一、细胞周期素E、P21~(WAF1)在胃癌中的表达及意义（论文文献综述）
夏红[1]（2020）在《DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制》文中进行了进一步梳理二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）是大蒜中烯丙基硫化物的一种疏水性的有效药用成分,对多种肿瘤有明显的抑制作用,是一种很有开发潜力的抗肿瘤候选药物。人类DJ-1基因,又名RS/PARK7/CAP1,是PARK7基因编码的属于肽酶C56的蛋白质家族的一个成员。参与转录调控、氧化应激反应、线粒体调节、炎症以及糖基化损伤等许多生物学过程,在多种肿瘤中高表达,调控肿瘤进展、临床侵袭性、分化、癌细胞形态和药物敏感性,在癌症中扮演着关键角色。我们前期在鉴定二烯丙基二硫（diallyl disulfide,DADS）诱导白血病HL-60细胞分化的差异蛋白质中,发现DJ-1蛋白明显下调。本研究在DADS抑制人胃癌细胞增殖与迁移侵袭的基础上,进一步探讨DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性,证实DJ-1是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一,为临床胃癌分子靶向治疗提供理论依据。第一部分:DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义目的:探讨DJ-1、PTEN与p-Akt在胃癌中的表达及相应的临床病理意义。方法:采用免疫组织化学方法分别检测组织芯片中胃癌组织、癌旁组织以及正常胃粘膜组织中DJ-1、PTEN与p-AKT的表达。结果:DJ-1和p-Akt在胃癌组织中均呈高表达,与正常胃黏膜与癌旁组织相比,差异具有显着性意义（P<0.05）。并且,在癌旁组织表达明显高于正常胃黏膜（P<0.05）。在淋巴结转移组表达明显高于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显低于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。但在高分化、中分化、低分化胃腺癌中表达无显着性差异（P>0.05）。PTEN在正常胃粘膜组织中表达明显高于癌旁组织与胃癌组织（P<0.05）,在癌旁组织表达显着高于胃癌组织（P<0.05）。在淋巴结转移组明显低于无淋巴结转移组（P<0.05）。在Ⅰ+Ⅱ期表达明显高于Ⅲ+Ⅳ期（P<0.05）。而在高分化、中分化、低分化胃腺癌的表达具有显着差异（P<0.05）。三种蛋白在不同年龄和性别间表达无显着性差异（P>0.05）。Kaplan-Meier生存分析表明,DJ-1高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈负相关（P<0.05）。而PTEN高表达与胃癌患者的5年总体生存率呈正相关（P<0.05）。小结:1.DJ-1与p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌分化、淋巴结转移和TNM分期有关。3.DJ-1在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈负相关;PTEN在胃癌组织中的表达与胃癌患者的生存率呈正相关。第二部分:DADS下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭目的:探讨DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞系增殖、EMT和侵袭的影响。方法:建立DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系,分别采用CCK-8、划痕实验、侵袭实验、q RT-PCR、Western blot、细胞免疫荧光等分析DADS对DJ-1高表达人胃癌SGC-7901细胞增殖、EMT和侵袭的作用。结果:Western blot检测发现,经DADS 30mg/l处理24h后的各组胃癌细胞,和对照组相比,DJ-1的表达显着降低,其中,以SGC7901细胞差异最明显,以此选定SGC7901为后续试验的研究对象。进一步通过q RT-PCR与Western blot证实成功构建DJ-1稳定高表达的SGC-7901细胞系。CCK8检测发现,处理前,DJ-1高表达组24h、48h、72h与96h的增殖活性分别为0.579±0.082、0.886±0.153、1.138±0.124与1.344±0.194,较Vector组0.436±0.045、0.557±0.059、0.667±0.057与0.715±0.075呈时间依赖性增加（P<0.05）,表明高表达DJ-1可显着提高SGC7901细胞的增殖能力。而用DADS30mg/L处理24h、28h、72h与96h后,DJ-1高表达组的增殖活性分别为0.560±0.031、0.873±0.017、0.910±0.014与0.936±0.019,较DADS处理前显着降低（P<0.05）,表明DADS可部分抑制DJ-1的表达从而抑制SGC 7901细胞的增殖能力。划痕实验表明,DJ-1高表达能增强SGC-7901细胞的迁移能力。而用30 mg/l DADS处理48h后,DJ-1高表达组和空载体组细胞迁移能力均减弱,表明DADS能减弱DJ-1高表达对SGC7901细胞迁移的影响。Transwell侵袭实验发现,未加DADS组,DJ-1高表达组和空载体组穿过Matrigel基质胶的细胞数分别为179.7±6.0,251.3±4.0（P<0.05）,表明DJ-1高表达可明显促进S G C 7 9 01细胞的侵袭,而DADS 30mg/l处理24h后穿过基质胶的细胞数分别为87.3±7.1,130.0±8.5（P<0.05）,与未处理组相比明显减少。表明DADS能拮抗DJ-1高表达对SGC7901细胞侵袭能力的影响。Western blot证实,与空载体组相比,DJ-1高表达组中DJ-1和p-AKT蛋白表达显着增高,而PTEN表达显着降低,AKT表达无明显差异,EMT相关蛋白E-cadherin、TIMP3显着降低,Vimentin、Snail和MMP-9的表达则显着升高,提示DJ-1可通过抑制PTEN表达促进Akt的活化,进而启动EMT进程。而经DADS30mg/l处理24h后,DJ-1高表达组和空载体组的DJ-1表达明显下调,PTEN表达显着升高,p-Akt显着降低,而Akt水平无明显改变,EMT相关蛋白E-cadherin和TIMP3显着升高,Vimentin、Snail和MMP-9表达显着降低。证实DADS下调DJ-1可调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌细胞EMT。进一步的免疫荧光试验发现,与空载体组相比,DJ-1、Vimentin、TIMP3、MMP-9蛋白在DJ-1高表达组的荧光强度显着增强,表明DJ-1高表达促进EMT相关蛋白Vimentin、TIMP3、MMP-9的表达,而PTEN、E-cadherin在DJ-1高表达组的荧光强度显着减弱,表明DJ-1高表达可抑制PTEN、E-cadherin这两种蛋白的表达;而经DADS 30mg/l处理24h后,与未处理组相比较,各组DJ-1、Vimentin、MMP-9、TIMP3蛋白的细胞染色减弱,而PTEN、E-cadherin蛋白染色增加,表明DADS通过抑制DJ-1的表达从而影响PTEN及EMT相关蛋白表达的变化。小结:DADS可通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路从而抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。第三部分DADS下调DJ-1抑制SGC7901细胞对5-Fu的抗药性目的:探讨DADS下调DJ-1对SGC7901细胞增殖、凋亡与5-Fu敏感性的作用。方法:MTT分析与流式细胞术分别检测DADS在5-Fu不同浓度的情况下,对SGC7901细胞增殖与凋亡能力的影响。q RT-PCR、Western blot与免疫荧光分别检测DADS对各组SGC7901细胞中Bcl-2、XIAP、Caspase-3、MDR-1、P-gp表达水平的变化。结果:在不同浓度5-Fu处理24h后,DADS 30mg/l处理后的各组细胞其增殖抑制率分别较处理前明显提高（P<0.05）。但SGC7901/DJ-1细胞增殖抑制程度没有SGC7901与SGC7901/VCR细胞明显。表明DADS可抑制SGC7901与SGC7901/VCR细胞增殖能力和提高对5-Fu的敏感性。流式细胞术检测显示SGC7901/DJ-1细胞凋亡水平分别低于SGC7901与SGC7901/VCR（P<0.05）,SG C7901凋亡率高于SGC7901/VCR（P<0.05）。DADS处理后,各组凋亡水平分别较对照组凋亡水平均明显升高（P<0.05）。q RT-PCR与Western blot显示,SGC7901/DJ-1细胞MDR-1、P-gp、Bcl-2、XIAP较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显提高（P<0.05）,Caspase-3明显抑制（P<0.05）,DADS处理后,SGC7901、SGC7901/VCR和SGC 7901/DJ-1细胞中MDR-1、P-gp、Bc l-2及XIA P明显降低（P<0.05）。Caspase-3明显上调（P<0.05）。免疫荧光显示,在对照组中,SGC7901/DJ-1细胞P-gp、Bcl-2、XIAP的荧光强度较SGC7901及SGC7901/VCR细胞明显增强,而Caspase-3荧光强度则显着减弱;DADS处理后,三组细胞中P-gp、Bcl-2及XIAP蛋白与相对应的未处理组相比细胞染色降低,而Caspase-3染色增强。结果与q RT-PCR、Western Blot结果一致。小结:DADS下调DJ-1可促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。结论:1.DJ-1、PTEN、p-Akt蛋白在胃癌组织中的表达与胃癌发生、淋巴结转移和TNM分期有关。2.DADS通过下调DJ-1负调控PTEN/Akt通路抑制SGC-7901细胞增殖、EMT与侵袭。3.DADS下调DJ-1促进SGC7901细胞对5-Fu的敏感性,与抑制P-gp、MDR-1、Bcl-2及XIAP和促进Caspase-3有关。4.DJ-1可能是DADS抑制人胃癌细胞EMT与侵袭和抗药性的作用靶点之一。
薛云[2]（2020）在《SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义》文中提出目的:分析卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4和P21的异常表达情况及相关性,并分析三者表达与卵巢上皮性癌临床病理的关系,以寻找有效的卵巢上皮性癌的早期诊断及预后评估的指标。方法:收集2011-06～2015-08期间在我院妇科行手术切除治疗的卵巢上皮性癌患者48例的手术标本。另外收集同期在我院行手术治疗的卵巢良性肿瘤、交界性肿瘤各30例（浆液性、黏液性各15例）及因良性病变（如输卵管卵巢脓肿,子宫腺肌病合并严重子宫内膜异位症、严重的盆腔粘连等）行卵巢切除术的正常卵巢组织标本40例作为对照。采用SP免疫组化法检测标本中的SP1、KLF4和P21阳性表达情况,分析三者的关系及其与临床病理类型的关系,并分析三者对卵巢上皮性癌患者预后的影响。结果:（1）卵巢上皮性癌组织的SP1阳性率（72.9%）显着高于正常卵巢组织（7.5%）、卵巢良性肿瘤（6.7%）、卵巢交界性肿瘤（13.3%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的KLF4阳性率（29.2%）显着低于正常卵巢组织（87.5%）、卵巢良性肿瘤（86.7%）、卵巢交界性肿瘤（80.0%）（P<0.05）;卵巢上皮性癌组织的P21阳性率（25.0%）显着低于正常卵巢组织（67.5%）、卵巢良性肿瘤（66.7%）、卵巢交界性肿瘤（60.0%）（P<0.05）。（2）经Spearman等级相关分析显示SP1与KLF4、P21表达均呈负相关（r=-0.519,-0.481,P<0.01）;KLF4与P21表达呈正相关（r=0.462,P<0.01）。（3）Ⅲ～Ⅳ分期的SP1阳性表达率显着高于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）,Ⅲ～Ⅳ分期的KLF4、P21阳性表达率低于Ⅰ～Ⅱ分期（P<0.05）;随着分化程度的降低,SP1阳性表达率逐渐升高（P<0.05）,KLF4、P21阳性表达率逐渐下降（P<0.05）;有淋巴结转移的SP1阳性表达率显着高于无淋巴结转移者（P<0.05）,有淋巴结转移的KLF4、P21阳性表达率低于无淋巴结转移者（P<0.05）。（4）采用Kaplan-Meier法对患者进行生存分析,结果显示SP1、KLF4、P21阳性表达患者生存时间分别为10～60个月（中位时间40个月）、30～65个月（中位时间59个月）、30～65个月（中位时间60个月）;SP1、KLF4、P21阴性表达患者生存时间分别为25～65个月（中位时间60个月）、10～52个月（中位时间40个月）、10～52个月（中位时间40个月）。SP1阳性表达患者生存时间显着短于阴性表达患者（P<0.05）;KLF4、P21阳性表达患者生存时间显着长于阴性表达患者（P<0.05）。结论:（1）相比于正常卵巢组织、卵巢良性肿瘤、卵巢交界性肿瘤,卵巢上皮性癌中SP1蛋白阳性表达明显升高,KLF4、P21蛋白阳性表达明显降低。（2）卵巢上皮性癌组织中SP1蛋白表达与KLF4、P21蛋白表达呈负相关,KLF4蛋白表达与P21蛋白表达呈正相关。（3）SP1、KLF4、P21蛋白表达与卵巢上皮性癌病理分期、分化程度及淋巴结转移有关。（4）SP1蛋白表达异常升高,KLF4、P21蛋白表达下调均会导致卵巢癌患者生存时间缩短,因此,通过检测其表达水平有利于卵巢上皮性癌早期诊断和预后疗效评估。SP1、KLF4、P21基因也可能成为卵巢癌治疗的新靶点。
熊佳惠[3]（2020）在《基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制》文中进行了进一步梳理目的:基于网络药理学的方法,探讨附子理中汤对于晚期胃癌的作用机制。方法:首先,通过TCMSP数据库、Drug Bank数据库和Pharm Mapper平台对附子理中汤所含化学活性成分进行筛选并获取其作用靶点,再利用GAD、OMIM及CTD数据库获得胃癌的相关靶点;然后,利用Draw Ven Diagram平台制作韦恩图,获得两者的交集靶点蛋白,通过Cytoscape3.5.1软件构建出蛋白互作图;再通过DAVID分析工具和KOBAS3.0软件对搜集到的靶点蛋白从生物过程（biological process,BP）、分子功能（molecular function,MF）和细胞组分（cellular component,CC）三个方向进行基因本体功能富集分析和KEGG通路分析;最后,利用PDB数据库、Systems Dock Web Site数据库集进行受体-配体的分子对接,并分析docking scores,验证附子理中汤治疗晚期胃癌的有效性。结果:从TCMSP数据库筛选出附子理中汤的147种化学成分,其中预测到4791个靶点,通过CTD、OMIM筛选出28006个与胃癌相关的靶点,最后韦恩图确定附子理中汤治疗晚期胃癌存在346个潜在靶标;其中附子理中汤与胃癌相互作用的关键靶标有TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路,分子对接结果中表明STAT3对接分数最高,与附子理中汤有较好的结合性。结论:附子理中汤治疗晚期胃癌的关键靶点包括TP53（肿瘤抑制蛋白p53）、AKT1（蛋白激酶B）、CDKN1A（细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A）、STAT3（信号转导子与转录激活因子3）、BCL2L1（促生存因子）、JUN（核内癌基因）、CCND1（细胞周期素D1）、EGF（表皮生长因子）等,其主要作用机制可能涉及2-Oxocarboxylicacid metabolism（2-氧羧酸代谢）信号通路和Propanoate metabolism（丙酸盐代谢）信号通路等分子通路等,靶点STAT3与附子理中汤有较好的结合性,可能在附子理中汤治疗晚期胃癌的过程中发挥着至关重要的作用。
高梓茗[4]（2020）在《“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制》文中进行了进一步梳理目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是全球第四大最常见的恶性肿瘤,是导致癌症相关死亡的第二大原因。据统计,2018年超100万例新增胃癌病例,死亡78.3万人。手术联合放化疗仍是胃癌的首选治疗手段,D2淋巴结清扫加胃切除已成为标准治疗方法。且近年来,胃镜检查的普及有效地提高了胃癌的早期诊断率和长期生存率,但胃癌预后仍不理想,尤其是腹膜转移患者,其积极治疗后的中位总生存期仅为15.6个月。此外,在临床中,尽管无远处转移（M0期）的胃癌患者预后较好,但即使在相同的TNM期患者,生存异质性也较大。且由于消化道肿瘤的高侵袭性,大多数患者在晚期才被诊断出来,失去了治愈性切除的机会。因此,我们迫切需要更好地了解胃癌发生发展的机制,探寻有效的治疗靶点。方法:1.首先从GEO数据库中选取GSE79973芯片,探究其中胃癌差异基因表达。GSE79973共包括了10对胃癌组织和邻近非肿瘤粘膜组织的表达数据。采用DAVID进行GO/KEGG聚类分析,以筛选差异基因富集的通路;并通过STRING进行蛋白互作分析,构建重要的基因表达簇。此外,通过GEPIA数据库验证GSE79973芯片中部分差异基因表达情况,并采用Kaplan-Meier plotter探究该部分基因对胃癌预后的影响。2.收集于中国医科大学附属第一医院胃肠肿瘤外科行手术切除患者的胃癌组织行免疫组化分析,共48例。体外细胞功能实验（如Transwell、CCK-8及Edu等）探究LAMC1对胃癌细胞HGC27及MGC803细胞的增殖、侵袭转移能力的影响。Western blot实验探究LAMC1下游相关通路蛋白表达情况。裸鼠成瘤实验探究LAMC1对于胃癌细胞体内增殖、成瘤能力的影响。3.瞬转miR-195-5p模拟物（mimic）,检测下游LAMC1蛋白表达。双荧光素酶报告基因实验证实miR-195-5p可靶向结合LAMC1 mRNA的3’UTR。Real-time PCR证实,KLF4对miR-195-5p及LAMC1 mRNA的表达调控作用。在Rescue恢复实验中,过表达KLF4后抑制mi R-195-5p,并检测LAMC1表达水平。最终采用ChIP及双荧光素酶法明确KLF4与miR-195-5p启动子区域的结合位点。结果:1.在GSE79973中共1598个基因被证实为差异表达基因（|log FC|>1,p<0.01）,其中1298个表达上调基因,其余的330个为表达下调基因;通过GO/KEGG分析发现,1598个差异基因中与细胞黏附相关的基因共126个;2.经STING分析后,ITGA2、LAMC1、THBS2、NID2、FN1为重要的细胞粘附基因簇,且5种基因在胃癌中均为高表达,且ITGA2（HR=1.35,log rank p=0.037）、LAMC1（HR=1.38,log rank p=0.018）及THBS2（HR=0.77,log rank p=0.014）与患者预后密切相关;3.免疫组化及组织Western blotting实验均提示LAMC1在胃癌组织中呈高表达,并与患者的淋巴结转移状态（p=0.003）、TNM分期（p=0.006）密切相关;Kaplan Meier生存分析提示,LAMC1高表达患者的预后较差（Log rank p=0.036）;4.敲低LAMC1后,CCK-8及Edu提示胃癌细胞增殖能力明显下降;而Transwell提示胃癌的侵袭转移能力显着降低。通过裸鼠成瘤实验,我们证实LAMC1敲低可有效降低胃癌细胞成瘤能力;5.抑制LAMC1蛋白表达后,EMT（N-Cadherin、E-Cadherin）、ERK1/2通路（ERK1/2、p-ERK1/2）及细胞干性指标（Nanog、Sox2）的相关蛋白表达均显着改变;6.通过Western blotting及双荧光素酶法证实,miR-195-5p可靶向结合3’UTR区域并抑制LAMC1蛋白表达。7.Real-time PCR证实,KLF4可促进mi R-195-5p转录,并抑制LAMC1mRNA表达水平。8.Rescue恢复实验证实胃癌中存在“KLF4/miR-195-5p/LAMC1”调控轴;而ChIP及双荧光素酶法均证实KLF4可与miR-195-5p启动子区域靶向结合,并促进后者表达,其中结合位点碱基序列为GCCCACACCCAG。结论:1.ITGA2、LAMC1、THBS2、NID2、FN1在胃癌中是重要的差异基因,并可与胃癌的粘附、侵袭转移密切相关。其中ITGA2、LAMC1及THBS2可能会影响胃癌患者预后;2.组织蛋白表达验证LAMC1在胃癌中呈高表达,且与患者的淋巴结转移、TNM分期及预后情况相关;3.细胞实验提示LAMC1可促进胃癌的增殖、侵袭转移能力,并影响EMT、ERK1/2及干细胞相关通路蛋白表达;4.miR-195-5p可靶向结合LAMC1 mRNA的3’UTR,并抑制后者表达;KLF4在胃癌中作为转录因子,可靶向结合miR-195-5p启动子并促进后者转录,从而间接调控LAMC1蛋白表达。因此,在胃癌中存在“KLF4/miR-195-5p/LAMC1”调控轴,并起到重要的抑癌作用。
汪文杰[5]（2020）在《长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理背景和目的:胃癌（Gastric cancer,GC）是世界上最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位于全球癌症的第四位和第五位。中国的GC发病率和死亡率占到了全世界一半以上。总的来说,GC的发生是遗传因素和环境因素交互作用的结果。目前,手术切除仍然是GC治疗的主要方式。在中国,通常超过80%的患者在初诊时就被诊断为进展期GC,术后5年生存率不到30%。尽管近年来在GC的治疗方面取得了很大的进步,但GC患者的生存率仍然很低。因此,亟需寻找GC新的分子生物标记物和特异的治疗靶点。随着高通量测序技术的发展,以往被认为是转录“噪音”和“垃圾”的长链非编码RNA（Long non-coding RNA,lncRNA）引起了许多科学家的关注。研究发现lncRNA具有高度的组织特异性,并且参与了肿瘤细胞的多种生物学过程。此外,lncRNA可以通过表观遗传修饰、转录调控、转录后调控等多种方式参与肿瘤的发生和发展。尽管lncRNA在GC的研究中仍然属于探索阶段,但还是发现了一些lncRNA可能在GC的病变过程中起关键作用,这也为GC的诊断和治疗提供了新思路。因此,lncRNA具有成为GC诊断生物标记物和治疗靶标的巨大潜力。本研究选择lncRNA癌症易感候选物19（Cancer susceptibility candidate 19,CASC19）作为研究对象,CASC19位于被称为基因沙漠的染色体8q24.21区域,目前在GC中的功能未见报道。我们前期对癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TCGA）数据库进行深入挖掘,发现CASC19在GC中上调,并且与GC的浸润深度、TNM分期、远处转移和总体生存期（Overall survival,OS）显着相关。然后,利用cDNA末端快速扩增（Rapid amplification of cDNA ends,RACE）实验获得了CASC19在GC细胞中存在的717bp全长序列,并通过UCSC确认这是个新的转录本。我们在临床样本,细胞模型和动物模型中对CASC19在GC中作用和调控机制进行一系列实验验证,以期为GC的诊断和治疗提供参考。研究方法:1.通过TCGA数据库获取了375位GC患者的RNA测序和临床性状数据,利用加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis,WGCNA）和差异基因表达分析相结合的方法,筛选与GC进展和预后相关的lncRNA。然后,分析目的lncRNA表达与临床病理参数和预后的关系。最后,进行基因集富集分析（Gene set enrichment analysis,GSEA）探索lncRNA相关的信号通路。2.收集了联勤保障部队第九四〇医院普通外科和兰州大学第一医院肿瘤外科从2019年9月1日至2020年1月30日手术切除的80对新鲜GC组织和癌旁对照组织。利用实时荧光定量PCR（Real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测CASC19在GC组织和癌旁对照组织中的表达水平,并分析CASC19的表达与患者临床病理参数之间的关系以及与下游靶基因NPM1的相关性。采用受试者工作特征（Receiver operator characteristic,ROC）曲线评估CASC19在GC诊断中的意义。3.采用qRT-PCR检测CASC19在人GC细胞系（AGS,BGC-823,MGC-803,HGC-27和MKN-45）和正常胃粘膜上皮细胞系（GES-1）中的表达水平。采用RACE实验鉴定CASC19在GC细胞中的全长序列。制备CASC19 shRNA和过表达慢病毒,shRNA慢病毒感染MKN-45和BGC-823细胞,过表达慢病毒感染HGC-27和AGS细胞,用qRT-PCR检测敲减和过表达效率。采用CCK-8实验、细胞克隆形成实验和EdU细胞增殖实验检测CASC19对GC细胞增殖能力的影响。采用细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验检测CASC19对GC细胞迁移和侵袭能力的影响。采用流式细胞术和蛋白质免疫印迹（Western Blot,WB）实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响。采用WB实验检测CASC19对上皮间质转换（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）相关蛋白E-cadherin,Vimentin和N-cadherin表达的影响。4.用带有Luciferase标签的CASC19 shRNA慢病毒和MKN-45细胞构建稳转细胞株。选用4-5周龄BALB/c-nu雄性裸鼠用于动物实验,将10只裸鼠随机分为sh-CASC19组和sh-NC组两个组,每组5只。将两组细胞注射于裸鼠肩胛下构建裸鼠皮下移植瘤模型,每天测量肿瘤体积,期间利用小动物活体成像仪监测肿瘤生长状态。饲养4周处死裸鼠,取下肿瘤后一半用10%中性福尔马林溶液固定,另一半放入液氮罐保存。采用qRT-PCR实验检测移植瘤中HDAC1和NPM1mRNA的表达。采用IHC实验和WB实验检测移植瘤中Ki-67,PCNA,HDAC1和NPM1蛋白的表达。5.通过基因芯片技术检测CASC19敲减后下游功能基因的表达,进而鉴定CASC19可能调控的下游靶基因,并结合创新途径分析（Ingenuity pathway analysis,IPA）软件进行经典通路分析,上游调控分析,疾病和功能分析,调控效应分析和相互作用网络分析。然后选择30个差异表达的基因（Differentially expressed gene,DEG）进行qRT-PCR验证。6.通过核质分离实验来确定CASC19在GC细胞中的亚细胞定位。采用RNA pull-down实验检测与CASC19相互作用的蛋白质。采用RNA纯化染色质分离（Chromatin Isolation by RNA Purification,ChIRP）实验检测与CASC19同时作用的蛋白质和基因,分别用质谱分析（Mass spectrometry,MS）和测序（Sequencing,Seq）鉴定下游蛋白质和基因。采用WB实验检测RNA pull-down洗脱产物中HDAC1蛋白的表达。采用RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA-binding protein immunoprecipitation,RIP）实验来反向验证HDAC1蛋白与CASC19的相互作用。采用HDAC1的染色质免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation,ChIP）实验检测与HDAC1相互作用的基因。采用ChIP-qPCR实验验证HDAC1与NPM1启动子的结合。采用双荧光素酶报告基因实验验证CASC19和HDAC1同时与NPM1启动子的结合。采用ChIP-qPCR实验验证MYC与CASC19启动子的结合。研究结果:1.通过WGCNA方法确定CASC19作为核心lncRNA用于接下来的分析和验证。CASC19在TCGA数据库GC样本中上调,其过表达与T分期（P=0.034）,TNM分期（P=0.022）和淋巴结转移（P<0.001）显着相关。CASC19过表达GC患者的OS明显短于CASC19低表达的患者（P=0.015）。Cox分析显示CASC19过表达是影响GC患者OS的独立危险因素（HR=1.524,95%CI=1.003-2.316,P=0.049）。GSEA分析显示CASC19过表达引起变化的下游大多数基因富集在癌症相关信号通路和经典信号通路上。2.CASC19在GC组织中显着上调,其表达量是癌旁对照组织中的4.2倍。CASC19表达与GC肿瘤大小（P<0.001）,浸润程度（P=0.011）,TNM分期（P<0.001）和淋巴结转移（P=0.003）呈正相关。CASC19的结合蛋白HDAC1在GC组织中上调,而CASC19的下游靶基因NPM1在GC组织中下调,并且NPM1的表达与CASC19负相关（R=-0.361,P=0.001）。相对于癌旁对照组织,HDAC1mRNA和蛋白在GC组织中过表达,而NPM1 mRNA和蛋白在GC组织中低表达。CASC19在ROC曲线下的面积（Area under the curve,AUC）为0.952（95%CI:0.920-0.984,P?<?0.0001）,提示CASC19对GC的诊断效果较好。3.CASC19在人GC细胞系中表达上调,其在GC细胞中的全长为717bp。UCSC网站、CPAT工具和ORFfinder网站均显示CASC19不具备蛋白质编码能力。shRNA慢病毒在MKN-45和BGC-823细胞中成功下调CASC19的表达,过表达慢病毒在AGS和HGC-27细胞中成功上调CASC19的表达。CASC19下调会抑制MKN-45和BGC-823细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而促进MKN-45和BGC-823细胞的凋亡。相反,CASC19上调会促进HGC-27和AGS细胞的增殖、迁移和侵袭能力,而抑制HGC-27和AGS细胞的凋亡。此外,CASC19下调后MKN-45和BGC-823细胞中抗凋亡蛋白Bcl-2和间质蛋白Vimentin和N-cadherin表达降低,而凋亡蛋白Casepase-3,Casepase-7和Casepase-9以及上皮蛋白E-cadherin表达升高。CASC19上调后HGC-27和AGS细胞中Bcl-2,Vimentin和N-cadherin蛋白表达升高,而Casepase-3,Casepase-7,Casepase-9和E-cadherin蛋白表达降低。4.sh-CASC19组裸鼠皮下移植瘤的体积和重量明显小于sh-NC组,HE染色发现sh-NC组肿瘤细胞出现的核体积增大、核分裂像增多、瘤巨细胞等恶性增殖现象明显多于sh-CASC19组。Ki-67和PCNA蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显低于sh-NC组。HDAC1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平与sh-NC组无显着差异。NPM1 mRNA和蛋白在sh-CASC19组移植瘤中的表达水平明显高于sh-NC组。5.CASC19敲减引起1,433个DEG上调,369个DEG下调。IPA分析显示CASC19可能与THBS1和TGFBR2作用,进而影响GC细胞的增殖和凋亡。选择30个DEG进行qRT-PCR验证,与芯片实验结果一致。6.CASC19主要分布于GC细胞核内,提示CASC19可能通过表观遗传调控起作用。RNA pull-down和ChIRP-MS实验确定了96个与CASC19可能结合的蛋白,生物信息学预测到CASC19与组蛋白修饰蛋白HDAC1之间存在结合区域。WB和RIP实验证明HDAC1可直接与CASC19结合,上下调CASC19后HDAC1mRNA和蛋白的表达没有显着差异,证明HDAC1不受CASC19的调控。ChIRP-seq和HDAC1的ChIP-seq实验确定了281个HDAC1与CASC19在基因组上可能共同调控的基因。生物信息学分析表明NPM1基因启动子区域出现peak-calling峰,提示CASC19可能结合在NPM1启动子上。ChIP-qPCR实验发现下调CASC19降低了HDAC1与NPM1启动子的结合。上下调CASC19和HDAC1,qRT-PCR和WB实验证明NPM1受CASC19和HDAC1的调控。双荧光素酶报告基因实验确认CASC19通过招募HDAC1共同结合到NPM1启动子上,从而抑制NPM1的表达。此外,ChIP-qPCR实验表明MYC可结合在CASC19启动子上,qRT-PCR实验证明MYC增加CASC19的表达。结论:本课题通过挖掘TCGA数据库,发现位于染色体8q24.21区域的lncRNA CASC19在GC中上调,并且与GC的进展和预后相关。通过RACE发现CASC19在GC细胞中存在717bp的长度。我们在GC细胞系,GC临床样本和动物模型中对CASC19进行了一系列体外体内验证,证明了CASC19在GC中是一个癌基因。CASC19主要分布于GC细胞核内。在机制上,CASC19通过募集HDAC1至NPM1的启动子区域,使NPM1的启动子区域组蛋白去乙酰化,抑制了NPM1的转录活性,从而降低进NPM1的表达。此外,我们还发现CASC19在上游受到转录因子MYC的调控。我们的研究发现了CASC19通过表观修饰抑制NPM1表达的一种新机制,为更好地理解lncRNA在GC中的作用和机制增加了新的证据。CASC19有望成为GC潜在的诊断标志物和治疗靶点。
赵依纳[6]（2019）在《膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究》文中研究表明胃癌（gastric cancer,GC）是全球常见恶性肿瘤,严重威胁人类健康。据2017年2月,国家癌症中心发布的中国最新癌症数据显示,胃癌位于我国癌症发病率第四位,死亡率第二位。化疗作为肿瘤的传统治疗手段,存在有效率低、不良反应大以及获得性耐药等问题。分子靶向治疗由于具有较好的分子选择性,可高效杀伤肿瘤细胞,减少对正常组织的损伤,因而成为肿瘤患者的主要治疗方式之一。因此,寻找阳性表达率高的基因靶点并探讨其作用机制已成为当前胃癌分子靶向治疗的迫切需要。膜联蛋白（annexin,ANX）是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白家族,该家族多个成员的表达异常与肿瘤细胞的恶性程度、转移侵袭及临床进展密切相关。多项研究表明,该家族成员膜联蛋白A7（ANXA7）表达异常与胃癌的发生、发展密切相关,许多学者已将ANXA7作为分子靶点,从多种角度探索其在肿瘤发生发展与治疗方面的作用。p21是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂,作为KIP家族的代表,不仅可以抑制CDK4/6-cyclinD和CDK2-cyclin E复合体的结合,使细胞G1→S期受阻;还可以通过与PCNA相互作用抑制DNA聚合酶延伸DNA从而抑制细胞增殖。多项研究证实p21的表达失调参与影响了胃癌的发生发展。但对于ANXA7与p21在胃癌中的相关性研究,目前国内外尚未见报道。本研究拟通过检测ANXA7和p21在胃癌中的表达,分析二者相关性;而后在体外水平改变ANXA7的表达,检测其对胃癌细胞产生的影响,并探讨其影响胃癌发生发展的机制,以初步阐明ANXA7可通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴影响胃癌的发生发展,同时为ANXA7成为临床胃癌靶向治疗的潜在靶点提供新的实验依据,具有重要的临床意义。目的:1组织水平:通过检测ANXA7与p21在胃癌组织及癌旁正常胃粘膜组织中的表达,探讨ANXA7、p21在胃癌中的表达与胃癌临床病理学特征的关系及二者的相关性。2细胞水平:通过下调ANXA7在胃癌细胞中的表达,探讨ANXA7低表达对人胃癌细胞增殖的影响及其机制。方法:1组织水平:于2016年9月至2018年5月收集承德医学院附属医院及承德市中心医院共50例胃癌石蜡组织标本及20例新鲜胃癌组织标本,每例标本包含胃癌组织和相应癌旁正常胃粘膜组织。采用免疫组织化学SP法检测50例石蜡组织标本中ANXA7和p21的表达;采用Western blot方法检测20例新鲜组织标本中ANXA7和p21的表达。2细胞水平:（1）体外培养人正常胃粘膜GES-1细胞、人胃腺癌高分化MKN-28细胞、人胃腺癌中分化SGC-7901细胞和人胃腺癌低分化MGC-803细胞,采用Western blot法检测ANXA7表达最高的一株细胞。（2）将ANXA7表达最高的胃癌细胞分为si-ANXA7组、阴性对照组（si-con）和空白对照组（blank）,采用RNA干扰技术将靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA脂质体转染法分别转染胃癌细胞,空白组不予任何处理,转染后48h分别采用qRT-PCR和Western blot法在mRNA水平和蛋白水平进行抑制效率的鉴定。（3）MTT和平板克隆形成实验检测细胞增殖能力。（4）流式细胞术检测细胞周期分布情况。（5）qRT-PCR和Western blot法在mRNA和蛋白水平检测p21、PCNA、cyclinD1、cyclin E、E2F1的表达情况。结果:1组织水平:（1）免疫组化实验结果显示ANXA7在胃癌组织中的阳性表达显着高于癌旁正常胃粘膜组织,差异具有统计学意义（P<0.05）。p21在胃癌组织中的阳性表达显着低于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）;ANXA7在胃癌组织中的差异表达与肿瘤的分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关,差异有统计学意义（P<0.05）;p21在胃癌组织中的差异表达与肿瘤的浸润深度有关,差异有统计学意义（P<0.05）。42例ANXA7阳性表达的胃癌患者中p21阳性表达的有10例（24%）,p21阴性表达的有32例（76%）;8例ANXA7阴性表达的胃癌组织中p21阳性表达的有5例（63%）,p21阴性表达的有3例（37%）,经Spearman相关性分析显示胃癌组织中ANXA7和p21的表达呈负相关（χ2=4.79,P<0.05,rs=-0.31）。（2）Western Blot实验结果示,胃癌组织中ANXA7蛋白的表达显着高于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）;胃癌组织中p21的表达显着低于癌旁正常胃粘膜组织,差异有统计学意义（P<0.05）。2细胞水平:（1）胃癌细胞中ANXA7的表达显着高于正常胃粘膜GES-1细胞中ANXA7的表达,且ANXA7在人胃腺癌低分化MGC-803细胞株中表达最高,差异有统计学意义（P<0.05）。（2）靶向ANXA7的siRNA可显着抑制ANXA7的表达,差异有统计学意义（P<0.05）。（3）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组细胞增殖显着抑制,差异有统计学意义（P<0.05）。（4）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组细胞G1期阻滞显着,差异有统计学意义（P<0.05）。（5）ANXA7表达受抑后,与阴性对照组和空白对照组比,si-ANXA7组PCNA、cyclinD1、cyclinE、E2F1的表达明显下调差异有统计学意义（P<0.05）;p21的表达显着上调,差异有统计学意义（P<0.05）。结论:1 ANXA7在胃癌中显着高表达,且其在胃癌中的差异表达与肿瘤的分化程度、浸润深度及有无淋巴结转移密切相关;而p21在胃癌中显着低表达,且其在胃癌中的差异表达与肿瘤的浸润深度相关。2 ANXA7与p21在胃癌中的表达具有负相关关系。3 ANXA7可通过调控p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴影响细胞周期,进而促进细胞增殖。
陈红梅[7]（2018）在《ESCO2基因在胃癌细胞增殖和周期中的作用及机制研究》文中研究说明目的:ESCO2基因表达产物是建立和维持染色体内聚的重要调节蛋白,而染色体内聚直接决定了染色体分离的精准性和染色体稳定性。已知染色体不稳定是胃癌发生的重要机制,但是ESCO2基因与胃癌的关系目前尚不清楚。本研究对ESCO2基因在胃癌发生中的作用和机制展开研究,为胃癌的诊疗提供新的潜在分子靶点。方法:采用生物信息学分析TCGA数据库中胃腺癌样本数据;免疫组织化学法检测胃腺癌组织芯片的蛋白表达;选用shRNA、sgRNA慢病毒及过表达腺病毒分别感染胃癌AGS、BGC-823、SGC-7901、MKN-74细胞系;CCK-8实验检测胃癌细胞活性,EdU细胞增殖实验检测DNA复制活性,细胞克隆形成实验检测细胞增殖能力;细胞划痕和Transwell迁移实验检测细胞迁移能力;Annexin V-APC单染-FACS检测细胞凋亡,PI-FACS检测细胞周期;裸鼠成瘤实验检测在体肿瘤生长情况;蛋白表达芯片、相对定量蛋白质组学、定量PCR和蛋白印迹实验检测细胞增殖和周期相关信号分子的表达;Co-IP实验分析蛋白相互作用。结果:1、TCGA数据库的胃腺癌组织中ESCO2 mRNA表达水平显着高于正常胃黏膜,且该基因表达水平与亚洲黄种人胃癌肿瘤分期呈负相关、与预后呈正相关;胃腺癌组织芯片中癌组织的ESCO2蛋白表达水平明显高于癌旁组织。2、ESCO2基因敲减可抑制胃癌细胞增殖活性,过表达结果与之相反;ESCO2基因敲减可抑制胃癌细胞DNA复制活性和细胞克隆形成,并促进胃癌细胞早期凋亡;ESCO2基因敲减可使胃癌细胞被阻滞于G2/M期,反之G2/M期细胞减少。敲除ESCO2基因可显着抑制胃癌细胞增殖活性并促进细胞凋亡。3、ESCO2基因敲减后能显着下调mTOR及其下游S6K1和RPS6蛋白的磷酸化水平,并明显上调mTOR上游的AMPKα蛋白磷酸化水平。而且,ESCO2基因敲减后有14个差异表达蛋白与细胞周期调控直接相关,这些差异蛋白在p53信号通路、泛素化蛋白水解和细胞周期通路的“crosstalk”处明显富集;并且,ESCO2基因敲减可促进p53和p21表达,并抑制Skp2和CyclinB1表达。胃癌细胞中存在ESCO2蛋白和p53蛋白的相互作用。ESCO2基因敲减可抑制裸鼠皮下瘤体大小和瘤重。结论:ESCO2基因在胃腺癌组织高表达;该基因促进胃癌细胞增殖并调控细胞周期,这些调控作用可能与mTOR信号分子和p53/p21/CyclinB1信号通路有关;ESCO2基因敲减可抑制裸鼠成瘤。该基因是胃癌个体化治疗的潜在分子靶点。
许曼曼[8]（2018）在《Krüppel-like转录因子ZNF148在发育与疾病中的功能研究》文中指出转录因子ZNF148属于Krüppel型（Cys2-His2-type）锌指家族,由794个氨基酸组成。ZNF148对转录具有双重作用,可以作为激活因子或抑制因子调控基因转录。ZNF148在人类疾病,尤其是癌症中可能发挥重要作用。然而,ZNF48调控基因转录的分子机制及其在发育中的作用目前尚未明确。研究表明ZNF148的同源物ZFP281对于维持小鼠胚胎干细胞（mESC）多能性是必需的。因在本篇研究中,我们将利用小鼠胚胎干细胞为模型,并结合生化及基因组学手段探究ZNF148在mESC自我更新及多向分化潜能中的作用及分子机制。为了寻找ZNF148相互作用的蛋白,我们实验室纯化了ZNF148蛋白进行质谱分析发现了NuRD复合物。我们利用内源性免疫沉淀验证了ZNF148与核小体重构和脱乙酰基复合物（NuRD）的相互作用。通过构建ZNF148截短蛋白证明了其N端1-160aa对于ZNF148和MBD3的相互作用是必要的,而ZNF148与CHD4的相互作用则依赖于ZNF148的528-600aa。为了研究Znf148在mESC中的功能,我们构建了Znf148敲除细胞系。ZNF148染色质免疫共沉淀（ChIP）实验显示ZNF148蛋白能够富集在胚胎干细胞多能性标志性因子Nanog的启动子处。RNA-seq结果提示在Znf148敲除以后胚胎干细胞多能性标志分子Nanog,Sox2,Oct4在转录水平上并无显着性变化,说明Znf148不参与胚胎干细胞的自我更新。我们随后对RNA-seq结果进行的差异性基因表达分析,发现共有60个基因会呈现差异性表达。其中,在干细胞多向分化潜能中发挥重要作用的,Zscan4家族基因显着下调。有趣的是NuRD复合物已知功能是转录抑制,而敲低其亚基Mbd3与Mta2却能够下调Zscan4家族基因。ZNF148与NuRD复合物是否共同调控Zscan4家族基因的转录有待于进一步的研究。此外,在本篇研究中我们还发现ZNF148在弥散性胃腺癌中高表达,而且ZNF148的表达与胃癌的预后生存率呈现负性相关,我们利用CRISPR-Cas9技术构建了ZNF148敲除的胃癌细胞系,为下一步研究ZNF148-NuRD复合物弥散性胃腺癌中的潜在作用机制提供基础。
张波,曾帮智,张博,张茜,吕晓玥[9]（2017）在《胃癌组织中p53、p21WAF1蛋白的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系研究》文中提出目的:研究胃癌组织中磷蛋白53（P53）、磷蛋白21野生型p53活化片段（p21WAF1）蛋白的表达及与幽门螺杆菌L型（Hp-L）感染的关系。方法:选择我院2013年1月至2017年1月病理确诊为胃癌的标本220例为胃癌组,另外选取胃癌组织旁的健康组织为对照组。Hp-L采用快速尿素酶测试法、Giemsa染色法检测,P53、p21WAF1阳性表达采用HE法及免疫组化法测定,并采用Spearman等级检验分析其相关性。结果:胃癌组p53阳性表达率显着高于对照组（P<0.05）;p21WAF1阳性表达率显着低于对照组（P<0.05）,胃癌组织中p53和p21WAF1表达呈负相关（P<0.05）。胃癌组Hp-L阳性感染率显着高于对照组（P<0.05）;胃癌组Hp-L阳性组p53阳性表达率显着高于于阴性组（P<0.05）;p21WAF1阳性表达率显着低于阴性组（P<0.05）,胃癌组织中p53与Hp-L阳性表达呈正相关（P<0.05）,p21WAF1与Hp-L阳性表达呈负相关（P<0.05）,p53阳性表达仅与浸润程度有关（P<0.05）,P21WAF1表达与病理分级、浸润程度、UICC分期有关（P<0.05）。结论:Hp-L是胃癌发生的主要诱因,癌症发展过程中,Hp-L型感染可上调p53表达、抑制p21WAF1表达,且p53、p21WAF1的表达变化与细胞浸润程度有密切联系,对胃癌的临床治疗具有重要作用。
霍奇[10]（2017）在《MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究》文中指出大量研究结果显示MDIG基因与人类多种恶性肿瘤（如食管癌、胃癌、结肠癌和肺癌等）的发展及预后相关,但是MDIG在肝细胞癌中的功能及调控机制尚不清楚。本研究中,我们发现在肝细胞癌细胞中过表达IKZF1或干扰IKZF1的表达可以影响MDIG的表达水平,MDIG与IKZF1两者之间的m RNA表达水平呈负相关性。染色质免疫沉淀实验（Ch IP）结果显示,IKZF1直接结合MDIG的启动子区域,在转录水平上调控MDIG的表达。体外功能实验结果显示,MDIG促进肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,稳定干扰MDIG表达抑制肝细胞癌细胞增殖、侵袭与迁移,裸小鼠肝脏原位成瘤实验结果显示MDIG促进肝细胞癌细胞体内成瘤。体外进一步实验显示,MDIG降低肝细胞癌细胞对药物索拉菲尼（sorafenib）的敏感性。MDIG含有组蛋白去甲基化酶,实验结果显示,肝细胞癌细胞中MDIG影响组蛋白3赖氨酸9三甲基化表达水平（H3K9me3）,H3K9me3在表观遗传上调控p21（CIP1/WAF1）的表达,染色质免疫沉淀实验结果显示,H3K9me3直接结合p21（CIP1/WAF1）的转录区而影响其表达水平。本研究通过免疫组织化学染色对155例原发性肝细胞癌患者临床样本分析,发现MDIG在肝细胞癌中表达高于配对的癌旁组织,MDIG表达与病理组织学分级和乙型肝炎病毒感染呈正相关。研究结果提示,MDIG在肝细胞癌中促进肝细胞癌细胞的增殖,有望作为临床治疗肝细胞癌的一个候选分子靶标。
二、细胞周期素E、P21~(WAF1)在胃癌中的表达及意义（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、细胞周期素E、P21~(WAF1)在胃癌中的表达及意义（论文提纲范文）
（1）DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 主要英文缩略语索引 |
| 第一部分 DJ-1、PTEN、p-Akt在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 病例资料 |
| 2.1.2 主要实验仪器 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 主要溶液配制 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 免疫组化染色 |
| 2.2.2 结果判定 |
| 2.2.3 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DJ-1 蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.1.1 DJ-1 蛋白在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.1.2 DJ-1 表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 3.1.3 DJ-1 表达与胃癌预后的关系 |
| 3.2 PTEN蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.2.1 PTEN在在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.2.2 PTEN表达与临床胃癌病理指标的关系 |
| 3.2.3 PTEN表达与胃癌预后的关系 |
| 3.3 p-Akt蛋白在胃癌中的表达及临床病理意义 |
| 3.3.1 p-Akt在胃正常组织、癌旁组织与胃癌中的表达 |
| 3.3.2 p-Akt表达与胃癌临床病理指标的关系 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 DADS下调DJ-1 负调控PTEN/Akt通路抑制人胃癌SGC-7901 细胞EMT与侵袭 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 实验质粒、载体、细胞株、菌株及慢病毒系统 |
| 2.1.3 主要试剂 |
| 2.1.4 关键试剂的配置 |
| 2.1.5 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 DJ-1 过表达慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 2.2.3 慢病毒转染SGC-7901 细胞以及稳定转染细胞株的筛选 |
| 2.2.4 q RT-PCR(荧光定量PCR) |
| 2.2.5 Western blot检测 |
| 2.2.6 CCK8 增殖实验 |
| 2.2.7 划痕愈合实验 |
| 2.2.8 Transwell侵袭实验 |
| 2.2.9 细胞免疫荧光 |
| 2.2.10 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS对各胃癌细胞系DJ-1 表达的影响 |
| 3.2 慢病毒载体构建及病毒包装 |
| 3.3 DJ-1 高表达稳定细胞系的构建 |
| 3.4 qPCR检测DADS处理和转染细胞DJ-1 的表达水平 |
| 3.5 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞增殖能力的影响 |
| 3.6 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞迁移能力的影响 |
| 3.7 DJ-1与DADS对人胃癌SGC7901 细胞侵袭能力的影响 |
| 3.8 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞DJ-1/PTEN/AKt信号通路的影响 |
| 3.8.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞PTENm RNA表达的影响 |
| 3.8.2 DADS 与DJ-1高表达对SGC7901细胞PTEN/AKt信号通路蛋白表达的影响 |
| 3.9 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌SGC7901 细胞EMT相关分子的影响 |
| 3.9.1 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子m RNA的影响 |
| 3.9.2 DADS与 DJ-1 高表达对SGC7901 细胞EMT相关分子蛋白表达的影响 |
| 3.10 细胞免疫荧光检测DJ-1、PTEN及 EMT相关蛋白的定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 DADS下调DJ-1 抑制人胃癌SGC7901 细胞对5-Fu的抗药性 |
| 第1章 绪论 |
| 第2章 材料与方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 细胞系 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 常用试剂的配置 |
| 2.1.4 主要仪器与设备 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 细胞培养与传代 |
| 2.2.2 qRT‐PCR(荧光定量 PCR) |
| 2.2.3 Western Blot检测 |
| 2.2.4 MTT法检测细胞增殖能力 |
| 2.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 |
| 2.2.6 细胞免疫荧光实验 |
| 2.2.7 统计学分析 |
| 第3章 结果 |
| 3.1 DADS与 DJ-1 高表达对各种SGC7901 细胞增殖的影响 |
| 3.2 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞SGC7901 凋亡的影响 |
| 3.3 DADS与 DJ-1 高表达对各组细胞凋亡相关分子表达的影响 |
| 3.3.1 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Bcl‐2 表达的影响 |
| 3.3.2 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 XIAP 表达的影响 |
| 3.3.3 DADS 与 DJ‐1 高表达对各组细胞 Caspase‐3 表达的影响 |
| 3.4 DADS与 DJ-1 高表达对人胃癌细胞抗药性的影响 |
| 3.5 免疫荧光检测P-gp、Bcl-2、XIAP及 Caspase-3 定位与表达 |
| 第4章 讨论 |
| 第5章 小结 |
| 参考文献 |
| 全部结论 |
| 综述 Role of DJ-1 in cancer: Recent advance |
| References |
| 攻读博士期间的主要科研成果 |
| 致谢 |
（2）SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 1 研究对象 |
| 2 主要试剂和仪器 |
| 3 PBS缓冲液配置 |
| 4 HE染色 |
| 5 免疫组化方法 |
| 6 结果判定 |
| 7 统计学分析 |
| 结果 |
| 1.SP1、KLF4、P21 蛋白在卵巢上皮性癌组织、卵巢交界性肿瘤、卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中的表达情况 |
| 2.卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4、P21 蛋白表达间的相关性 |
| 3.卵巢上皮性癌组织中SP1、KLF4、P21 蛋白表达与临床病理因素的关系分析 |
| 4.SP1、KLF4、P21 表达对卵巢上皮性癌患者预后的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 综述参考文献 |
| 攻读学位期间的研究成果 |
| 缩略词表 |
| 致谢 |
（3）基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 1 文献研究 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 1.3 晚期胃癌的中西医治疗概述 |
| 1.4 附子理中汤对晚期胃癌的作用 |
| 2 数据分析与成果讨论 |
| 2.1 资料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 结论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 晚期胃癌的中西医治疗进展 |
| 1 中西医对晚期胃癌的认识 |
| 1.1 中医病因病机 |
| 1.2 西医发病机制 |
| 2 中西医治疗晚期胃癌 |
| 2.1 中医治疗 |
| 2.2 西医治疗 |
| 2.3 中西医联合治疗 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（4）“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略语 |
| 第一部分:基于GEO及 TCGA生物信息学分析探究胃癌差异基因 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 生信分析数据库及工具选取 |
| 2.2 分析流程及步骤 |
| 2.2.1 GEO芯片下载 |
| 2.2.2 筛选表达差异基因 |
| 2.2.3 GO/KEGG功能富集及注释 |
| 2.2.4 蛋白互作分析 |
| 2.2.5 GEPIA数据库验证差异基因表达 |
| 2.2.6 Kaplan-Meier plotter探究基因预后价值 |
| 3 结果 |
| 3.1 GSE79973差异基因表达 |
| 3.2 蛋白互作PPI筛选5个粘附相关基因 |
| 3.3 GEPIA数据库验证差异基因表达情况 |
| 3.4 五种差异表达基因的预后价值 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分:LAMC1在胃癌发生发展中的重要作用 |
| 1 前言 |
| 2 材料和方法 |
| 2.1 免疫组化 |
| 2.1.1 原理 |
| 2.1.2 实验试剂及仪器 |
| 2.1.3 实验步骤 |
| 2.1.4 免疫组化评分原则 |
| 2.1.5 临床数据统计及分析 |
| 2.2 细胞培养、冻存与复苏 |
| 2.2.1 实验试剂及耗材 |
| 2.2.2 细胞传代培养 |
| 2.2.3 细胞冻存 |
| 2.2.4 细胞复苏 |
| 2.3 细胞转染技术 |
| 2.3.1 siRNA或 miRNA mimic/inhibitor瞬时转染: |
| 2.3.2 病毒稳定转染 |
| 2.4 Western Blotting |
| 2.4.1 实验试剂及仪器 |
| 2.4.2 配制电泳液、转膜液及SDS-PAGE凝胶 |
| 2.4.3 蛋白样品收集 |
| 2.4.4 Western blotting主要流程 |
| 2.5 CCK-8实验 |
| 2.5.1 原理 |
| 2.5.2 实验步骤 |
| 2.6 细胞周期实验 |
| 2.6.1 原理 |
| 2.6.2 实验试剂及器材 |
| 2.6.3 实验步骤 |
| 2.7 EdU增殖实验 |
| 2.7.1 原理 |
| 2.7.2 实验试剂及器材 |
| 2.7.3 实验步骤 |
| 2.8 Transwell实验 |
| 2.8.1 原理 |
| 2.8.2 实验试剂及耗材 |
| 2.8.3 实验步骤 |
| 2.9 小鼠皮下成瘤实验 |
| 2.10 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 免疫组化提示LAMC1在胃癌组织中呈高表达 |
| 3.2 敲低LAMC1,细胞增殖、侵袭转移能力明显下降 |
| 3.3 LAMC1 可影响ERK1、EMT等相关通路蛋白表达 |
| 3.4 体内实验证实,LAMC1低表达细胞系的成瘤能力明显下降 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 KLF4 通过miR-195-5p靶向调控LAMC1 表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 生物信息学预测分析 |
| 2.1.1 miRNA基因预测 |
| 2.1.2 转录因子与启动子靶点预测 |
| 2.2 质粒转染 |
| 2.2.1 实验试剂 |
| 2.2.2 实验步骤 |
| 2.3 real-time PCR |
| 2.3.1 实验试剂与仪器 |
| 2.3.2 引物序列 |
| 2.3.3 实验步骤 |
| 2.4 双荧光素酶实验 |
| 2.4.1 原理 |
| 2.4.2 实验试剂与仪器 |
| 2.4.3 实验步骤 |
| 2.5 染色质免疫沉淀实验 |
| 2.5.1 原理 |
| 2.5.2 实验试剂 |
| 2.5.3 实验步骤 |
| 2.6 琼脂糖凝胶电泳 |
| 2.6.1 实验试剂 |
| 2.6.2 实验步骤 |
| 3 结果 |
| 3.1 LAMC1是miR-195-5p下游潜在靶基因 |
| 3.2 miR-195-5p可靶向抑制LAMC1 蛋白表达 |
| 3.3 KLF4 可促进miR-195-5p并抑制LAMC1 表达 |
| 3.4 KLF4 可靶向结合miR-195-5p启动子区域 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（5）长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 第一章 前言 |
| 1.1 胃癌流行病学 |
| 1.2 胃癌治疗现状 |
| 1.3 LncRNA的分类与功能 |
| 1.4 LncRNA在胃癌发病中的作用 |
| 1.5 本课题的研究目的和意义 |
| 第二章 生物信息学鉴定CASC19与胃癌进展和预后相关 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.1.1 数据的来源与获取 |
| 2.1.2 差异lncRNA筛选过程 |
| 2.1.3 加权基因共表达网络构建过程 |
| 2.1.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.1.5 核心lncRNA与 GC临床性状之间的联系 |
| 2.1.6 核心lncRNA的预后分析 |
| 2.1.7 核心lncRNA的 GSEA分析 |
| 2.1.8 统计学分析 |
| 2.2 结果 |
| 2.2.1 患者的基线资料 |
| 2.2.2 差异lncRNA筛选结果 |
| 2.2.3 加权基因共表达网络构建结果 |
| 2.2.4 临床重要模块与核心lncRNA的鉴别 |
| 2.2.5 CASC19与GC临床性状之间的联系 |
| 2.2.6 CASC19 过表达GC患者预后差 |
| 2.2.7 CASC19相关的信号通路 |
| 2.3 讨论 |
| 第三章 CASC19在人胃癌组织中的表达及临床意义 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.1.1 临床样本收集 |
| 3.1.2 纳入与排除标准 |
| 3.1.2.1 纳入标准 |
| 3.1.2.2 排除标准 |
| 3.1.3 临床病理参数 |
| 3.1.4 组织总RNA提取及质检 |
| 3.1.4.1 组织总RNA提取 |
| 3.1.4.2 组织总RNA质检 |
| 3.1.5 qRT-PCR实验 |
| 3.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 3.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 3.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 3.1.6 HE染色 |
| 3.1.6.1 石蜡包埋 |
| 3.1.6.2 切片 |
| 3.1.6.3 HE染色步骤 |
| 3.1.7 IHC实验 |
| 3.1.7.1 石蜡包埋 |
| 3.1.7.2 切片 |
| 3.1.7.3 IHC步骤 |
| 3.1.8 统计学分析 |
| 3.2 结果 |
| 3.2.1 患者临床病理资料 |
| 3.2.2 CASC19在GC组织和癌旁组织中的表达 |
| 3.2.3 CASC19 表达与GC患者临床病理参数之间的关系 |
| 3.2.4 CASC19 表达与NPM1 表达之间的关系 |
| 3.2.5 CASC19在GC诊断中的意义 |
| 3.3 讨论 |
| 第四章 CASC19对胃癌细胞生物学行为的影响 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.1.1 细胞培养 |
| 4.1.1.1 细胞复苏 |
| 4.1.1.2 细胞传代 |
| 4.1.1.3 细胞冻存 |
| 4.1.2 慢病毒制备 |
| 4.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 4.1.2.2 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 4.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 4.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 4.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 4.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 4.1.5 qRT-PCR实验 |
| 4.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 4.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 4.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 4.1.6 cDNA末端快速扩增实验 |
| 4.1.6.1 CASC19 PCR扩增及回收 |
| 4.1.6.2 3 ’RACE获取CASC19的3’全长 |
| 4.1.6.3 5 ’RACE获取CASC19的5’全长 |
| 4.1.7 CCK-8细胞增殖实验 |
| 4.1.8 细胞克隆形成实验 |
| 4.1.9 EdU细胞增殖实验 |
| 4.1.10 细胞划痕实验 |
| 4.1.11 Transwell迁移实验 |
| 4.1.12 Transwell侵袭实验 |
| 4.1.13 流式凋亡实验 |
| 4.1.14 蛋白质免疫印迹实验 |
| 4.1.14.1 细胞总蛋白提取 |
| 4.1.14.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 4.1.14.3 电泳 |
| 4.1.14.4 电转 |
| 4.1.14.5 显色 |
| 4.1.15 统计学分析 |
| 4.2 结果 |
| 4.2.1 CASC19在GC细胞系中的表达水平 |
| 4.2.2 RACE获得CASC19在GC细胞中的全长 |
| 4.2.3 CASC19的非编码分析 |
| 4.2.4 CASC19慢病毒敲减和过表达效率检测 |
| 4.2.5 CCK-8 实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.6 克隆形成实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.7 EdU实验检测CASC19对GC细胞增殖的影响 |
| 4.2.8 划痕实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.9 Transwell迁移实验检测CASC19对GC细胞迁移的影响 |
| 4.2.10 Transwell侵袭实验检测CASC19对GC细胞侵袭的影响 |
| 4.2.11 流式细胞实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.12 WB实验检测CASC19对GC细胞凋亡的影响 |
| 4.2.13 WB实验检测CASC19对GC细胞EMT的影响 |
| 4.3 讨论 |
| 第五章 CASC19表达对胃癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.1.1 细胞培养 |
| 5.1.2 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 5.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 5.1.4 实验动物 |
| 5.1.5 实验分组 |
| 5.1.6 裸鼠皮下成瘤实验 |
| 5.1.7 裸鼠活体成像实验 |
| 5.1.8 组织总RNA提取及质检 |
| 5.1.8.1 组织总RNA提取 |
| 5.1.8.2 组织总RNA质检 |
| 5.1.9 qRT-PCR实验 |
| 5.1.9.1 反转录合成cDNA |
| 5.1.9.2 qRT-PCR检测 |
| 5.1.9.3 qRT-PCR引物 |
| 5.1.10 移植瘤HE染色 |
| 5.1.11 移植瘤IHC实验 |
| 5.1.12 移植瘤WB实验 |
| 5.1.12.1 组织总蛋白提取 |
| 5.1.12.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 5.1.12.3 电泳 |
| 5.1.12.4 电转 |
| 5.1.12.5 显色 |
| 5.1.13 统计学方法 |
| 5.2 结果 |
| 5.2.1 CASC19 在稳转MKN-45 细胞株中的表达水平 |
| 5.2.2 CASC19下调可抑制裸鼠皮下移植瘤的生长 |
| 5.2.3 CASC19 下调对移植瘤HE染色的镜下改变 |
| 5.2.4 CASC19 下调对移植瘤中Ki-67 蛋白表达的影响 |
| 5.2.5 CASC19 下调对移植瘤中PCNA蛋白表达的影响 |
| 5.2.6 CASC19 下调对移植瘤中HDAC1 表达的影响 |
| 5.2.7 CASC19 下调对移植瘤中NPM1 表达的影响 |
| 5.3 讨论 |
| 第六章 基于芯片技术鉴定CASC19调控的下游靶基因及信号通路 |
| 6.1 材料与方法 |
| 6.1.1 实验设计及样本的制备 |
| 6.1.1.1 细胞培养与感染 |
| 6.1.1.2 细胞总RNA提取 |
| 6.1.1.3 细胞总RNA质检 |
| 6.1.2 芯片的制备 |
| 6.1.3 芯片实验 |
| 6.1.3.1 反转录合成cDNA |
| 6.1.3.2 体外转录合成标记cRNA |
| 6.1.4 芯片的杂交 |
| 6.1.5 芯片的洗染和扫描 |
| 6.1.6 差异分析 |
| 6.1.7 IPA分析 |
| 6.1.8 qRT-PCR验证芯片结果 |
| 6.1.9 统计学分析 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 芯片数据的质量评估 |
| 6.2.2 差异分析结果 |
| 6.2.3 IPA分析结果 |
| 6.2.3.1 IPA的经典通路分析结果 |
| 6.2.3.2 IPA的上游调控分析结果 |
| 6.2.3.3 IPA的疾病和功能分析结果 |
| 6.2.3.4 IPA的调控效应分析结果 |
| 6.2.3.5 IPA的相互作用网络分析结果 |
| 6.2.4 qRT-PCR验证结果 |
| 6.3 讨论 |
| 第七章 CASC19 通过募集HDAC1 来抑制NPM1 表达的机制研究 |
| 7.1 材料与方法 |
| 7.1.1 细胞培养 |
| 7.1.1.1 细胞复苏 |
| 7.1.1.2 细胞传代 |
| 7.1.1.3 细胞冻存 |
| 7.1.2 慢病毒制备 |
| 7.1.2.1 CASC19 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.2 HDAC1 shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.3 MYC shRNA慢病毒制备 |
| 7.1.2.4 CASC19过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.5 HDAC1过表达慢病毒制备 |
| 7.1.2.6 MYC过表达慢病毒制备 |
| 7.1.3 慢病毒感染细胞 |
| 7.1.4 细胞总RNA提取及质检 |
| 7.1.4.1 细胞总RNA提取 |
| 7.1.4.2 细胞总RNA质检 |
| 7.1.5 qRT-PCR 实验 |
| 7.1.5.1 反转录合成cDNA |
| 7.1.5.2 qRT-PCR检测 |
| 7.1.5.3 qRT-PCR引物 |
| 7.1.6 核质分离实验 |
| 7.1.6.1 分离细胞核和细胞质 |
| 7.1.6.2 RNA抽提及反转录 |
| 7.1.6.3 qRT-PCR检测 |
| 7.1.7 WB 实验 |
| 7.1.7.1 细胞总蛋白提取 |
| 7.1.7.2 BCA法测定蛋白浓度 |
| 7.1.7.3 电泳 |
| 7.1.7.4 电转 |
| 7.1.7.5 显色 |
| 7.1.8 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.8.2 制备生物素标记的RNA |
| 7.1.8.3 标记RNA探针 |
| 7.1.8.4 进行 RNA pull-down 实验 |
| 7.1.8.5 蛋白质谱鉴定 |
| 7.1.9 RNA 纯化染色质分离实验 |
| 7.1.9.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.9.2 超声处理 |
| 7.1.9.3 进行 Ch IRP 实验 |
| 7.1.9.4 DNA分离鉴定 |
| 7.1.9.5 蛋白质分离鉴定 |
| 7.1.10 RNA 结合蛋白免疫沉淀实验 |
| 7.1.10.1 准备细胞裂解物 |
| 7.1.10.2 准备磁珠 |
| 7.1.10.3 RNA结合蛋白免疫沉淀 |
| 7.1.10.4 RNA纯化 |
| 7.1.10.5 qRT-PCR检测 |
| 7.1.11 染色质免疫共沉淀实验 |
| 7.1.11.1 细胞交联 |
| 7.1.11.2 染色质片段化 |
| 7.1.11.3 DNA纯化 |
| 7.1.11.4 免疫沉淀 |
| 7.1.11.5 解交联 |
| 7.1.11.6 qPCR或者测序 |
| 7.1.12 双荧光素酶报告基因实验 |
| 7.1.13 统计学分析 |
| 7.2 结果 |
| 7.2.1 CASC19的亚细胞定位 |
| 7.2.2 RNA pull-down实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质 |
| 7.2.3 ChIRP实验检测与CASC19 相互作用的蛋白质和基因 |
| 7.2.4 CatRAPID验证CASC19与HDAC1 蛋白相互作用 |
| 7.2.5 WB检测RNA pull-down富集蛋白中HDAC1 的表达 |
| 7.2.6 RIP实验证明CASC19 可以结合HDAC1 蛋白 |
| 7.2.7 HDAC1 的表达不受CASC19 的调控 |
| 7.2.8 ChIP-seq实验检测与HDAC1 相互作用的基因 |
| 7.2.9 CASC19 下调抑制HDAC1与NPM1 启动子的结合 |
| 7.2.10 NPM1 的表达受HDAC1 的调控 |
| 7.2.11 CASC19 通过募集HDAC1 抑制NPM1 的表达 |
| 7.2.12 CASC19上游的调控转录因子预测 |
| 7.2.13 CASC19 的表达受MYC的调控 |
| 7.3 讨论 |
| 第八章 全文结论 |
| 8.1 主要结论 |
| 8.2 研究展望 |
| 参考文献 |
| 综述 染色体8q24.21 区域的lncRNA在癌症中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
（6）膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（7）ESCO2基因在胃癌细胞增殖和周期中的作用及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 缩略词 |
| 第一章 ESCO2基因与胃癌的研究进展 |
| 1 胃癌分型 |
| 1.1 胃癌组织分型 |
| 1.2 胃癌分子分型 |
| 2 调控胃癌的基因及相关信号通路 |
| 2.1 生长因子及其受体介导的信号通路 |
| 2.2 mTOR信号通路 |
| 2.3 p53信号通路 |
| 3 ESCO2基因 |
| 3.1 ESCO2的特征和作用 |
| 3.2 ESCO2的主要功能 |
| 4 Cohesin与胃癌 |
| 4.1 Cohesin组分的基因过表达与胃癌 |
| 4.2 Cohesin组分的基因突变与胃癌 |
| 4.3 癌症中cohesin突变的潜在影响 |
| 5 科学问题 |
| 第二章 胃癌组织ESCO2表达及其与胃癌的相关性 |
| 材料与方法 |
| 1 主要材料 |
| 1.1 TCGA数据库 |
| 1.2 Oncomine数据库 |
| 1.3 胃腺癌组织芯片 |
| 2 主要试剂和仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要仪器 |
| 3 主要方法 |
| 3.1 TCGA数据库下载与数据分析 |
| 3.2 Oncomine数据库数据分析 |
| 3.3 胃腺癌组织芯片免疫组织化学检测分析 |
| 结果 |
| 1 ESCO2基因在胃癌组织和正常胃黏膜的差异表达 |
| 1.1 ESCO2基因在TCGA数据库中胃癌组织与正常胃黏膜的差异表达 |
| 1.2 ESCO2基因在Oncomine数据库中胃癌组织和正常胃黏膜的差异表达 |
| 1.3 ESCO2基因在胃腺癌组织芯片中的差异表达 |
| 2 ESCO2基因表达与胃癌的相关性 |
| 2.1 TCGA数据库中ESCO2mRNA表达与胃癌的相关性 |
| 2.2 胃癌组织芯片中ESCO2蛋白表达与胃癌的相关性 |
| 3 ESCO2基因表达与胃癌患者生存期的相关性 |
| 3.1 选取样本 |
| 3.2 单因素生存期分析 |
| 讨论 |
| 1 ESCO2基因在癌组织与癌旁组织/正常胃黏膜差异表达的结果分析 |
| 2 ESCO2表达与组织分型、肿瘤分期和生存期的相关性分析 |
| 小结 |
| 第三章 ESCO2在胃癌细胞增殖中的作用及其分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 主要材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 慢病毒与腺病毒 |
| 1.3 动物 |
| 2 主要试剂和仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要器材 |
| 3 主要方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 慢/腺病毒感染目的细胞 |
| 3.3 CCK-8细胞活力检测 |
| 3.4 EdU细胞增殖检测 |
| 3.5 细胞克隆形成检测 |
| 3.6 细胞划痕实验 |
| 3.7 细胞Transwell迁移实验 |
| 3.8 蛋白抗体芯片检测增殖相关信号通路蛋白表达 |
| 3.9 qRT-PCR检测增殖相关基因mRNA表达 |
| 3.10 WesternBlotting检测增殖相关蛋白表达 |
| 3.11 裸鼠成瘤实验 |
| 3.12 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 ESCO2基因在不同胃癌细胞株的表达 |
| 2 目的细胞感染 |
| 2.1 shRNA慢病毒感染细胞 |
| 2.2 sgRNA慢病毒感染细胞 |
| 2.3 过表达腺病毒感染细胞 |
| 3 ESCO2基因对胃癌细胞增殖活力的影响 |
| 3.1 干扰/敲除ESCO2基因对胃癌细胞增殖活力的影响 |
| 3.2 过表达ESCO2基因对胃癌细胞增殖活力的影响 |
| 4 干扰ESCO2基因对胃癌细胞S期细活胞数量的影响 |
| 5 干扰ESCO2基因对胃癌细胞克隆形成的影响 |
| 6 干扰ESCO2基因对胃癌细胞划痕愈合能力的影响 |
| 7 干扰ESCO2基因对胃癌细胞迁移的影响 |
| 8 干扰ESCO2基因对裸鼠成瘤的影响 |
| 9 干扰ESCO2基因对AGS细胞增殖相关蛋白PCNA的影响 |
| 10 干扰ESCO2基因对AGS细胞mTOR通路的影响 |
| 10.1 干扰ESCO2基因对AGS细胞mTOR通路分子转录水平的影响. |
| 10.2 干扰ESCO2基因对AGS细胞mTOR通路分子蛋白表达和磷酸化水平的影响 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第四章 ESCO2对胃癌细胞周期的影响及其分子机制研究 |
| 材料与方法 |
| 1 主要材料 |
| 1.1 细胞株 |
| 1.2 慢病毒与腺病毒 |
| 2 主要试剂和仪器 |
| 2.1 主要试剂 |
| 2.2 主要器材 |
| 3 主要方法 |
| 3.1 细胞培养 |
| 3.2 慢/腺病毒感染目的细胞 |
| 3.3 细胞凋亡检测(AnnexinV-APC单染法-FACS) |
| 3.4 细胞周期检测(PI-FACS) |
| 3.5 等重同位素多标签相对定量蛋白质组学检测与分析 |
| 3.6 qRT-PCR检测周期相关基因mRNA表达 |
| 3.7 蛋白抗体芯片检测p53蛋白表达 |
| 3.8 WesternBlotting检测细胞周期相关蛋白表达 |
| 3.9 免疫共沉淀技术检测蛋白质相互作用 |
| 3.10 统计学分析 |
| 结果 |
| 1 干扰/敲除ESCO2基因对胃癌细胞凋亡的影响 |
| 2 ESCO2基因对胃癌细胞周期的影响 |
| 2.1 干扰ESCO2基因对胃癌细胞周期的影响 |
| 2.2 过表达ESCO2基因对胃癌细胞周期的影响 |
| 3 干扰ESCO2基因对胃癌细胞周期相关分子表达的影响 |
| 3.1 ESCO2基因干扰的BGC-823细胞蛋白组差异表达分析 |
| 3.2 干扰ESCO2基因对胃癌细胞p53表达的影响 |
| 3.3 干扰ESCO2基因对胃癌细胞周期相关蛋白表达的影响 |
| 4 胃癌细胞中ESCO2蛋白与p53蛋白的相互作用 |
| 4.1 ESCO2蛋白和p53蛋白在AGS和BGC-823细胞中的相互作用 |
| 4.2 ESCO2蛋白和p53蛋白在AGS和BGC-823细胞中互作的定位 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 第五章 结论与展望 |
| 1 结论 |
| 2 不足与展望 |
| 参考文献 |
| 在学期间的研究成果 |
| 致谢 |
| 附录 |
（8）Krüppel-like转录因子ZNF148在发育与疾病中的功能研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 胚胎干细胞 |
| 1.2 Krǜppel样锌指转录家族 |
| 1.3 ZFP281 研究进展 |
| 1.4 ZNF148 结构 |
| 1.5 ZNF148 与细胞生长 |
| 1.6 ZNF148 与细胞凋亡 |
| 1.7 胃癌简介 |
| 1.8 ZNF148 与癌症 |
| 第二章 实验材料及方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 细胞培养 |
| 2.3 构建表达ZNF148 shRNA的 pLKO.1 重组质粒 |
| 2.4 慢病毒包装 |
| 2.5 荧光定量PCR检测ZNF148 敲减效率平 |
| 2.6 免疫印迹试验(Western Blot) |
| 2.7 免疫沉淀(IP) |
| 2.8 构建ZNF148 截短蛋白 |
| 2.9 在靶细胞中敲除ZNF148 |
| 2.10 包装慢病毒并感染目的细胞SNU216,V6.5 并进行鉴定 |
| 2.11 染色质免疫共沉淀(ChIP) |
| 第三章 实验结果 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 ZNF148与NuRD复合物相互作用 |
| 3.3 Znf148 敲除胚胎干细胞系构建与鉴定 |
| 3.4 Znf148 不参与胚胎干细胞的自我更新 |
| 3.5 Znf148 能够激活Zscan4 家族的表达 |
| 小结 |
| 第四章 ZNF148 与胃癌 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 ZNF148 的表达水平与胃癌的预后生存率呈负性相关 |
| 4.3 筛选特异性靶向ZNF148的shRNA |
| 4.4 ZNF148 敲除胃癌细胞系的构建与鉴定 |
| 小结 |
| 第五章 讨论 |
| 第六章 参考文献 |
| 致谢 |
| 作者简介 |
（9）胃癌组织中p53、p21WAF1蛋白的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系研究（论文提纲范文）
| 前言 |
| 1 资料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 方法 |
| 1.3 结果判断 |
| 1.4 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 p53和p21WAF1蛋白在胃癌组织的表达 |
| 2.2 胃癌组织中Hp-L型阳性感染率 |
| 2.3 Hp-L型感染率和p53和p21WAF1蛋白阳性表达率关系 |
| 2.4 p53、P21WAF1蛋白表达与临床参数关系 |
| 3 讨论 |
（10）MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 绪论 |
| 第一章 IKZF1 在肝细胞癌中转录调控MDIG的表达 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 结果 |
| 1.3 讨论 |
| 1.4 小结 |
| 第二章 MDIG基因在肝细胞癌中的功能 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 结果 |
| 2.3 讨论 |
| 2.4 小结 |
| 第三章 MDIG在肝细胞癌中表观遗传调控p21(CIP1/WAF1)的表达 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果 |
| 3.3 讨论 |
| 3.4 小结 |
| 第四章 MDIG在肝细胞癌中差异表达及其临床意义 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果 |
| 4.3 讨论 |
| 4.4 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文 |
四、细胞周期素E、P21~(WAF1)在胃癌中的表达及意义（论文参考文献）
- [1]DADS下调DJ-1对人胃癌SGC7901细胞EMT、侵袭和抗药性的影响及其作用机制[D]. 夏红. 南华大学, 2020
- [2]SP1、KLF4和P21在卵巢上皮性癌的表达及意义[D]. 薛云. 青岛大学, 2020(01)
- [3]基于网络药理学方法研究附子理中汤治疗晚期胃癌的作用机制[D]. 熊佳惠. 广西中医药大学, 2020(02)
- [4]“KLF4-miR-195-5p-LAMC1”调控轴在胃癌增殖、侵袭转移中的作用机制[D]. 高梓茗. 中国医科大学, 2020(01)
- [5]长链非编码RNA CASC19在胃癌中的作用和机制研究[D]. 汪文杰. 兰州大学, 2020(01)
- [6]膜联蛋白A7通过p21-cyclin/CDK-PCNA-E2F信号轴调控胃癌细胞增殖的研究[D]. 赵依纳. 承德医学院, 2019(06)
- [7]ESCO2基因在胃癌细胞增殖和周期中的作用及机制研究[D]. 陈红梅. 兰州大学, 2018(06)
- [8]Krüppel-like转录因子ZNF148在发育与疾病中的功能研究[D]. 许曼曼. 东南大学, 2018
- [9]胃癌组织中p53、p21WAF1蛋白的表达及与幽门螺杆菌L型感染的关系研究[J]. 张波,曾帮智,张博,张茜,吕晓玥. 现代生物医学进展, 2017(28)
- [10]MDIG基因在肝细胞癌中的功能及机制研究[D]. 霍奇. 上海交通大学, 2017(05)