| 2 黄酮 |
| 2.1 槲皮素 |
| 2.2 姜黄素 |
| 2.3 葡萄籽多酚 |
| 2.4 其他 |
| 3 苯丙素 |
| 3.1 五味子乙素 |
| 3.2 补骨脂素 |
| 3.3 蛇床子素 |
| 4 皂苷 |
| 4.1 三七总皂苷 |
| 4.2 野木瓜果实总皂苷 |
| 5 其他 |
| 5.1 白藜芦醇 |
| 5.2 雄黄 |
| 5.3 提取物和复方制剂 |
| 6 结语 |
（4）间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 中英文缩略词表（Abbreviations） |
| 第一章 研究背景 |
| 第一节 伊马替尼治疗慢性粒细胞性白血病的治疗现状及耐药机制 |
| 概述 |
| 1.1 慢性粒细胞性白血病的发病机制及治疗现状 |
| 1.2 伊马替尼治疗慢性粒细胞白血病产生耐药的机制及研究进展 |
| 第二节 间充质干细胞应用及与肿瘤相关性概述 |
| 概述 |
| 1.3 间充质干细胞来源及应用 |
| 1.4 间充质干细胞对肿瘤细胞的双重作用 |
| 1.5 脐带间充质干细胞的生物学特征及应用研究 |
| 第二章 伊马替尼耐药性K562细胞株的建立及特性 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 脐带间充质干细胞的分离、培养及鉴定 |
| 3.1 材料和方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 人脐带间充质干细胞逆转白血病细胞对伊马替尼和阿霉素的耐受性 |
| 4.1 材料和方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间完成的科研成果 |
| 致谢 |
（5）小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 小白菊内酯对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制及诱导凋亡作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 荧光染色检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞凋亡的影响 |
| 3.4 Western-blot法检测PTL对HCT-8、HCT-8/VCR细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 小白菊内酯对HCT-8/VCR细胞耐药逆转作用及机制研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 MTT法检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.2 流式细胞仪(Annexin V-FITC/PI染色)检测PTL对HCT-8/VCR的耐药逆转作用 |
| 3.3 Western-blot法检测PTL对HCT-8/VCR细胞P-gp、MRP、GST-π蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 大黄素通过调控PI3K/AKT信号通路诱导CACO-2凋亡的实验研究 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学处埋 |
| 3 结果 |
| 3.1 大黄素对CACO-2细胞的增殖抑制作用 |
| 3.2 大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响。 |
| 3.3 DAPI染色检测大黄素对CACO-2细胞凋亡的影响 |
| 3.4 流式细胞术检测大黄素对CACO-2细胞周期的影响 |
| 3.5 Western-blot法检测大黄素对CACO-2细胞Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 总结 |
| 本研究自我创新性评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 第一篇 结肠癌研究现状 |
| 1.1 结肠癌的流行病学研究现状 |
| 1.2 结肠癌的致病因素 |
| 1.3 结肠癌相关基因的研究进展 |
| 1.4 结肠癌的治疗 |
| 第二篇 肿瘤多药耐药逆转剂研究进展 |
| 2.1 化学药物逆转剂 |
| 2.2 基因治疗逆转剂 |
| 2.3 免疫逆转剂 |
| 2.4 中药逆转剂型 |
| 2.5 其它 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）姜黄素联合维拉帕米逆转人胆管癌细胞多药耐药性的实验研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 引言 |
| 第一部分 理论研究 |
| 1.中医对胆管癌的认识 |
| 2.现代医学对胆管癌的认识 |
| 3.肿瘤细胞的多药耐药性以及耐药模型的建立 |
| 4.肿瘤细胞多药耐药机制 |
| 5.肿瘤细胞多药耐药的逆转 |
| 第二部分 实验研究 |
| 1.材料和方法 |
| 2.实验结果 |
| 第三部分 讨论 |
| 1.耐药模型结果讨论 |
| 2.耐药机制结果讨论 |
| 3.姜黄素、维拉帕米联合逆转耐药的结果讨论 |
| 4.实验分析 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附录 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（7）斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 第一部分 斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤模型的建立 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 NC逆转人口腔上皮癌多药耐药细胞耐药性的研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 第三部分 NC对斑马鱼人口腔上皮癌移植瘤组织中TopoI、Ⅱα、ⅡβmRNA及蛋白表达的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 缩略词表 |
| 综述 肿瘤多药耐药模型建立方法的应用进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历及攻读学位期间获得的科研成果 |
（8）浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 中药逆转白血病耐药的机制研究进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 Wip1生理与病理研究进展 |
| 参考文献 |
| 前言 |
| 1 研究背景 |
| 2 研究思路 |
| 第二部分 实验研究 |
| 实验一 Wip1调控野生型p53的表达与急性髓系白血病进程相关性研究 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学处理 |
| 4 结果 |
| 5 结论 |
| 6 讨论 |
| 实验二 尾静脉注射HL60、HL60/ADR建立小鼠白血病模型 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 实验三 浙贝黄芩汤调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响 |
| 1 实验材料 |
| 2 方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 结论 |
| 5 讨论 |
| 第四部分 结语 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成绩 |
（9）miR-199a-5p调控自噬参与急性髓细胞白血病化疗耐药及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分 :mi R-199a-5p在急性髓细胞白血病中的表达和意义 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料与方法 |
| 2.1 实验对象 |
| 2.1.1 复发/难治急性髓细胞白血病患者及化疗后完全缓解的急性髓细胞白血病患者骨髓标本 |
| 2.1.2 白血病细胞系 |
| 2.1.3 miR-199a-5p引物序列 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 主要实验仪器 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 细胞培养 |
| 2.3.2 骨髓标本处理 |
| 2.3.3 细胞转染 |
| 2.3.4 细胞内总RNA提取 |
| 2.3.5 反转录 |
| 2.3.6 实时荧光定量PCR反应 |
| 2.3.7 CCK-8 检测细胞对化疗药物的敏感性 |
| 2.3.8 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 miR-199a-5p在急性髓细胞白血病患者中的表达 |
| 3.2 mi R-199a-5p在急髓白血病细胞株K562,HL60 及其多药耐药细胞株K562/ADM,HL60/ADM中的表达 |
| 3.3 miR-199a-5p mimic(inhibitor)转染效率验证 |
| 3.4 miR-199a-5p表达改变对K562和K562/ADM细胞药物敏感性的影响 |
| 4 讨论 |
| 第二部分 :自噬对急性髓细胞白血病细胞株K562和K562/ADM生存的影响 |
| 5 前言 |
| 6 实验材料与方法 |
| 6.1 实验材料 |
| 6.1.1 白血病细胞系 |
| 6.1.2 主要实验仪器 |
| 6.1.3 主要试剂 |
| 6.2 实验方法 |
| 6.2.1 MTT |
| 6.2.2 提取细胞总蛋白 |
| 6.2.3 BCA法蛋白质定量 |
| 6.2.4 Western blot检测细胞蛋白表达 |
| 6.2.5 统计学分析 |
| 7 结果 |
| 7.1 耐药细胞株鉴定 |
| 7.2 自噬相关蛋白LC3-II/I和 Beclin1在K562和K562/ADM中的表达 |
| 7.3 3-MA预处理K562和K562/ADM细胞对LC3-II/I和Beclin1 表达的影响 |
| 7.4 3-MA与阿霉素联合应用对K562/ADM细胞增殖的抑制作用 |
| 8 讨论 |
| 第三部分 :mi R-199a-5p通过调控自噬参与急性髓细胞白血病化疗耐药及机制 |
| 9 前言 |
| 10 实验材料与方法 |
| 10.1 实验材料 |
| 10.1.1 白血病细胞系 |
| 10.1.2 DRAM1 引物序列 |
| 10.1.3 DRAM1 干扰序列 |
| 10.1.4 主要实验仪器 |
| 10.1.5 主要试剂 |
| 10.2 实验方法 |
| 10.2.1 westernblot |
| 10.2.2 腺病毒感染 |
| 10.2.3 双荧光素酶报告基因检测 |
| 10.2.4 统计学分析 |
| 11 结果 |
| 11.1 miR-199a-5p表达对K562和K562/ADM细胞中自噬相关蛋白LC3-II/I,Beclin1和P62活性的影响 |
| 11.2 mRFP-GFP-LC3 串联荧光腺病毒法荧光显微镜下观察LC3 荧光 |
| 11.3 miR-199a-5p通过PI3K/AKT/mTOR信号通路调节白血病耐药细胞自噬 |
| 11.4 生物信息学预测mi R-199a-5p调节自噬相关的靶基因 |
| 11.5 DRAM1 在白血病细胞中的表达情况 |
| 11.6 DRAM1是mi R-199a-5p的直接靶基因的验证 |
| 11.7 DRAM1 表达下调对急髓白血病多药耐药细胞自噬活性的影响 |
| 11.8 DRAM1 表达下调对白血病耐药细胞化疗药物敏感性的影响 |
| 12 讨论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（10）急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分 MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控急性髓性白血病多药耐药性的机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. 耐药细胞株鉴定 |
| 2. MiRNA芯片筛选结果 |
| 3. TaqMan探针Real-time RT-PCR方法验证芯片结果 |
| 4. MiR-29b分子在AML患者及对照组骨髓标本中的表达 |
| 5. MiR-29b在AML耐药中的作用 |
| 6. 确定miR-29b的靶基因,进一步探讨其参与AML耐药的机制 |
| 7. AF1q在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 8. CD44在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 9. MiR-29b/AF1q/CD44作用轴调控作用研究 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MiR-181b在急性髓性白血病多药耐药中的作用及机制研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 1. miR-181b表达水平检测 |
| 2. 过表达miR-181b可逆转AML耐药细胞株耐药 |
| 3. miR-181b相关下游靶基因预测及验证 |
| 4. HMGB1在白血病多药耐药中的功能研究 |
| 5. HMGB1对Mcl-1表达的影响 |
| 讨论与总结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 文献综述 |
| 摘要 |
| Abstract |
| 一. MicroRNA生物学特性 |
| 二. MicroRNA调控肿瘤耐药相关蛋白 |
| 三. MicroRNA改变药物靶点 |
| 四. MicroRNA和细胞凋亡逃逸 |
| 五. MicroRNA和细胞周期调控 |
| 六. MicroRNA与肿瘤干细胞 |
| 七. MicroRNA转运 |
| 八. 总结与展望 |
| 参考文献 |
| 总结 |
| 文章创新点及意义 |
| 致谢 |
| 攻读学位期间发表的学术论文目录 |
| 攻读学位期间参加的学术会议 |
| 学位论文评阅及答辩情况表 |
| English articles Ⅰ |
| English articles Ⅱ |
四、FasL抗体对人白血病细胞株(K562/ADM)多柔比星耐药性的逆转作用（论文参考文献）
- [1]中药逆转肿瘤多药耐药性的研究进展[J]. 于海涛,付明娟. 中医临床研究, 2019(27)
- [2]重楼皂苷Ⅰ逆转人乳腺癌细胞耐药的作用及机制研究[D]. 柴冬亚. 昆明医科大学, 2019(05)
- [3]逆转肿瘤细胞多药耐药活性的天然产物研究进展[J]. 王俊敏,王慧杰,孙彦君,陈辉,郝志友. 中成药, 2019(04)
- [4]间充质干细胞逆转白血病K562细胞伊马替尼耐药性的研究[D]. 孙静. 兰州大学, 2018(02)
- [5]小白菊内酯及大黄素抑制肠腺癌细胞增殖作用机制的实验研究[D]. 马乾章. 中国医科大学, 2018(03)
- [6]姜黄素联合维拉帕米逆转人胆管癌细胞多药耐药性的实验研究[D]. 刘秀妃. 山西中医药大学, 2018(01)
- [7]斑马鱼模型评价氯化两面针碱逆转人口腔上皮癌多药耐药的研究[D]. 汤婷婷. 广西中医药大学, 2018(02)
- [8]浙贝黄芩汤通过调控Wip1对白血病模型化疗效果的影响[D]. 张坤. 北京中医药大学, 2018(01)
- [9]miR-199a-5p调控自噬参与急性髓细胞白血病化疗耐药及机制研究[D]. 李旸. 中国医科大学, 2017(04)
- [10]急性髓性白血病耐药相关miRNA分子功能及作用机制研究[D]. 卢菲. 山东大学, 2014(12)
标签：细胞凋亡论文; 急性髓性白血病论文; 急性淋巴细胞性白血病论文; 化疗药物论文; 慢性粒细胞白血病论文;