一、树突状细胞在食管癌T细胞抗肿瘤免疫中的作用（论文文献综述）
尹良伟[1]（2021）在《黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究》文中进行了进一步梳理自20世纪70年代末,全球乳腺癌（Breast Cancer）发病率一直呈上升趋势,在我国乳腺癌已经成为女性发病首位的恶性肿瘤,而且呈现年轻化趋势;年轻女性乳腺癌的发病,往往侵袭性更高,病理分级及预后更差。手术、化疗、放疗和内分泌治疗是乳腺癌传统的四大治疗手段,生物治疗为进入本世纪以来乳腺癌的第五大治疗手段,免疫治疗从属于生物治疗的范畴。然而,乳腺癌免疫治疗的发展一直较为缓慢。因此,如何合理选择人群和合理的治疗模式,让更多的乳腺癌患者从免疫治疗中获益,是未来该领域的重点发展方向。树突状细胞（Dendritic Cells,DC）作为抗原提呈功能细胞的主要效应细胞之一,将固有免疫和适应性免疫紧密连接在一起,尤其是在特异性免疫反应中发挥独特的免疫学效应。根据不同阶段DC生物学特性的不同,有些学者设想利用改善DC功能的手段来增强其抗肿瘤效应。黏蛋白1（Mucins1,MUC1）是I型跨膜糖蛋白,正常情况下可表达于多种组织、器官的上皮细胞近管腔或腺腔面,亦可见于腺癌上皮细胞的表面,而且呈高表达态势。相关研究显示,MUC1表达程度越高,往往预示着肿瘤侵袭性越强,预后越差,而且更容易出现局部浸润、淋巴结转移和血行转移。结合近年来MUC1在肿瘤生物治疗中的新发现以及基因修饰技术的成熟和推广,我们以MUC1作为出发点,以基因修饰DC作为主要技术路线,分以下3部分系统探讨MUC1基因转染后的DC对乳腺癌的免疫作用,旨在探索乳腺癌新的肿瘤免疫治疗途径与方法。一、黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备目的:验证MUC1在人乳腺癌中高表达,并构建和包装MUC1重组慢病毒,感染DC,制备过表达MUC1的DC疫苗。材料和方法:（1）应用免疫组织化学技术检测90例乳腺癌组织和30例癌旁正常组织以及三种细胞（神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y与两种乳腺癌细胞系MCF7、MDA-MB-231）中MUC1蛋白的表达,q PCR检测26例新鲜乳腺癌组织和癌旁正常组织以及三种细胞MUC1 m RNA水平,验证MUC1在乳腺癌组织及细胞系中的表达;（2）应用GV657载体,经目的基因扩增、PCR产物与载体交换、测序、质粒提取及纯化、病毒包装,获取重组MUC1慢病毒;（3）通过密度梯度离心法,体外分离获得人外周血单个核细胞;采用无血清培养基,经人重组粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rh GM-CSF）、重组人白介素-4（rh IL-4）和肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor,TNF）-α诱导产生成熟DC;流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平;（4）MUC1慢病毒感染DC,分为MUC1基因感染DC组（MUC1-DC组）、空载体感染DC组（GFP-DC组）以及对照组（DC组）;（5）RT-PCR检测感染后DC的MUC1 m RNA水平;（6）Western blotting检测感染后DC的MUC1蛋白表达。结果:（1）90例乳腺癌组织中,MUC1表达明显高于癌旁正常组织,92.2%（83/90）乳腺癌组织中显示MUC1高表达,30例癌旁组织中5例为高表达（16.7%）,其余25例者（83.3%）为阴性或细胞质内弱表达。在26例乳腺癌组织中有92.3%（24/26）的MUC1 m RNA水平明显高于配对的癌旁对照组织（P<0.01）,仅2例乳腺癌中MUC1 m RNA表达水平与癌旁组织相当;与神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y比较,两种乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231的MUC1 m RNA水平和蛋白表达均显着增高（均为P<0.01）;（2）MUC1重组质粒测序结果与目的基因一致,经包装获得病毒滴度为1×109TU/m L的重组MUC1慢病毒;（3）相差显微镜观察体外培养的外周血来源DC形态变化过程,培养至5～7d大部分细胞脱壁悬浮,体积明显增大且大小不等,形态不规则,表面可见很多粗细不一、参差不齐、形态各异的毛刺状突起,呈现典型的树突状细胞形态;培养7d的DC流式检测结果显示,CD1a、CD80、CD83及CD86分子表达率分别为（21.6±2.4）%、（22.7±1.6）%、（24.9±2.1）%及（95.4±4.3）%,表明获得成熟DC;（4）采用MUC1重组慢病毒感染DC后,于24 h时可见特异性GFP表达,24h、48 h、72 h的转染效率分别为（11.7±1.0）%、（12.9±0.9）%和（36.8±1.6）%;（5）与空载体组和对照组相比,MUC1-DC组RT-PCR检测到346 bp扩增带;（6）同时Western blotting检测MUC1-DC组可见明显的MUC1蛋白条带。结论:（1）验证了MUC1在人乳腺癌组织以及两种人乳腺癌细胞MCF7和MDA-MB-231中呈高表达;（2）成功构建MUC1重组质粒,并包装获得携带MUC1基因重组慢病毒;（3）以MUC1重组慢病毒感染DC,成功获得过表达MUC1的DC,即MUC1-DC疫苗。二、MUC1-DC免疫功能的体外研究目的:探究前一部分实验获得的MUC1-DC疫苗在体外诱导CTL的免疫作用及对人乳腺癌细胞MCF7的杀伤活性。材料和方法:（1）诱导培养特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）,免疫荧光技术检测不同转染时间后MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-α情况;（2）ELISA法检测比较MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL和DC-CTL IL-12、TNF-α含量;（3）以人乳腺癌细胞MCF7为靶细胞,以MUC1-DC-CTL、GFP-DC-CTL、DC-CTL为效应细胞,采用LDH释放法检测CTL的杀伤活性,CTL特异性杀伤率（%）=（试验孔值-效应细胞对照值）/（最大杀伤对照值-最小杀伤对照值）×100%。结果:（1）经免疫荧光检测,转染的MCU1-DC培养2d后诱导CTL开始表达IL-12和TNF-α,但荧光强度较弱;与MCU1-DC培养3d相比,培养4d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的量均明显升高,荧光强度增强,差异均具有统计学意义（P<0.05,P<0.05）;MCU1-DC培养5d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α荧光强度最强;MCU1-DC培养6d诱导CTL细胞表达IL-12和TNF-α的荧光强度逐渐下降;（2）ELISA结果显示:GFP-DC诱导CTL分泌细胞因子IL-12、TNF-α能力较低,分别为（101.83±5.79）ng/m L、（119.26±11.52）ng/m L,与DC组比较差异无统计学意义（P>0.05）;而MUC1-DC诱导CTL分泌这两种因子的能力明显增强,分别为（202.52±17.10）ng/m L和（349.07±79.42）ng/m L,与DC组和GFP-DC组比较,差异均有明显统计学意义（均为P<0.01）;（3）LDH释放法检测结果显示,三组杀伤活性均随效靶比的升高而增强;相同效靶比时,与DC-CTL组或GFP-DC-CTL组比较,MUC1-DC-CTL组对靶细胞MCF7具有更明显的杀伤活性,差异具有明显统计学意义（均为P<0.01）。结论:（1）MUC1基因转染的DC诱导CTL即MUC1-DC-CTL在5 d时分泌IL-12和TNF-α的能力最强,用于本研究后续实验;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC诱导CTL具有更强的产生IL-12、TNF-ɑ细胞因子的免疫活性;（3）MUC1-DC-CTL对人乳腺癌MCF-7细胞比单纯DC-CTL具有更明显的杀伤活性,而且随着效靶比的升高,CTL的杀伤活性逐渐增强。三、光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用目的:通过活体监测MCF7荷瘤裸鼠的成瘤生长情况,评价MUC1基因转染的DC疫苗对乳腺癌免疫作用的效果及其可能的机制。材料和方法:（1）GFP慢病毒转染MCF7细胞（GFP-MCF7）;（2）BALB/c裸鼠皮下种植GFP-MCF7 1×107个/只,成瘤后随机分为3组,各组裸鼠首先尾静脉注射体外活化的CIK细胞1×108个/只,治疗组于皮下注射MUC1-DC（MUC1-DC组）或DC细胞（DC组）1×107个/只,体积0.2 ml/只,对照组（Ct组）注射等体积生理盐水,每天治疗1次,连续5d;（3）采用小动物活体光学成像系统在开始治疗前及开始治疗后第35d进行成像观察移植瘤荧光成像,分析荧光强度和荧光面积;（4）免疫组化法检测三组裸鼠移植瘤组织中Caspase3的表达情况;（5）TUNELl法检测三组裸鼠移植瘤组织中的细胞凋亡率。结果:（1）裸鼠于GFP-MCF7荷瘤后7d,成瘤率100%。开始治疗前和开始治疗后35d活体光学分子成像结果显示,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号强度无明显差异（F=0.4341,P>0.05）;开始治疗后第35d,MUC1-DC组的荧光信号强度明显低于Ct组（F=7.864,P<0.05）;DC与Ct、MUC1-DC与DC组间均无显着性差异（均为P>0.05）,但MUC1-DC比DC组荧光信号更低。从荧光信号面积上进行统计分析,治疗前MUC1-DC组、DC组和Ct组间体内移植瘤荧光信号分布面积无显着差异（F=1.084,P>0.05）;开始治疗后第35d,Ct组荧光信号呈多处散在分布,MUC1-DC组和DC组的荧光信号面积均明显低于Ct组（均为P<0.01）,但MUC1-DC组与DC组的荧光信号面积无显着性差异（P>0.05）;（2）Ct组Caspase3表达最少,DC组次之,MUC1-DC组呈高表达Caspase3,三组间比较,差异均有统计学意义（均为P<0.05）;（3）TUNEL结果显示,三组细胞凋亡率分别为:Ct组（4.11±2.61%）、DC组（9.63±2.27）%、MUC1-DC组（25.30±8.24）%,三组间比较,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:（1）GFP荧光标记的人乳腺癌细胞在裸鼠内可以持续表达荧光信号,可以通过光学分子成像系统检测光密度值观察肿瘤的部位及生长情况,是一种活体内实时动态观察肿瘤的生长和转移、评价抑瘤作用的有效方法;（2）MUC1-DC疫苗比单纯DC免疫治疗人乳腺癌荷瘤小鼠能够更有效地抑制肿瘤生长和扩散;（3）MUC1-DC发挥了更好的促进肿瘤细胞凋亡的作用。
王慧[2]（2020）在《食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究》文中指出背景和目的:目前肿瘤微环境中的免疫细胞种类及功能受到越来越多的关注,基于T细胞研究发现的肿瘤免疫检测靶点阻断治疗给肿瘤的治疗带来了革新。但对其中的两种细胞即多核巨细胞（multinucleated giant cells,MGC）和B细胞却研究甚少。多核巨细胞反应常见于肉芽肿性炎症,在多种上皮类肿瘤中也有过报道,目前对于肿瘤中多核巨细胞的病理特征和生物学特点研究尚不清楚。本研究中,我们在食管癌中研究多核巨细胞的生物学特点和临床意义。B细胞介导的体液免疫是人体免疫重要组成部分。IgG4是体内含量最少的免疫球蛋白G亚类,是由成熟的B细胞分泌而来。在临床中IgG4阳性浆细胞的浸润增加主要见于IgG4相关性疾病,肿瘤组织IgG4阳性细胞的增加在胃癌,肝外胆管癌,恶性黑色素瘤中有过少量报道。目前关于食管癌中IgG4表达尚无相关研究,食管癌中IgG4相关免疫病理特征和临床特点亟待解答。材料方法:第一部分多核巨细胞的研究中运用免疫组化的方法在107例食管癌组织中检测了多核巨细胞的表达和分布,多核巨细胞的出现可以通过CD68染色结果和细胞的形态鉴别。并且通过用免疫荧光双重染色的方法鉴定了多核巨细胞的极化谱、细胞表面标志物、自分泌的酶,其中检测的指标有CD11c、HLA-DR、CD163、CD206、CD11b、CD64、CD32、CD16和MMP9等。我们联合多核巨细胞的表达情况和食管癌患者相关临床资料进行统计分析,通过Kaplan-Miere生存分析的方法,讨论多核巨细胞的表达与生存期的关系;通过单因素和多因素COX回归分析食管癌患者生存预后影响的因素,讨论多核巨细胞对生存预后是否有决定性的影响。第二部分B细胞相关的研究中,运用免疫组化和免疫荧光双重染色的方法对食管癌组织、癌旁组织、正常组织中Ig G亚类的浸润程度进行了分析统计,并且通过酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）的方法检测癌组织,正常组织和淋巴结中总Ig G、Ig G1、IgG4亚类含量。利用6色免疫荧光检测IgG4高表达样本中的免疫细胞分布特点。利用Ig G亚类亲和层析的方法提取患者血清中的Ig G1和IgG4亚类,并且将提取到的Ig G1,IgG4进行生物素标记,与同一患者的肿瘤组织进行反应,以检测Ig G1,IgG4 Fab段与肿瘤抗原反应性。通过生物标记的Ig G1和IgG4与外周血提取的单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC）进行反应,检测Ig G1,IgG4的Fc段与PBMC的结合能力。通过蛋白质免疫印迹检测生物素化IgG4与其他亚类Ig G和其他种属Ig G之间的反应能力。利用木瓜蛋白酶酶切技术,将Ig G切割为Fab和Fc片段,检测IgG4 Fab和Fc片段的结构特点。通过分别加入Ig G1和IgG4对单核细胞进行体外培养,对比探讨Ig G1和IgG4的对单核巨噬细胞的极化功能。结果:第一部分:多核巨细胞在免疫组化的染色上均表现为CD68（+）,我们在107例食管癌组织中检测到34（31.7%）例样本有阳性表达。在免疫荧光双重染色中发现多核巨细胞表达的CD11c（+）、HLA-DR（+）、CD163（-）、CD206（-）、CD11b（+）、CD64（-）、CD32（+）、CD16（+）和MMP9（+）,提示多核巨细胞具有向M1型巨噬细胞分化的趋势,并且在其细胞表面有较多的Fc R和补体受体的表达,同时有较多基质金属蛋白酶的分泌。通过对食管癌患者的临床信息分析,我们发现多核巨细胞的表达与淋巴结转移（p=0.011）、p TNM分期（p=0.044）呈负相关,与生存期（p=0.04）呈正相关,与鳞状细胞癌的类型（p=0.020）和高组织分化（p=0.063）相关。第二部分:本课题组前期研究发现IgG4在食管癌患者的血清中有显着的增加（p<0.0001）,并且癌组织中IgG4的浓度和IgG4+浆细胞密度也是显着高于同一患者的正常组织（p<0.01,p<0.001）。通过分析高表达IgG4的组织样本发现肿瘤相关的淋巴滤泡中心高表达IL-10细胞因子,IL-10在组织样本上的表达和IgG4有一致的趋势,部分IgG4（+）IL-10（+）细胞可能属于调节性B细胞。将Ig G1和IgG4从患者血清中分离后,发现来源于自身血清提取的Ig G1能够和冰冻肿瘤组织切片发生反应,而IgG4不能反应。Ig G1反应的部位和肿瘤细胞的位置一致。说明B细胞经过类别转换后,产生的IgG4其Fab抗原识别端发生了改变,表现出和Ig G1不同的特点。经过蛋白质的凝集素层析后电泳发现:与Ig G1相比,IgG4有高水平的甘露糖化和唾液酸化糖基化修饰。IgG4的糖基化修饰发生在重链上,导致其中一条重链的分子量比另一条高2-3k Da,随后的酶切实验证明这一修饰位点在重链的Fab段。IgG4的Fab段高水平糖基化可能是IgG4和Ig G1抗原识别能力存在差别的原因之一。在IgG4和Ig G1竞争PBMC结合位点的实验中,发现IgG4可以与Ig G1竞争和PBMC的结合,说明尽管IgG4的Fc段与Fc R结合能力不如Ig G1,却能够与Ig G1竞争结合位点。另外,研究中还发现IgG4能够和Ig G1发生反应,这种反应是通过Fc-Fc反应进行的。在细胞实验中,初步将Ig G1和IgG4用于单核细胞的分化培养,发现Ig G1和IgG4具有促进单核细胞分别向M1型和M2型巨噬细胞极化的作用。讨论和结论:本研究发现多核巨细胞是一类向M1型分化的巨噬细胞,在肿瘤微环境中能够吞噬消化肿瘤细胞,清除鳞癌组织中的角化珠,有利于恶性肿瘤细胞及其相关成分的降解,有益于肿瘤患者的生存预后。多核巨细胞的出现可作为食管鳞状细胞癌的一类特征,可能作为肿瘤生物学行为和生存预后的一类判断指标,为肿瘤的治疗提供新的思路。本研究发现IgG4在食管癌患者的组织和血清中增加,并且IgG4的增加和肿瘤病理分期相关。同一患者的来源的Ig G1具有针对肿瘤组织的抗原特异性,而IgG4抗肿瘤特异性弱于Ig G1。在结构上IgG4的重链Fab段具有高水平的糖基化修饰,修饰后的IgG4的Fab段和Ig G1的Fab段相比出现了结构上的差别。在患者血液中能够检测到小片段的IgG4 Fc片段,同时IgG4的Fc段具备和其他亚类、其他种属（鼠,兔,羊）反应的能力。高浓度的IgG4还能够降低Ig G1和PBMC的结合水平。与含量最大的Ig G1相比,IgG4的Fab段和Fc段的特点是IgG4与Ig G1发挥不同的生理功能的基础,也带给我们更多关于肿瘤免疫的思考和认识,当机体内的免疫分子IgG4逐渐增加时,预示着肿瘤内B细胞功能向局部免疫抑制方向转变。这些特点也为肿瘤的免疫治疗和单克隆抗体的研发提供更多的思路和启发。
张曦文[3]（2020）在《肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究》文中认为肺癌是临床最常见的肿瘤,患病率和死亡率居所有恶性肿瘤的首位。肺癌的主要治疗方式包括手术、放化疗、靶向治疗和免疫治疗等。树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是机体功能最强的专职抗原递呈细胞,能够有效激活T淋巴细胞免疫,是肿瘤免疫治疗中的调控关键。在肿瘤微环境中,肿瘤相关树突状细胞（Tumor-associated dendritic cells,TDCs）中脂质过氧化激活内质网应激,引起未折叠蛋白反（Unfolded Protein Response,UPR）,激活下游 IRE1α-XBP1 通路,产生的剪切型XBP1-s通过靶向多个脂质合成基因,诱导TDCs内脂质的异常积累,表现出未成熟表型和功能障碍,抑制了抗肿瘤免疫。有研究表明,PI3K-AKT-mTOR信号途径在脂质代谢中起重要调控作用,能够通过调节脂肪合成相关基因的表达来调控脂质合成,XBP1过表达会导致PI3K/mTOR表达的上调,敲除XBP1后,PI3K/mTOR表达下调,还有研究表明,抑制mTOR2可以下调脂质的生成。“脂浊”既为病理产物也是致病因素,多归属于中医学“痰浊”的病理范畴。肺瘤平膏是由“全国名中医”朴炳奎教授研制的临床治疗肺癌具有确切疗效的中药复方,具有益气养阴、化痰散结、解毒活血的功效,可通过多作用靶点发挥抗肿瘤作用。前期研究表明,肺瘤平膏（FLP）能够明显提高DCs功能,通过调节DCs的抗原递呈功能发挥抗肿瘤效应,并且在调控PI3K/mTOR通路方面具有一定优势。作为肺瘤平膏中化痰类代表药物桔梗的主要有效组分,研究表明,桔梗皂苷D（PlatycodinD,PD）具有明确的抗肿瘤、免疫调节、降脂和抗氧化等功能,并且具有抑制ROS聚集、调节PI3K/mTOR信号的作用。因此,我们推测PD可能是FLP调控脂质代谢逆转TDCs功能的有效组分之一,可能通过抑制TDCs脂质异常堆积逆转TDCs功能,并希望对其效应机制进行初探。目的:（1）构建TDCs共培养体系,探究肺瘤平膏在毒胡萝卜素（TG）诱导ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及作用机制。（2）初探PD对TDCs的免疫调节功能,及探究TG激活ERS剪切XBP1s后,对TDCs中脂质含量和功能的影响及可能的效应机制。方法:（1）小鼠骨髓源树突状细胞的分离、培养,建立体外肿瘤相关树突状细胞共培养模型。（2）模拟肿瘤微环境,通过FLP含药血清干预TDCs模型后,流式细胞术观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达;通过混合淋巴细胞反应,CCK8检测混合淋巴细胞增殖、流式检测T淋巴细胞亚群活化,Luminex技术检测TDCs细胞因子分泌。（3）毒胡萝卜素干预TDCs模型,观察TG激活ERS,对IRE1α-XBP1通路的影响,及对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（4）FLP含药血清,作用TG干预后的ERS激活后的TDCs模型,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（5）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 FLP 含药血清对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。（6）通过LDH、CCK8检测技术,观察PD对DCs毒性和Lewis肺癌细胞的杀伤能力。（7）模拟肿瘤微环境,通过PD干预TDCs模型后,观察对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（8）通过构建TG激活ERS后的TDCs模型,观察PD对TDCs脂质含量、共刺激分子表达、混合细胞增殖和亚群活化、细胞因子的影响。（9）通过 Western blot、qPCR 技术,检测 PD 对 BiP-IRE1α-XBPI、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白的表达情况,探索可能的作用机制。结果:（1）流式检测诱导后DCs表面分子CD1 1c+阳性表达比例为76.5%,并与肺癌细胞培养上清共培养,冻融抗原刺激,构建TDCs共培养模型。（2）在模拟的肿瘤微环境中,FLP含药血清干预后,降低TDCs胞内脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86的表达最为明显（P<0.05）,FLP刺激共培养淋巴细胞增殖（P<0.05）,明显提高T细胞中Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）,降低Tregs细胞的表达（P<0.05）,提高细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（3）TG作用后,在TDCs培养模型中,BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA、蛋白表达增加（P<0.05）,脂质含量较模型组增加（P<0.05）,影响TDCs表面分子的表达,MCH-Ⅱ、CD80、CD86的表达均明显降低（P<0.05）;抑制混合淋巴细胞的增殖能力（P<0.05）,降低Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,提高Tregs亚群的表达（P<0.05）,同时抑制细胞因子IL-12、IFN-γ的分泌（P<0.05）。（4）FLP含药血清作用于TG干预后的TDCs,脂质含量明显下降（P<0.05）,恢复TDCs表面分子的表达,其中以提高CD80、CD86表达水平较为明显（P<0.05）,提高TG干预后的混合淋巴细胞增殖能力（P<0.05）,提高Th、CTL细胞亚群比例（P<0.05）、降低Tregs细胞的亚群表达（P<0.05）,促进TG作用后 TDCs 细胞因子 IL-12p70、IFN-γ 的分泌（P<0.05）。（5）qPCR、Western blot 结果显示,对于 TG 激活 ERS 后,BiP-IRE1 α-XBP 1、PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白表达量增加（P<0.05）;FLP含药血清干预TG作用后的TDCs,FLP+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1通路mRNA和蛋白的表达（P<0.05）,对重要脂质调节转录因子XBP1-s,具有降低其mRNA和蛋白表达的作用;同时,肺瘤平膏含药血清作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,并且明显降低AKT蛋白的磷酸化水平。（6）LDH结果显示,30uM以下的PD浓度,对DCs无明显损伤,或影响DCs细胞LDH的释放;CCK-8实验结果显示,PD能够有效杀伤Lewis肺癌细胞,其IC50值在13uM左右。（7）在TDCs共培养体系中,PD高中低浓度均能够有效降低TDCs中的脂质含量（P<0.01）,提高TDCs表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,提高CD80（PDH、PDM,P<0.05）、CD86（PDM、PDL,P<0.05）的表达;PDH较强混合淋巴细胞的增殖（P<0.05）;PD高中低组均能提高Th、CTL细胞的亚群表达率（P<0.05）,抑制 Tregs 亚群表达（PDH,P<0.05）;提高 IL-12p70（PDH、PDM,P<0.05）IFN-γ（PDH,P<0.05）细胞因子的分泌。（8）TG干预诱导RES后,PD高、中、低剂量组均能降低TG干预后TDCs中脂质含量（P<0.01）;PDH能够提高表面MCH-Ⅱ的表达（P<0.05）,各剂量组均能提高CD80及CD86的表达（P<0.05）,PDH具有提高淋巴混合细胞的增殖能力（P<0.05）,PDH、PDM能够明显提高Th、CTL细胞亚群的表达（P<0.05）,PD各剂量组均能降低Tregs细胞亚群的表达（P<0.05）,并能促进 TDCs 分泌 IL-12p70（PDH,P<0.05）、IFN-γ（PDH、PDM,P<0.05）细胞因子。（9）qPCR、Western blot结果显示,TG激活ERS后,PD+TG组能够显着降低BiP-IRE1α-XBP1（t/u/s）通路mRNA和蛋白的表达（P<0.01）,同时,PD+TG组作用后,TG激活的PI3K-AKT-mTOR通路mRNA和蛋白具有一定程度的下降,其中降低p-AKT磷酸化蛋白表达（P<0.05）水平作用较为明显。结论:基于本实验条件下,我们推测:（1）TG诱导ERS,激活IRE1α-XBP1通路,产生XBP1-s剪切形式,可造成TDCs脂质异常堆积和TDCs的功能障碍。（2）FLP含药血清能够逆转TG激活ERS诱导XBP1剪切造成的TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能障碍。（3）PD可能是FLP发挥改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的有效组分之一。（4）FLP含药血清及其有效组分PD调节改善TDCs脂质异常堆积和抗原呈递功能的作用机制可能是通过调控BiP-IRE1α-XBP1 和 PI3K-AKT-mTOR 通路实现的。
程纪伟[4]（2020）在《组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响》文中研究说明食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤,位居全球恶性肿瘤发病率的第8位,死亡率的第6位。食管癌发病高风险区发病率可达低风险区的500倍,表现出明显的地区差异性,其中我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。因此,寻找新的食管癌防治手段是我国食管癌研究领域的重要课题。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。提示,阐明肿瘤浸润关键免疫细胞亚群及其与肿瘤微环境的交互作用机制是进行有效免疫治疗干预的关键。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。因此,本研究拟依托临床生物样本资源优势,以人食管癌组织特异性记忆T细胞为切入点,试图探明食管癌浸润TRM细胞生物学特征,从而为寻找新的食管癌防治方法提供新的思路。第一部分食管癌TILs细胞亚群构成研究研究背景食管癌在全球范围内是一种高发的消化道恶性肿瘤。我国为食管癌高发国家,发病率和死亡均列世界第一,严重危害我国人民健康。近年来免疫检查点治疗（Checkpoint therapy）在多种恶性肿瘤取得了令人鼓舞的进展,已成为继手术、化疗、放疗之后人恶性肿瘤治疗领域里程碑式的进展。最新的Ⅱ期多中心临床试验显示,免疫检查点抑制剂能够有效提高晚期食管癌患者的生存率。新近有研究表明,肿瘤组织浸润淋巴细胞（Tumor-infiltrating lymphocytes,TILs）组成及相互作用、免疫细胞检查点分子表达等均与免疫治疗效果密切相关。TRM（Tissue resident memory T cells,TRM cells）细胞是新近发现的一群以高表达CD103及CD69分子为特征并特异性定植于非淋巴外周组织的记忆T细胞。TRM细胞被认为是外周组织如粘膜、皮肤、消化道及呼吸道免疫应答的第一道防线。现有的研究显示TRM细胞在病毒感染、过敏性皮炎、及多种炎症疾病中具有重要作用。小鼠感染模型研究显示TRM细胞对组织局部病原的清除能力显着强于外周血循环T细胞。提示TRM细胞在组织局部免疫稳态的维持中具有非常重要的作用。然而,TRM细胞在人类肿瘤微环境中的作用研究才刚刚开始。新近,仅有少量基于免疫组化或基因表达与预后相关性分析的研究显示肿瘤浸润TRM细胞数量与肺癌及黑色素瘤患者预后相关。我们通过单细胞分析平台Cytobank对食管癌及配对正常组织浸润 T 细胞进行 SPADE（Spanning-tree Progression Analysis of Density-normalized Events,SPADE）分析发现,人食管癌组织内CD8+TRM细胞（CD8+CD103+CD69+TRM细胞）含量较正常组织明显增高,通过传统设门分析方法我们同样确认了人CD8+TRM细胞特异性表达于食管癌组织及配对正常食管组织,且人食管癌组织CD8+TRM细胞含量较正常组织明显增高。以上初步研究结果提示:CD8+TRM细胞的异常增高是人食管癌炎性微环境内T细胞组成改变的非常重要的一个特征。因此,进一步探明CD8+TRM细胞在人食管癌免疫微环境中的作用及其参与肿瘤免疫应答及调控的潜在机制,能为寻找靶向干预食管癌免疫微环境关键细胞的免疫治疗新策略提供方向。目的探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。方法这部分研究工作将在医院伦理委员会批准和患者知情同意下,告知患者研究相关事项并签署知情同意书后,首先收集食管癌手术患者配对新鲜肿瘤组织和相对正常食管组织,通过原代组织浸润淋巴细胞分离方法制备单细胞悬液。然后通过多色荧光抗体标记,高通量多色流式检测食管癌及配对正常组织内TILs细胞及其亚群表达情况,探明食管癌组织内异常增高或降低的关键TILs细胞亚群。从而明确CD8+TRM细胞在食管癌组织TILs细胞中的地位。为下一步分离并鉴定食管癌CD8+TRM细胞在食管癌组织内的分布及特征奠定基础。结果（1）对人食管癌及配对正常组织CD3+T细胞SPADE分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。（2）流式设门分析显示人食管癌组织TRM细胞较配对正常组织在比例及数量上均显着增高。结论CD8+TRM细胞在人食管癌组织显着富集。第二部分食管癌浸润CD8+TRM细胞亚群、分布、表型及生物学特征研究研究背景目前TRM细胞被认为具有以下特征:（1）具有长时期自我更新能力;（2）大量表达于上皮粘膜等免疫屏障组织;（3）识别微生物产物、细胞因子、危险信号分子及应激相关配体;（4）快速分泌多种炎症因子。经典的感染免疫学研究显示,在初始感染后小鼠阴道粘膜CD8+TRM细胞能够快速识别病原并产生特异性免疫记忆;而再次接触同类抗原的时候通过分泌大量细胞因子促进体液免疫应答、DC细胞成熟及自然杀伤细胞活化。提示TRM细胞广泛参与机体多种免疫应答的调节。但其在肿瘤发生发展中的作用尚不清楚。我们前期的研究发现CD8+TRM细胞在人食管癌组织内显着增高,加之先前的研究显示CD8+TRM细胞在慢性炎症模型中能够启动固有免疫及获得性免疫,并能对多种免疫应答进行调控。由此我们推测CD8+TRM细胞是人食管癌炎症免疫失调及肿瘤进展的关键因素之一。目的这部分研究工作重点通过多种CD8+TRM细胞相关细胞表面标记抗体,运用多色流式检测分析技术,检测食管癌及其配对正常组织单细胞悬液内CD8+TRM细胞的亚群、组织分布及其他表型特征。阐明食管癌组织浸润CD8+TRM细胞的组织分布、分化相关表型表达特征。从而初步明确其分化表型及组织趋向性等基本生物学特征。为进一步明确其在食管癌相关炎症组织中功能重塑及进一步极化的调控机制打下基础。方法（1）食管癌浸润CD8+TRM细胞组织分布特征检测:取手术切除新鲜配对食管癌及正常组织,无菌环境制备单细胞悬液,然后通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69）,分析不同组织CD8+TRM细胞比例及数量。（2）分化相关表型鉴定:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、CD45RA、CD45RO）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞分化相关表型特征。（3）免疫检查点分子检测:通过多色流式检测（CD45、CD3、CD8、CD103、CD69、PD-1、Tim-3）,分析肿瘤及配对正常组织浸润CD8+TRM细胞免疫检查点分子表达特征。结果（1）食管癌肿瘤浸润T细胞以CD4和CD8细胞为主,因此我们对人食管癌配对组织CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞进一步分析显示,食管癌患者配对正常食管组织及肿瘤中均表达较高比例的CD8+TRM细胞及CD4+TRM细胞。然而,统计学分析显示人食管癌组织CD8+TRM细胞比例和绝对数量均较配对正常组织均显着增高（P<0.0001）。相反,虽然CD4+TRM细胞数量在食管癌组织也呈增高趋势,但其在人食管癌组织中比例较配对正常食管组织却呈降低趋势。（2）我们对人食管癌及配对正常组织CD3+TRM细胞的研究显示,人食管癌浸润CD3+TRM细胞较正常配对组织显着增高。进一步分析显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞主要以CD8+TRM细胞和CD4+TRM细胞为主,仅有少量TRM细胞亚群为γδT细胞和iNKT细胞。更重要的是我们对肿瘤组织TRM细胞亚群的平行比较发现,人食管癌浸润CD8+TRM细胞在比例和数量上较其余TRM细胞亚群均占有绝对优势。（3）基于小鼠慢性自身免疫性疾病模型的研究显示,持续存在于病变组织的CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭状态（Immune exhaustion）,且能持续募集促炎性CD4+Th细胞及巨噬细胞。提示,在慢性炎症持续存在的情况下CD8+TRM细胞发生免疫耗竭,并进一步促进局部炎症反应。我们的研究显示,人食管癌及配对正常食管组织TRM细胞以效应记忆T细胞（Effector memory T cells,TEM）及中央型记忆T细胞（Central memory T cells,TCM）为主,进一步研究显示,人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。我们通过viSNE（visual stochastic network embedding,viSNE）分析也同样证实 了人食管癌组织CD8+TRM细胞PD-1表达较配对正常食管组织显着增高。提示,人食管癌炎性免疫微环境内某些因素促进CD8+TRM细胞免疫耗竭。而肿瘤微环境内慢性炎症的持续存在已被公认与肿瘤免疫调控失衡密切相关。因此,我们有理由相信人食管癌组织CD8+TRM显着增高并表现为免疫耗竭状态这一现象与肿瘤炎性微环境稳态失衡有密切关联。结论（1）CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位。（2）人食管癌浸润CD8+TRM细胞表现为免疫耗竭表型。第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究研究背景以上研究证明CD8+TRM细胞在人食管癌组织浸润TRM细胞中占主导地位,通过分析食管癌浸润CD8+TRM细胞数量与肿瘤临床特征及预后的相关性,为靶向干预食管癌相关炎症免疫调节的关键细胞（分子）提供新的思路,也为临床运用CD8+TRM细胞作为食管癌预后预测指标及靶向干预CD8+TRM细胞介导的食管癌免疫抑制提供了潜在可能性,具有临床转化意义。目的这部分研究工作重点将应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测,结合患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期、临床病理特征的相关性。从而明确人CD8+TRM细胞与食管癌临床病理特征及预后的相关性。方法（1）应用既往患者食管癌组织芯片或石蜡切片通过免疫组织化学染色的方法,对122例食管癌患者肿瘤组织内CD8+TRM细胞数量进行检测。（2）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者临床病理特征的相关性分析:收集患者临床资料,分析CD8+TRM细胞数量与肿瘤TNM分期及其他临床病理特征的相关性。（3）食管癌浸润CD8+TRM细胞与患者预后相关性分析:应用既往患者食管癌组织芯片免疫组织化学染色的方法,分析CD8+TRM细胞数量与患者预后的关系。结果（1）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者总生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）（2）CD8+TRM细胞数量高的食管癌患者无病生存期高于CD8+TRM细胞数量低的食管癌患者,（log-rank P<0.05）结论（1）CD8+TRM细胞高表达的食管癌患者预后良好,CD8+TRM细胞可以作为一个判断食管癌患者预后的生物学指标。（2）CD8+TRM细胞可以作为预测指标筛选接受免疫治疗临床实验的食管癌患者。
脱广鑫[5]（2020）在《小干扰RNA抑制树突瘤苗IL-10受体后对食管癌细胞免疫效应的作用和机制研究》文中进行了进一步梳理背景与目的 食管癌的发病率排名全球恶性肿瘤第七位,死亡率排名第六位。每年全球食管癌新增病例将近一半来自于我国,是我国癌症死亡的五大主要原因之一。目前,食管癌以手术治疗为主,结合放疗、化疗等多学科综合治疗,但其预后不佳,而且放疗、化疗还可能破坏自身免疫系统,从而诱导免疫耐受。因此,探究对机体损伤小且高效的食管癌治疗手段具有极为深远的临床意义。目前研究发现,食管癌的发生发展及预后与树突状细胞密切相关,肿瘤患者体内的树突状细胞由于肿瘤微环境的影响,其数量缺乏,且大部分功能异常,从而严重影响了自身抗肿瘤免疫功能,肿瘤微环境中存在多种免疫抑制因子,其中IL-10的免疫抑制作用最强。因此,近年来有关肿瘤免疫治疗的研究主要集中在寻找并优化抗肿瘤疫苗,以及逆转机体的免疫抑制状态,克服免疫抑制因子对疫苗的抑制作用。本研究应用小干扰RNA抑制IL-10受体表达的树突状细胞进行动物体内实验,首先,应用荧光染料CFSE标记DCs,观察其在局部淋巴结的迁移能力;然后,应用TUNEL染色技术、流式细胞术等方法检测注射不同瘤苗后肿瘤细胞原位凋亡情况;最后,比较皮下、淋巴内以及静脉注射三种不同途径回输DCs瘤苗对移植瘤细胞凋亡情况的影响,以及疗效差异。初步研究IL-10R-si RNA DCs抗食管癌免疫反应的作用和机制,为临床提高DCs瘤苗的治疗效果提供实验基础和理论依据,为肿瘤免疫疫苗临床回输方式提供新的思路。总之,本研究以树突状细胞表面IL-10受体作为研究靶点,主要运用荧光标记示踪、TUNEL染色、流式细胞术及si RNA基因沉默技术研究IL-10R-si RNA DCs抗食管癌免疫反应中的作用和机制,共分为3部分。第一部分:IL-10R-si RNA DCs在局部淋巴结内的迁移能力的研究方法 1.采用人食管癌细胞TE-11接种于裸鼠右侧腋窝皮下,进行裸鼠移植瘤模型构建,并随机分为2组;2.采用荧光示踪法分别向2组小鼠足垫注射等量的CFSE标记的IL-10R-si RNA DCs及普通的DCs,观察DCs在动物体内区域淋巴结迁移的能力。结果 1.应用TE-11细胞（人食管癌细胞）接种于裸鼠皮下,可成功制备移植瘤模型;2.IL-10R-si RNA DCs在腋窝部引流区淋巴结中聚集增多,其迁移能力明显增强。第二部分:IL-10R-si RNA DCs对小鼠体内移植瘤抑制作用的研究方法 1.采用TUNEL染色技术检测注射不同瘤苗后肿瘤细胞原位凋亡情况;2.采用流式细胞技术和Expo 32 ADCs软件分析移植瘤凋亡率;3.采用Multicycle AV软件拟合分析移植瘤细胞凋亡过程中DNA周期变化;4.采用流式细胞技术检测移植瘤组织中凋亡相关蛋白Fas和Caspase-3表达情况。结果 1.IL-10R-si RNA DCs可以显着降低肿瘤细胞增殖指数,提高肿瘤细胞凋亡率;2.IL-10R-si RNA DCs可使移植瘤细胞S、M期降低,抑制移植瘤细胞的有丝分裂,增加肿瘤细胞原位凋亡;3.IL-10R-si RNA DCs可以显着提高Fas和Caspase-3蛋白表达,促进肿瘤细胞凋亡;4.IL-10R-si RNA DCs在体内对食管癌具有强大的细胞毒性作用。第三部分:IL-10R-si RNA DCs最佳回输方式的研究方法 采用皮下、淋巴内以及静脉注射三种途径回输IL-10R-si RNA DCs,比较三种回输方式对疫苗发挥抗肿瘤免疫反应的影响,以及疗效差异。结果 1.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显着缩小移植瘤体积和重量,明显提高肿瘤抑制率;2.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显着降低移植瘤细胞增殖指数,明显提高细胞凋亡率;3.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显着增加肿瘤凋亡相关的蛋白Fas和Caspase-3的表达,促进细胞原位凋亡;4.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可显着降低移植瘤细胞DNA周期中S、M期,移植瘤细胞有丝分裂明显受抑制;5.与其他两种回输途径相比,淋巴内回输瘤苗可以更好的发挥疫苗抗肿瘤免疫反应。结论 1.IL-10R-si RNA DCs解除了IL-10对DCs的抑制作用,增强了迁移能力,为DCs有效发挥抗肿瘤免疫反应创造了有利的前提条件;2.IL-10R-si RNA DCs通过阻断IL-10抑制途径,提高了DCs抗肿瘤免疫反应,促进肿瘤细胞凋亡,为临床提高DCs瘤苗的治疗效果提供实验基础和理论依据;3.淋巴内途径回输IL-10R-si RNA DCs可有效保护DCs免于破坏,进而产生更强的抗肿瘤免疫作用,为肿瘤免疫疫苗临床回输方式提供新的思路。
张大川[6]（2018）在《胃癌肿瘤微环境内肿瘤浸润淋巴细胞和三级淋巴结构的研究》文中指出第一部分肿瘤浸润淋巴细胞在胃癌中的浸润与临床病理参数及预后的关系背景:胃癌是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率和死亡率逐年升高,目前治疗方法主要为外科切除肿瘤后进行放化疗辅助治疗。近年肿瘤免疫疗法取得突破,肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）作为肿瘤微环境（TME）中主要免疫细胞的作用尤为重要,但TIL在各肿瘤中的浸润存在异质性并与患者预后有关。目前,胃癌领域中TIL浸润情况及其与临床病理参数和患者预后间的关系模式尚未建立。目的:检测TIL在胃癌组织中的浸润程度,分析其浸润与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者总生存期（overall survival,OS）的影响,评估其与胃癌患者预后的关系。方法:回顾性队列分析苏州大学附属第三医院2002年1月至2008年12月总计1033例胃癌术后患者病例,由两名资深病理学医师阅片诊断并评估H&E染色切片中TIL组织学评分。记录临床资料,进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归分析和构建nomogram模型等分析TIL浸润与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:分析H&E切片发现,TIL的组织形态在不同病例中具有异质性,在1033例病例中TIL高浸润组532例（51.5%）。统计分析结果显示,TIL浸润与肿瘤大小、TNM分期、病理分级、LN转移、神经侵犯和脉管内癌栓的差异有显着的统计学意义（P<0.001）。生存分析结果显示TIL高浸润为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高浸润的患者平均OS为78.73月,低浸润患者平均生存期为42.81月（χ2=174.77,P<0.001）,TNM I-III分期中TIL高浸润的患者都具有良好的预后（P<0.001）。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.897,95%CI:1.437-2.504,P<0.001）;肿瘤大小超过5cm的胃癌患者比小于5cm患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.224,95%CI:1.014-1.478,P=0.035）;淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.509,95%CI:1.080-2.110,P=0.016）;可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.308,95%CI:1.073-1.595,P=0.008）;TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高（TNM II stage:HR=2.519,95%CI:1.583-4.009,P<0.001,TNM III stage:HR=4.702,95%CI:2.769-7.984,P<0.001）;TIL低浸润胃癌患者比高浸润患者的肿瘤进展风险更高（HR=0.464,95%CI:0.384-0.561,P<0.001）。随后根据多因素Cox回归模型确定的独立性预后因素构建Nomogram模型,模型C-指数为0.77,TNM分期C-指数为0.72,TIL浸润C-指数为0.65,与TNM分期系统或TIL浸润程度相比nomogram模型预测患者OS的精确度更高。结论:TIL浸润与用于评估肿瘤恶性程度、肿瘤转移的临床病理参数呈显着负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,并且在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。利用TIL和患者年龄、肿瘤大小、淋巴结转移、神经侵犯、TNM分期构建的nomogram模型与TNM分期相比包含了TME中免疫作用的因素,因此可更全面的反映患者信息,更好的预测患者预后。第二部分三级淋巴结构在胃癌中的表达与临床病理参数及预后的关系背景:TME是肿瘤发生发展的内环境,包括肿瘤细胞组成的肿瘤实质,还包括肿瘤间质成分,比如间质支持细胞、血管和不同的免疫细胞群,反映着机体与肿瘤对抗的状态。作为肿瘤的生存环境,其中不仅包含异位浸润的TIL,还含有形成的三级淋巴结构（TLS）。而TLS具有与二级淋巴器官类似的功能,通过趋化因子、细胞因子等招募幼稚T、B细胞至TME内,并活化发挥相应的免疫功能。然而TLS在胃癌组织内的形成情况及与患者预后的关系仍不明确。目的:检测TLS在胃癌组织中的表达,分析其表达与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者OS的影响,评估其与胃癌患者预后的关系。方法:回顾性队列分析苏州大学附属第三医院2002年1月至2008年12月总计1033例胃癌术后患者病例,由两名资深病理学医师阅片诊断并评估H&E染色切片中TLS组织学评分。记录临床资料,进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型等分析TLS表达与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:分析H&E切片发现,TLS在1033例病例中高表达组631例（61.1%）。统计分析结果显示,TLS表达与肿瘤大小和LN转移的差异有显着的统计学意义（P<0.05）。生存分析结果显示TLS高表达为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高表达的患者平均OS为62.27月,低表达患者平均生存期为55.70月（χ2=11.272,P=0.001）。TNM I期和II期的患者中TLS高表达组具有良好的预后（P=0.045,P=0.003）,TNM III期患者中TLS表达与患者预后没有统计学差异（P=0.165）。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.859,95%CI:1.408-2.454,P<0.001）;高级别胃癌患者比中低级别患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.344,95%CI:1.092-1.654,P=0.005）;淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.570,95%CI:1.127-2.189,P=0.008）;可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.415,95%CI:1.161-1.726,P=0.001）;可见脉管内癌栓胃癌患者比未见癌栓患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.203,95%CI:1.007-1.438,P=0.042）;TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高（TNM II stage:HR=2.158,95%CI:1.580-4.011,P<0.001,TNM III stage:HR=5.132,95%CI:3.039-8.666,P<0.001）;TLS低表达胃癌患者比高表达患者的肿瘤进展风险更高（HR=0.755,95%CI:0.634-0.900,P=0.002）。结论:TLS表达与用于评估肿瘤转移的临床病理参数呈显着负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,并且在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。TLS主要影响TNM分期I-II期患者的预后,即早期和中期肿瘤患者中TLS高表达具有良好的预后,晚期肿瘤患者TLS表达与预后不具有统计学关系。第三部分联合亚组分析TIL和TLS与胃癌患者预后的关系背景:TIL和TLS在多种实体性肿瘤中的表达都与患者预后情况相关。课题组前期工作也证明TIL和TLS的表达与胃癌患者OS相关并是独立性预后因素。TIL反映免疫细胞浸润情况,TLS反映淋巴细胞器官样结构的形成,TIL内细胞成分可以促进TLS的形成而TLS可以招募免疫细胞异位浸润至肿瘤局灶。但是两者间联合的表达情况及对患者预后的影响仍缺乏进一步验证。目的:分析胃癌组织内TIL和TLS表达的差异及相关性。联合亚组分析TIL和TLS（TIL-TLS）的表达与临床病理参数的关系和对胃癌术后患者OS的影响,评估其与胃癌患者预后的关系和临床指导意义。方法:根据前述TIL和TLS组织学评分数据进行统计学分析两者的相关性,随后亚组分型后进行χ2检验、Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型分析胃癌中TIL-TLS的表达与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:根据TIL和TLS组织学评分数据进行统计分析后发现两者在胃癌组织内表达具有显着的统计学差异并具有相关性（χ2=34.547,P<0.001,r=0.192,P<0.001）。根据TIL-TLS双高表达将1033例病例分组为TIL-TLS高表达组371例（35.9%）,TIL-TLS低表达组662例（64.1%）。TIL-TLS表达与胃癌患者的肿瘤大小、TNM分期、病理分级、LN转移、神经侵犯和脉管内癌栓的差异有显着的统计学意义（P<0.001）。生存分析结果显示TIL-TLS高表达为胃癌术后患者预后的正性预测因子,其高表达的患者平均OS为80.72月,低表达患者平均OS为50.78月（χ2=101.484,P<0.001）,TNM I-III期患者中高表达组具有良好的预后（P=0.001,P<0.001,P<0.001）。多因素Cox分析表明:50岁以上胃癌患者比50岁以下患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.023,95%CI:1.014-1.032,P<0.001）;高级别胃癌比中低级别胃癌患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.232,95%CI:1.002-1.516,P=0.048）;淋巴结转移胃癌患者比未见淋巴结转移患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.522,95%CI:1.088-2.129,P=0.014）;可见神经侵犯胃癌患者比未见神经侵犯患者的肿瘤进展风险更高（HR=1.322,95%CI:1.084-1.613,P=0.006）;TNM分期增高胃癌患者比低分期患者的肿瘤进展风险更高（TNM II stage:HR=2.461,95%CI:1.526-3.967,P<0.001,TNM III stage:HR=5.021,95%CI:2.918-8.639,P<0.001）;TIL-TLS低表达胃癌患者比高表达患者的肿瘤进展风险更高（HR=0.467,95%CI:0.378-0.578,P<0.001）。结论:胃癌组织内TIL与TLS的表达具有相关性。TIL-TLS高表达与用于评估肿瘤进展和转移情况的临床病理参数呈显着负相关,为胃癌术后患者预后的正性预测因子,是理想的组合性预测因子。TNM I-III期的TIL-TLS高表达组患者具有良好的预后。在多因素Cox回归模型中为具有保护作用的独立性预后因素。第四部分TME内淋巴细胞亚型分析背景:TME作为肿瘤内生环境,对肿瘤发生发展起到重要作用。TIL和TLS是TME内淋巴细胞的主要构成和组织结构,其内所含的淋巴细胞亚型直接影响两者的免疫功能。目前对TIL或TLS内细胞亚型的研究也有报道,但是针对胃癌组织内淋巴细胞亚型分布情况仍有待研究。目的:通过免疫组化标记TME内淋巴细胞亚型,验证TIL和TLS组织学评分的准确性。观察三级淋巴结构生发中心内的CD8+T细胞（gcCD8+TIL）的表达情况,统计分析其与临床病理参数的差异和对胃癌术后患者OS的影响。将TIL、TLS、TIL-TLS和gcCD8+TIL定义为免疫浸润参数并评估其与胃癌患者预后的关系和临床指导意义。方法:随机选取苏州大学附属第三医院2006年至2008年间的63例胃癌术后患者病例,通过H&E染色切片由两名资深病理学医师阅片诊断并评估TIL和TLS组织学评分。随后进行CD3、MECA79和CD8的免疫组化染色并评估免疫组化染色结果。使用χ2检验和一致性检验评估CD3+TIL表达与TIL组织学评分的准确性。使用χ2检验和相关性检验评估MECA79表达与TLS表达的相关性及TLS组织学评分的准确性。使用χ2检验和Kaplan-Meier生存分析、Cox回归模型等分析免疫浸润参数与临床病理参数及患者OS的关系,分析影响肿瘤进展风险的因素。结果:63例胃癌患者分组情况为:TIL高浸润组44例（69.8%）;TLS高表达组43例（68.3%）;TIL-TLS高表达组32例（51.8%）;MECA79高表达组40例（63.5%）;CD3+TIL高表达组43例（68.3%）;gcCD8+TIL高表达组23例（35.9%）。CD3+TIL与TIL组织学评分的差异具有统计学意义（χ2=27.94,P<0.001）,并且具有一致性（κ=0.666,P<0.001）。MECA79与TLS组织学评分的差异具有统计学意义（χ2=10.262,P=0.001）,并且具有相关性（r=0.389,P=0.002）。TIL与肿瘤大小、神经侵犯、LN转移、病理分级和TNM分期的差异具有统计学意义。TLS与各项临床病理参数之间没有统计学差异。TIL-TLS与神经侵犯、脉管内癌栓、LN转移、病理分级的差异具有统计学意义。gcCD8+TIL与患者年龄、病理分级和TNM分期的差异具有统计学意义。在Kaplan-Meier生存分析中,TIL、TLS、TIL-TLS和gcCD8+TIL为胃癌术后患者预后的正性预测因子,与胃癌患者OS显着相关（P=0.001,P=0.011,P<0.001,P<0.001）。TNM III期患者中gcCD8+TIL高表达组具有良好的预后（P=0.002）。为了对比免疫浸润参数对患者OS的综合影响,按照免疫浸润参数组合的不同进行了多组多因素Cox回归模型分析。将TIL、TLS、gcCD8+TIL与临床病理参数进行多因素Cox回归分析,结果显示gcCD8+TIL是独立性预后因素（HR=0.087,95%CI:0.011-0.692,P=0.021）;将TIL-TLS、gcCD8+TIL与临床病理参数进行多因素Cox回归分析,结果显示TIL-TLS（HR=0.247,95%CI:0.069-0.882,P=0.031）和gcCD8+TIL（HR=0.067,95%CI:0.008-0.561,P=0.013）是独立性预后因素;单独对免疫浸润参数TIL、TLS和gcCD8+TIL进行多因素Cox模型,结果显示TIL（HR=0.322,95%CI:0.124-0.835,P=0.020）和gcCD8+TIL（HR=0.059,95%CI:0.008-0.451,P=0.006）是独立性预后因素。结论:经CD3、MECA79免疫组化染色验证TIL和TLS组织学评分是准确可行的。gcCD8+TIL与多种提示肿瘤进展快预后不良的临床病理参数呈显着负相关,是胃癌术后患者预后的正性预测因子,尤其晚期胃癌患者中gcCD8+TIL高表达组具有良好的预后。免疫浸润参数与评估肿瘤转移指标的临床病理参数呈显着负相关,是理想的组合性预测因子。在多因素Cox模型中,免疫浸润参数是具有保护作用的独立性预后因素,其中gc CD8+TIL和TIL-TLS的保护作用最强。
王雷[7]（2010）在《白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究》文中提出食管癌是人类常见恶性肿瘤之一,全世界每年约30万人死于食管癌。我国是食管癌高发区,发病率为20/10万,居世界该病例第一位,我国每年因食管癌死亡的人数占全部恶性肿瘤死亡的近四分之一。食管癌的治疗手段以手术切除为主,辅以化疗和放疗,但其远期疗效仍不够理想,治疗后患者五年生存率多年来徘徊在30%左右,转移和复发是患者死亡的主要原因。随着免疫学和分子生物学研究的进展和对肿瘤认识的逐步深入,明确了食管癌的发生、发展与机体免疫功能低下密切相关。因此,如何激发机体抗肿瘤免疫反应,杀灭体内残余癌细胞,是防治食管癌复发转移,提高疗效的关键。由此,生物治疗已成为肿瘤治疗的一种新策略。诱导机体抗肿瘤特异性和细胞毒活性T细胞产生,达到特异性攻击肿瘤的作用是肿瘤生物治疗的本质。树突状细胞（dendritic cell,DC）是机体内功能最强的抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）,能摄取、加工提呈抗原,刺激初始T细胞增殖分化,处于启动、调控并维持细胞免疫应答的中心环节,对激发抗肿瘤免疫有重要作用,在肿瘤细胞和T细胞的相互作用中起桥梁和枢纽作用。成熟的DC能够表达高水平的共刺激分子、黏附分子及MHC分子,可有效内化、加工和提呈可溶性抗原、肿瘤抗原,并能激发初始T细胞,启动T细胞介导的特异性抗肿瘤免疫反应。荷瘤宿主体内DC的异常是肿瘤免疫逃逸机制的一个重要方面,DC数量减少和功能低下或缺陷,不能有效提呈肿瘤抗原和提供协同刺激信号,以致T细胞介导的抗肿瘤免疫不能有效发挥作用,因此,如何增加患者体内DC数量并活化DC功能是肿瘤免疫治疗的一个重要研究方向。细胞因子是免疫调节的重要因素,可以活化免疫细胞,增强免疫细胞的功能,有的细胞因子甚至可以直接杀伤肿瘤细胞。因此,通过适当载体将细胞因子基因定向导入肿瘤细胞,使其在宿主体内持续产生细胞因子,可增强机体免疫功能,并且活化的DC进而诱导产生特异性抗肿瘤免疫反应。白细胞介素27（Interleukin,IL-27）是2002年Pflanz等发现并命名的一种新的细胞因子,由活化的树突状细胞和巨噬细胞等抗原提呈细胞产生。IL-27具有免疫调节活性,在抗肿瘤免疫过程中起重要作用。由于该因子是新近发现的细胞因子,许多作用机制尚不清楚。本研究主要目的是深入探讨IL-27转染DC后在人食管癌细胞荷瘤小鼠体内外的抗肿瘤作用及其机理,为食管癌免疫治疗研究提供实验和理论依据。第一部分食管鳞癌及其引流淋巴结组织中树突状细胞CD1a和CD83的表达及其临床意义目的:探讨肿瘤组织浸润树突状细胞（tumor infiltrating dendritic cell, TIDC）CD1a和CD83在食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）组织和引流淋巴结中的表达及其与ESCC临床病理特征的关系。方法:选取河北医科大学第四医院胸外科2002年5月至2003年12月间手术切除并经病理确诊的78例ESCC组织、24例正常食管黏膜、35例正常淋巴结和32例转移淋巴结组织石蜡标本,采用流式细胞术检测上述组织TIDC中CD1a和CD83表达。结果:ESCC组织中CD1a和CD83的表达水平明显低于正常食管黏膜组织（均P<0.05）。CD1a表达水平与ESCC患者的浸润深度、临床分期、分化程度及淋巴结转移无相关性（均P>0.05）;CD83表达水平与ESCC患者的临床分期及淋巴结转移有关（P<0.05）。转移淋巴结组织中CD1a表达水平与正常淋巴结组相比无显着性差异（P>0.05）;转移淋巴结组织中CD83表达水平显着低于正常淋巴结组织（P<0.05）。结论:食管鳞状细胞癌组织和引流淋巴结组织TIDC中CD83表达水平反映食管癌的局部免疫状态,成熟TIDC数量减少使DC的抗原提呈功能降低,机体对食管癌细胞识别能力减退,从而导致肿瘤免疫逃逸。本研究为阐明食管癌免疫逃逸机制和开展食管癌的免疫生物学治疗提供了理论和临床基础。第二部分食管癌患者外周血细胞诱导、培养树突状细胞的实验研究目的:探讨从食管癌患者外周血分离、诱导与扩增树突状细胞（DC）的有效方法。方法:采用密度梯度离心法从食管癌患者外周血分离单个核细胞,分别加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml）,（作为对照组）;GM-CSF（100ng /ml）+IL-4（50/ml）+flt-3L（40ng/ml） , （作为实验1组） ;第三组加入GM-CSF（100ng/ml）+IL-4（50ng/ml）+flt-3L（40ng/ml） +SCF（100ng/ml）,（作为实验2组）。于37℃、5%CO2环境下进行培养,动态观察细胞生长情况,流式细胞仪检测培养第六天时DC表面分子CD1a、CD83、CD80、CD86的表达水平。结果:上述不同刺激物均能从外周血单个核细胞成功诱导出DC,与对照组相比,实验组诱导出更多数量的DC,其中以实验2组最多;培养至第六天时,两实验组DC细胞表型CD1a表达率与对照组无明显差别（P>0.05）,CD83、CD80、CD86表达水平明显高于对照组（P<0.01）,其中以实验2组表达水平最高（P<0.01）。结论:联合应用GM-CSF、IL-4、flt-3L和SCF能有效的从食管癌患者外周血诱导培养出大量具有活性的DC,为进一步的临床应用研究奠定基础。第三部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫反应的体外实验研究目的:探讨食管癌细胞抗原致敏白介素-27（IL-27）基因修饰的树突状细胞（DC）体外诱导CTL杀伤食管癌细胞的效能及其机制。方法:采用重组逆转录病毒介导IL-27基因转染食管癌患者外周血DC;反复冻融法提取食管癌细胞裂解产物并致敏经IL-27转染的DC;用RT-PCR检测IL-27基因的表达;ELISA法检测各组DC培养上清中IL-27、IL-12、IFN-γ的水平和不同组别诱导产生的各组CTL培养上清中IFN-γ的水平;流式细胞术分析各组DC表面CD1a、CD83、CD80、CD86的表达;四甲基偶氮唑盐（MTT）实验检测各组DC刺激T细胞增殖活性和检测各组DC诱导细胞毒T细胞（CTL）杀伤食管癌细胞的效能。结果:成功建立了能分泌IL-27的DCIL-27细胞,经RT-PCR和ELISA证实该细胞在mRNA和蛋白水平均可稳定表达IL-27;经抗原致敏IL-27基因转染的DC(DCIL-27+Ag)高表达CD1a、CD83、CD80、CD86分子,表达水平分别为[（55.50±6.62）%,（82.67±7.92）%,（78.33±7.31）%和（85.33±4.32）%],并可分泌高水平IL-12（107.85±7.20）pg/ml、IL-27（430.39±10.12）pg/ml及IFN-γ（411.97±17.80）pg/ml,可明显刺激同源T细胞增殖,增强CTL上清中IFN-γ水平（751.50±31.30）pg/ml,显着高于其它组;诱导产生CTL对食管癌细胞有强大的杀伤作用,显着高于其它组。结论:表达IL-27基因的DCIL-27+Ag细胞可增强体外诱导自体T细胞产生特异性抗食管癌免疫,其作用机制可能与IL-27基因修饰和抗原致敏活化了DC的第二信号表达,促进DC高分泌IL-27、IL-12,活化T细胞致使CTL分泌IFN-γ能力增强密切相关。第四部分抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞激活特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响目的:研究食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰的DC活化特异性CTL对人食管癌裸鼠移植瘤生长的影响,研究其诱导细胞凋亡的作用机制。方法:构建人食管癌细胞裸鼠移植瘤模型,共30只裸鼠随机分为5组,每组6只,分别用PBS（I组）、初始T细胞（II组）、DCnaive+初始T细胞（III组）、DCIL-27+初始T细胞（Ⅳ组）和DCIL-27+Ag+初始T细胞（Ⅴ组）,于肿瘤周围注射,间隔4天,共治疗5次。观察荷瘤小鼠的肿瘤体积、瘤重和抑瘤率;TUNEL法检测五组荷瘤小鼠肿瘤组织细胞的原位凋亡;流式细胞术检测移植瘤细胞的细胞周期、凋亡率及凋亡相关蛋白Fas和Caspase-3的表达。结果:免疫接种第Ⅴ组细胞治疗的荷瘤小鼠移植瘤组织的体积和重量分别为（0.56±0.07）cm3、（0.68±0.04）g,明显小于其它治疗组和对照组,差异有显着性意义（P<0.01）;抑瘤率为58.28%,明显大于其它治疗组和对照组,差异有统计学意义（P<0.01）。TUNEL法检测结果显示,免疫接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠的肿瘤组织内凋亡细胞灶性分布,细胞核内有棕黄色颗粒,免疫接种第II、III、Ⅳ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织内可见少量凋亡细胞,I组仅见极少数散在分布的凋亡细胞。接种第Ⅴ组细胞荷瘤小鼠肿瘤组织中凋亡率明显高于其余接种组（P<0.01）。FCM分析结果显示,免疫接种第Ⅴ组细胞的荷瘤小鼠皮下肿瘤组织内细胞增殖指数为（23.92±1.60）%,显着低于其余接种组,差异有显着性意义（P<0.01）;而细胞凋亡率为（32.78±0.83）%,显着高于其余接种组,差异有显着性意义（P<0.01）;Fas和Caspase-3蛋白表达水平均明显高于其余接种组（P<0.01）。结论:食管癌细胞抗原致敏IL-27基因修饰DC可活化特异性CTL,在荷瘤小鼠体内对食管癌细胞具有强大细胞毒作用,显着抑制食管癌细胞体内增殖、促进其凋亡,为DC应用于食管癌的免疫治疗提供了理论和动物实验依据。
吴林[8]（2007）在《HPV-E6E7基因转染人树突状细胞抗食管癌体内外研究》文中研究表明目的：本研究旨在分离人脐带血来源的CD34+干细胞并在体外分化扩增为成熟的功能性树突状细胞（dendritic cell，DC）的过程，并以HPV16E6／18E7基因转染DC制备DC疫苗，检测其生物学特性；观察并测定其在体外诱导的细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxicity T lymphocyte，CTL）活性，同时观察其对经免疫重建的SCID小鼠体内食管癌生长的免疫防治效应。方法：1．应用质粒提取试剂盒提取pcDNA3.1-HPV16E6／18E7质粒，分光光度计检测其浓度和纯度，然后通过阳离子脂质体DMRIE-C将质粒DNA转入经rhGM-CSF、rhTNF-α体外联合诱导12天的人脐血来源CD34+干细胞，制备负载HPVl6E6／18E7基因的DC疫苗，倒置显微镜下观察并以流式细胞仪检测转染前、后其表面分子CD80、CD86、CD83及转染后E6／E7蛋白的表达情况。2．斑点杂交法测定食管癌细胞EC-109的HPV类型。3．体外抗肿瘤实验采用MTT法，检测HPV18E7-DC疫苗诱导的人外周血CTL对食管癌细胞EC-109的杀伤活性。4．HPV16E6／18E7-DC疫苗小鼠腹腔内注射2次，间隔3d，70d后检测疫苗是否具有致瘤性。5．按随机数字法将SCID小鼠随机分为免疫保护组和免疫治疗组。免疫保护组随机分成C、Im-T、Im-16D和Im-18D四小组，分别用PBS、T细胞、HPV16E6-DC+T细胞、HPV18E7-DC+T细胞免疫接种后，再接种EC-109细胞；免疫治疗组分成C、Tr-T、Tr-16D和Tr-18D四小组，分别以PBS、T细胞、HPV16E6-DC+T细胞和HPV18E7-DC+T细胞对EC-109荷瘤小鼠进行免疫治疗。以诱发小鼠肿瘤的潜伏期和肿瘤的体积、重量、生长速度等为观察指标，并进行统计学分析，以探讨HPV16E6／18E7-DC疫苗对食管癌细胞株EC-109体内生长的免疫保护和免疫治疗效应。结果：1.50ml脐带血可分离出CD34+干细胞约1.0×106，台盼蓝染色95％以上不显色；在rhGM-CSF和rhTNF-α联合诱导下，14天后CD34+干细胞约扩增10-20倍，DC的纯度达90％以上。CD34+干细胞在培养过程中逐渐形成细胞集落，集落逐目增多增大，并在第8-9天达到最大，此后集落逐渐减少变小，并脱落成具有典型树枝状突起的成熟DC。表面分子CD80、CD86、CD83表达阳性率分别为65.5％、65.9％和80.7％。HPV16E6／18E7基因转染后DC生长良好，流式细胞仪检测发现表面分子CDSO、CD86、CD83表达阳性率分别为81.6％、80.5％和86.6％，目的基因蛋白E6、E7表达率分别为38.6％和47.5％。2．斑点杂交法检测发现食管癌细胞EC-109的病毒类型为HPV18型。3．HPV18E7-DC疫苗致敏的外周血CTL对食管癌细胞EC-109的杀伤活性明显高于DC组致敏的CTL及T组和C组（P＜0.01），且随效靶比的增高而增强（P＜0.05）。DC致敏的CTL的杀伤活性与T组比较也有显着性差异（P＜0.05）。4．致瘤性研究显示腹腔注射HPV16E6／18E7-DC疫苗的小鼠均未发生肿瘤。5．在免疫保护组，Im-16D和Im-18D组肿瘤的生长速度减慢，肿瘤潜伏期较C组和Im-T组明显延长（P＜0.01），肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于C组和Im-T组（P＜0.01），Im-16D和Im-18D组比较差异无统计学意义（P＞0.05）；在免疫治疗组，Tr-16D和Tr-18D肿瘤体积和肿瘤重量均明显小于C组和Tr-T组（P＜0.01），Tr-16D和Tr-18D比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：1．以免疫磁珠法从人脐带血中分离CD34+干细胞，在体外经rhGM-CSF和rhTNF-α联合诱导14天，可分化扩增出大量高纯度、形态功能成熟的DC，此方法操作简便，分离细胞量大、纯度高，具有巨大的实用价值。2．使用阳离子脂质体将HPV-E6E7基因转入DC，细胞生长良好，并且目的基因在DC内高表达，说明DC疫苗构建成功，阳离子脂质体可以安全、有效的介导基因转入DC，为DC疫苗的构建做了有益探索。3．HPV18ET-DC疫苗在体外能诱导出高效的特异性CTL，对表达HPV18的食管癌EC-109细胞产生强大的特异性杀伤效应。4．HPVl6E6／18E7-DC疫苗无体内致瘤性，安全可靠。5．HPV16E6／18ET-DC疫苗能显着抵抗EC-109细胞对小鼠的攻击，并能显着抑制荷瘤小鼠体内肿瘤的生长，具有高效而显着的免疫保护和免疫治疗效应。
罗小玲[9]（2006）在《树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究》文中指出原发性肝癌（简称肝癌）是我国常见的恶性肿瘤，发病率呈上升趋势。近二十年来肝癌的疗效虽然有明显提高，但复发转移仍然严重阻碍着治疗效果的进一步提高，威胁着患者的生命。因此，预防和治疗肝癌复发转移的研究具有重大意义。肝癌的免疫治疗一直是研究的热点，树突状细胞（dendritic，DC）作为目前发现的功能最强大的专职抗原提呈细胞，具有独特的抗原提呈和激发功能，是免疫反应的核心和关键，在机体抗肿瘤免疫中发挥重要作用。本课题设想通过研究肝癌组织中浸润性树突状细胞（tumor infiltrating dendritic cell，TIDC）数量和表型变化及其临床意义，阐明DC与肝癌发生发展和预后的关系及作用机制；然后从肝癌患者外周血诱导扩增DC，制备负载肝癌抗原的DC瘤苗，观察其体内外抗肿瘤作用，并应用于临床对肝癌进行免疫治疗，旨在探讨一种DC介导的肝癌免疫治疗的有效手段。 第一部分，我们首先探讨了肝癌组织中DC浸润的数量及其临床意义。采用免疫组化方法和原位末端标记技术检测了60例原发性肝癌患者术后组织标本中DC标志蛋白S-100+DC、记忆性T淋巴细胞标志CD45RO分子、CD4+、CD8+T淋巴细胞浸润和增殖细胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）的表达以及肝癌细胞凋亡指数（apoptosis index，AI），分析肝癌组织中浸润DC数量变化及其临床意义，并分析DC浸润与CD45RO+T淋巴细胞浸润、肝癌细胞增殖和凋亡的相关性。结果显示，在60例肝癌组织中，DC浸润的数量范围为8～76个/10个HPF，平均数为（20.45±11.76）个/10个HPF。浸润DC的数量与年龄、肿瘤大小、AFP水平、HBV感染等因素无关；与肿瘤分化程度、门静脉癌栓形成有关。高分化肝癌中浸润DC的数量高于低分化肝癌；在无门静脉癌栓形成的肝癌组织中浸润DC的数量显着高于有门静脉癌栓的肝癌组织。多因素Cox Regression分析和Pearson相关分析表明DC浸润可影响预后，与术后无瘤生存期显着相关。DC高浸润组患者
路静[10]（2005）在《人B7-2瘤苗与DC瘤苗的制备及其体外联合诱导抗食管癌的免疫作用》文中研究指明研究背景 机体对肿瘤细胞的免疫排斥主要依赖于体内的T细胞,T细胞的激活需要两类信号:一类是特异的抗原提呈信号,另一类是非MHC（major histocompatibility complex,主要组织相容性复合体）限制的共刺激信号。若缺乏共刺激信号,则T细胞处于无能状态或凋亡。绝大多数肿瘤细胞不表达B7分子或仅弱表达是导致肿瘤细胞免疫逃逸的原因之一。利用B7分子进行免疫基因治疗,是肿瘤免疫基因治疗的一个重要研究方向。其中B7-2分子因其在抗原提呈细胞（antigen presenting cell,APC）上表达时间早、表达丰度高、易诱导表达,被认为在免疫应答起始阶段发挥重要作用。向肿瘤细胞导入B7分子,可增强肿瘤细胞免疫原性,激活T细胞,提高宿主抗瘤免疫。树突状细胞(（dendritic cell,DC）目前被认为是最有效的专职提呈抗原和激活初始或休止T细胞的APC,它高效表达MHCⅠ/Ⅱ、CD40及B7分子。DC激活的细胞免疫反应在肿瘤的生物治疗中起着十分重要的作用。 实验目的 构建人B7-2和绿色荧光蛋白真核表达载体,脂质体介导转染人食管癌细胞株EC9706,获得B7-2瘤苗;以EC9706的冻融抗原冲击脐血来源的DC,获得DC瘤苗;体外联合应用B7-2瘤苗、DC瘤苗观察其诱导抗食管癌细胞的免疫作用。 实验方法 1.绿色荧光真核表达载体pEGFP-N3-B7-2的构建
二、树突状细胞在食管癌T细胞抗肿瘤免疫中的作用（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、树突状细胞在食管癌T细胞抗肿瘤免疫中的作用（论文提纲范文）
（1）黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 黏蛋白1基因转染树突状细胞疫苗的制备 |
| 材料和方法 |
| 1.标本来源 |
| 2.材料及试剂 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1. MUC1在人乳腺癌组织中表达情况 |
| 2.MUC1在乳腺癌MCF7和MDA-MB-231细胞中的表达 |
| 3.过表达MUC1慢病毒质粒的构建结果 |
| 4.分离培养DC的形态学特征及表型分子表达 |
| 5.转染效率测定 |
| 6.MUC1-DC中MUC1 mRNA和蛋白的表达 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 MUC1-DC免疫功能的体外研究 |
| 材料和方法 |
| 1.试剂与仪器 |
| 2.实验方法 |
| 3.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.MCU1-DC诱导CTL条件的优化 |
| 2.MUC1-DC诱导CTL产生IL-12和TNF-ɑ的含量 |
| 3.MUC1-DC对CTL杀伤活性的影响 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 光学分子成像活体监测成瘤生长评价MUC1-DC对乳腺癌的免疫作用 |
| 材料和方法 |
| 1.动物来源 |
| 2.试剂与仪器 |
| 3.实验方法 |
| 4.统计学分析 |
| 结果 |
| 1.慢病毒转染条件优化 |
| 2.光学分子成像活体检测MUC1-DC对裸鼠乳腺癌移植瘤的抑制作用 |
| 3. MUC1-DC对裸鼠移植瘤体积和重量的影响 |
| 4.MUC1-DC对裸鼠移植瘤Caspase3表达的影响 |
| 5.TUNEL法检测裸鼠移植瘤中的细胞凋亡率 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 基因修饰的树突状细胞在抗肿瘤免疫中的应用 |
| 参考文献 |
| 附录 中英文缩略词表 |
| 博士在读期间发表文章 |
| 致谢 |
（2）食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究（论文提纲范文）
| 全文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 第一部分 食管癌中多核巨细胞的研究 |
| 第一章 食管癌组织中多核巨细胞的表达和极化类型研究 |
| 第二章 食管癌中多核巨细胞的表达与临床预后统计分析 |
| 第二部分 B细胞产生IgG4损伤机体的抗肿瘤免疫及对免疫治疗的启示 |
| 第一章 食管癌组织和血清中IgG4增加以及肿瘤相关免疫细胞的检测 |
| 第二章 IgG4亚类高表达病例免疫病理研究与探讨 |
| 第三章 IgG4亚类的结构和功能特点的研究 |
| 第四章 IgG4对单核巨噬细胞的极化影响的研究和探索 |
| 全文总结 |
| 综述:IgG4抑制肿瘤免疫的可能机制 |
| 参考文献 |
| 在读期间已发表的文章 |
（3）肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩略词 |
| 第一部分: 文献综述 |
| 综述一: 中医药调节肿瘤免疫应答防治肿瘤的研究进展 |
| 1 先天性免疫调节 |
| 2 适应性免疫调节 |
| 3 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二: 树突状细胞在肿瘤免疫和免疫治疗中的作用 |
| 1 树突状细胞亚群分类 |
| 2 肿瘤免疫中树突状细胞功能 |
| 3 肿瘤对树突状细胞功能的调节作用 |
| 4 肿瘤治疗中的树突状细胞功能 |
| 5 基于树突状细胞的肿瘤免疫疗法 |
| 6 抗肿瘤树突状细胞疫苗 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三: 桔梗皂苷D的抗肿瘤作用机制研究进展 |
| 1 调控肿瘤细胞凋亡途径 |
| 2 调控肿瘤细胞自噬 |
| 3 调控肿瘤细胞增殖 |
| 4 抑制血管生成 |
| 5 抑制肿瘤的侵袭和转移 |
| 6 体内抗肿瘤调控 |
| 7 免疫调节及降脂活性 |
| 8 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验研究 |
| 前言 |
| 实验一: 肿瘤相关树突状细胞的诱导培养 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验二: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状脂质及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验三: 毒胡萝卜素激活内质网应激对肿瘤相关树突状细胞中脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验四: 肺瘤平膏含药血清逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质及功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验五: 肺瘤平膏含药血清对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验六: 桔梗皂苷D对树突状细胞毒性和肿瘤细胞杀伤能力的研究 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验七: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞脂质含量及功能的调节作用 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验八: 桔梗皂苷D逆转毒胡萝卜素激活内质网应激对TDCs脂质含量和功能的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 实验九: 桔梗皂苷D对肿瘤相关树突状细胞BiP-IRE1α-XBP1通路和PI3K-AKT-mTOR通路的影响 |
| 1 材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 结语 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
| 参考文献 |
| 附件 |
（4）组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 前言 |
| 第一部分 食管癌TILs细胞亚群构成研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二部分 食管癌浸润CD8~+TRM细胞亚群、分布及表型特征研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料和方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三部分 食管癌浸润TRM细胞与肿瘤临床病理特征及预后相关性研究 |
| 1 引言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 组织特异性记忆T细胞在实体肿瘤免疫中的作用 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（5）小干扰RNA抑制树突瘤苗IL-10受体后对食管癌细胞免疫效应的作用和机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 符号说明 |
| 引言 |
| 第一部分 :IL-10R-siRNA DCs在局部淋巴结内的迁移能力的研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 主要试剂与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 人食管癌细胞荷瘤小鼠模型的制备 |
| 2.2 CFSE标记DCs |
| 2.3 分组及给药方法 |
| 2.4 取材 |
| 2.5 CFSE标记的DCs体内迁移的检测 |
| 2.6 统计分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 CFSE标记的DCs |
| 3.2 FCM检测引流淋巴结中CFSE阳性细胞率 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第二部分 :IL-10R-siRNA DCs对小鼠体内移植瘤抑制作用的研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞株 |
| 1.3 主要试剂与器材 |
| 2 方法 |
| 2.1 人食管癌细胞荷瘤小鼠模型的制备 |
| 2.2 分组、治疗、观察和取材 |
| 2.2.1 实验分组与治疗 |
| 2.2.2 观察治疗效果和组织取材 |
| 2.3 计算肿瘤抑制率 |
| 2.4 TUNEL原位细胞凋亡检测 |
| 2.4.1 检测步骤 |
| 2.4.2 结果判定 |
| 2.5 流式细胞仪检测肿瘤细胞凋亡变化 |
| 2.5.1 样本制备 |
| 2.5.2 移植瘤组织细胞周期分布及凋亡率分析 |
| 2.5.3 FCM检测移植瘤组织中Fas和 Caspase-3 蛋白表达 |
| 2.6 统计学处理 |
| 3 结果 |
| 3.1 IL-10R-siRNA DCs对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.1.1 经淋巴内注射途径回输 |
| 3.1.2 经皮下注射途径回输 |
| 3.1.3 经静脉注射途径回输 |
| 3.2 IL-10R-siRNA DCs对裸鼠移植瘤重量以及肿瘤抑制率的影响 |
| 3.2.1 经淋巴内注射途径回输 |
| 3.2.2 经皮下注射途径回输 |
| 3.2.3 经静脉注射途径回输 |
| 3.3 IL-10R-siRNA DCs对肿瘤组织细胞原位凋亡的影响 |
| 3.4 IL-10R-siRNA DCs对裸鼠人食管癌移植瘤细胞凋亡和生长周期的影响 |
| 3.4.1 经淋巴内注射途径回输 |
| 3.4.2 经皮下注射途径回输 |
| 3.4.3 经静脉注射途径回输 |
| 3.5 IL-10R-siRNA DCs对裸鼠人食管癌移植瘤组织中Fas、caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 3.5.1 经淋巴内注射途径回输 |
| 3.5.2 经皮下注射途径回输 |
| 3.5.3 经静脉注射途径回输 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 第三部分 :IL-10R-siRNA DCs最佳回输方式的研究 |
| 前言 |
| 1 材料 |
| 2 方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 三种回输途径注射IL-10R-siRNA DCs后裸鼠移植瘤体积变化 |
| 3.2 三种回输途径注射IL-10R-siRNA DCs对裸鼠移植瘤生长的抑制作用 |
| 3.3 三种回输途径注射IL-10R-siRNA DCs对肿瘤组织细胞原位凋亡的影响 |
| 3.4 三种回输途径注射IL-10R-siRNA DCs对移植瘤细胞生长周期及凋亡的影响 |
| 3.5 三种回输途径注射IL-10R-siRNA DCs对裸鼠人食管癌移植瘤组织中Fas、caspase-3 蛋白表达的影响 |
| 4 讨论 |
| 5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 文献综述 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要成果 |
（6）胃癌肿瘤微环境内肿瘤浸润淋巴细胞和三级淋巴结构的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 引言 |
| 参考文献 |
| 第一部分 肿瘤浸润淋巴细胞在胃癌中的浸润与胃癌患者临床病理参数和预后的关系 |
| 一 材料与方法 |
| 1.主要试剂、材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.胃癌组织中TIL组织学评分 |
| 4.随访方法 |
| 5.统计分析 |
| 二 结果 |
| 1.TIL浸润的病理形态学特征 |
| 2.TIL浸润与胃癌患者临床病理参数的关系 |
| 3.TIL浸润与胃癌患者总生存期的关系 |
| 4.Cox回归模型分析肿瘤独立性预后因素 |
| 5.列线图(nomogram模型)预测胃癌患者总生存期 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 三级淋巴结构在胃癌中的表达与胃癌患者临床病理参数和预后的关系 |
| 一 材料与方法 |
| 1.主要试剂、材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.胃癌组织中TLS组织学评分 |
| 4.随访方法 |
| 5.统计分析 |
| 二 结果 |
| 1.TLS表达与胃癌患者临床病理参数的关系 |
| 2.TLS表达与胃癌患者总生存期的关系 |
| 3.Cox回归模型分析肿瘤独立性预后因素 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 第三部分 联合亚组分析TIL和 TLS与胃癌患者预后的关系 |
| 一 材料与方法 |
| 1.主要试剂、材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.胃癌组织中TIL和 TLS的组织学评分 |
| 4.随访方法 |
| 5.统计分析 |
| 二 结果 |
| 1.TIL和 TLS在胃癌组织中的相关性 |
| 2.TIL-TLS表达与临床病理参数的关系 |
| 3.TIL-TLS表达与胃癌患者总生存期的关系 |
| 4.Cox回归模型分析肿瘤独立性预后因素 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 第四部分 肿瘤微环境内淋巴细胞亚型分析 |
| 一 材料与方法 |
| 1.主要试剂、材料 |
| 2.实验方法 |
| 3.切片评分 |
| 4.随访方法 |
| 5.统计分析 |
| 二 结果 |
| 1.TIL和 TLS在本组病例中的表达情况 |
| 2.MECA79 在胃癌中表达情况及与TLS组织学评分的关系 |
| 3.CD3~+T 细胞在胃癌组织中的表达及与TIL组织学评分的关系 |
| 4.免疫浸润参数与胃癌患者总生存期的关系 |
| 三 讨论 |
| 四 结论 |
| 参考文献 |
| 综述一 肿瘤浸润淋巴细胞研究的新进展 |
| 参考文献 |
| 综述二 三级淋巴结构及其机制研究的新进展 |
| 参考文献 |
| 附录二 缩略词表 |
| 攻读博士期间发表的文章 |
| 致谢 |
（7）白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 英文缩写 |
| 研究论文 白细胞介素27 基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究 |
| 引言 |
| 第一部分 食管鳞状细胞癌及其引流淋巴结组织中树突状细胞CD1a和 CD83的表达及其临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 从食管癌患者外周血单个核细胞诱导树突状细胞的实验研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞诱导抗食管癌免疫的体外研究 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第四部分 抗原致敏IL-27基因修饰的树突状细胞活化的特异性CTL对人食管癌细胞裸鼠移植瘤生长的影响 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 附图 |
| 附表 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 综述一 |
| 综述二 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）HPV-E6E7基因转染人树突状细胞抗食管癌体内外研究（论文提纲范文）
| 英文缩略词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 一.主要仪器设备 |
| 二.主要材料和试剂配制 |
| 第一部分 人脐带血树突状细胞的分离扩增 |
| 一.人脐血CD34~+干细胞的分离纯化 |
| 二.CD34~+干细胞的体外扩增培养 |
| 三.树突状细胞的鉴定 |
| 第二部分 HPV16E6/18E7基因转染成熟的树突状细胞 |
| 一.pcDNA3.1-HPV16E6/18E7重组质粒的提取 |
| 二.HPV16E6/18E7基因转染树突状细胞 |
| 三.转染效果的鉴定 |
| 第三部分 肿瘤细胞培养及T淋巴细胞的分离纯化 |
| 一.肿瘤细胞培养 |
| 二.人T淋巴细胞的分离纯化 |
| 第四部分 负载HPV-E6E7基因树突状细胞疫苗抗食管癌研究 |
| 一.斑点杂交法检测EC-109细胞的HPV病毒类型 |
| 二.体外抗食管癌研究 |
| 三.HPV16E6/18E7-DC疫苗的体内致瘤性研究 |
| 四.体内抗食管癌研究 |
| 五.统计学处理 |
| 结果 |
| 一、人脐带血CD34~+干细胞的分离纯化、扩增培养及DC的生物学鉴定 |
| 二、HPV16E6/18E7-DC疫苗的表面分子及6E、E7蛋白的表达情况 |
| 三、体外抗肿瘤实验 |
| 四、HPV16E6/18E7-DC疫苗的体内致瘤性研究 |
| 五、体内抗肿瘤研究 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 附图 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 综述:树突状细胞疫苗抗食管癌研究进展 |
（9）树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究（论文提纲范文）
| 缩写词 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 1 前言 |
| 第一部分：肿瘤浸润性树突状细胞的数量和表型变化与原发性肝癌发生发展和预后关系的研究 |
| 1 人肝癌组织中浸润性树突状细胞的数量变化及其临床意义 |
| 2 人肝癌组织中浸润性树突状细胞的表型变化和原因分析 |
| 3 肝癌细胞培养上清对人外周血来源树突状细胞分化发育的影响 |
| 第二部分：体外诱导肝癌患者外周血树突状细胞及其抗肿瘤作用 |
| 1 肝癌患者外周血树突状细胞的诱导扩增及其免疫学功能研究 |
| 2 负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗增强CD_3AK细胞的抗肿瘤作用 |
| 3 负载肝癌抗原的树突状细胞瘤苗诱导的抗肿瘤免疫效应 |
| 第三部分：负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗诱导的体内抗肿瘤作用研究 |
| 1 负载肝癌抗原树突状细胞瘤菌免疫小鼠诱导的免疫保护作用 |
| 2 负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗对荷瘤小鼠的治疗作用 |
| 第四部分：负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗治疗原发性肝癌的临床研究 |
| 1 负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗的临床前质量控制研究 |
| 2 应用负载肝癌抗原树突状细胞瘤苗治疗原发性肝癌的临床研究 |
| (1) 肝动脉化疗栓塞(TACE)联合DC激活的CD_3AK细胞治疗不能行手术切除的中晚期原发性肝癌疗效观察 |
| (2) 应用负载肝癌抗原DC瘤苗预防原发性肝癌术后复发转移研究 |
| 全文总结 |
| 本研究的创新点及意义 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 1 肿瘤浸润性树突状细胞的研究进展 |
| 2 以树突状细胞为基础的肝癌免疫基因治疗研究进展 |
| 在读期间发表的相关论文 |
| 致谢 |
（10）人B7-2瘤苗与DC瘤苗的制备及其体外联合诱导抗食管癌的免疫作用（论文提纲范文）
| 论文 |
| 人B7-2瘤苗与DC瘤苗的制备及其体外联合诱导抗食管癌的免疫作用 |
| 引言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| B7/CD28共刺激信号系统及其在肿瘤免疫中的作用 |
| 参考文献 |
| 缩略语 |
| 硕士期间发表的论文 |
| 致谢 |
四、树突状细胞在食管癌T细胞抗肿瘤免疫中的作用（论文参考文献）
- [1]黏蛋白1基因转染树突状细胞对乳腺癌免疫作用及光学分子成像评价疗效的实验研究[D]. 尹良伟. 大连医科大学, 2021(01)
- [2]食管癌肿瘤微环境中多核巨细胞和IgG4阳性B细胞的研究[D]. 王慧. 汕头大学, 2020(01)
- [3]肺瘤平膏及其有效组分通过调控脂质代谢逆转肿瘤相关树突状细胞功能的机制研究[D]. 张曦文. 中国中医科学院, 2020(01)
- [4]组织特异性记忆T细胞在食管癌中的表达及对肿瘤微环境和食管癌患者预后的影响[D]. 程纪伟. 郑州大学, 2020(02)
- [5]小干扰RNA抑制树突瘤苗IL-10受体后对食管癌细胞免疫效应的作用和机制研究[D]. 脱广鑫. 甘肃中医药大学, 2020(11)
- [6]胃癌肿瘤微环境内肿瘤浸润淋巴细胞和三级淋巴结构的研究[D]. 张大川. 苏州大学, 2018(06)
- [7]白细胞介素27基因转染食管癌患者树突状细胞的抗肿瘤效应及其机理研究[D]. 王雷. 河北医科大学, 2010(01)
- [8]HPV-E6E7基因转染人树突状细胞抗食管癌体内外研究[D]. 吴林. 汕头大学, 2007(02)
- [9]树突状细胞介导肝癌免疫治疗的实验与临床研究[D]. 罗小玲. 广西医科大学, 2006(02)
- [10]人B7-2瘤苗与DC瘤苗的制备及其体外联合诱导抗食管癌的免疫作用[D]. 路静. 郑州大学, 2005(08)