一、版纳小型猪近交系心脏的异种移植解剖学观察（论文文献综述）
信吉阁[1]（2014）在《利用TALENs技术高效制备GGTA1基因敲除近交小型猪的研究》文中研究说明近交小型猪是理想的异种器官移植的供体，具有清楚的遗传背景，高度的纯合性和近交耐受性。猪-灵长类异种器官移植存在由1，3半乳糖（Galactose-1，3-galactose，Gal-1，3Gal，或Gal）异种抗原引起的超急性排斥反应（Hyperacuterejection，HAR），是异种器官移植的主要障碍。敲除合成Gal-1，3Gal的1，3半乳糖基转移酶基因（-1，3-galactosyltransferase，GGTA1）是解决HAR的第一步。尽管先前的研究已利用传统同源重组（Homologous recombination，HR）和体细胞核移植（Somatic cell nuclear transfer，SCNT）的方法获得GGTA1基因敲除猪（Gene knockout，KO），但效率低，且由于繁殖力低和所用猪种不能克服近交衰退等原因，不能通过育种方式实现基因修饰动物大规模的扩繁。转录激活因子样效应核酸酶技术（Transcription Activator-like （TAL） Effector Nucleases，TALENs）是近年来发展起来的靶向基因敲除技术，与锌指核酸酶技术（Zinc-finger nuclease，ZFNs）作用原理类似，TALENs能在特定靶序列上介导DNA双链断裂，引起移码突变，高效率地在特定的靶位点沉默基因表达。TALENs技术在特异性、灵活性和低毒性等多方面都优于ZFNs技术，且实验操作简单，更易获得。TALENs已成功地应用于多种动物类型，但目前利用TALENs技术获得基因打靶猪的研究报道不多。尽管高效的基因修饰技术极大地提高了细胞水平上进行基因修饰的效率，但猪的体细胞克隆效率低，克隆动物易出现出生体重异常，器官缺陷，先天疾病等问题，不易通过克隆技术获得大规模数量的克隆猪，又由于之前所用猪种不能克服近交衰退，无法通过育种方式进行有效的扩群。因近交动物具有清楚的遗传背景、高度的纯合性和近交耐受性，而利用近交动物的细胞为供体细胞，经SCNT获得稳定的基因修饰动物后，可通过连续的近交扩大种群数量，避免采用普通实验动物所面临的近交衰退现象，为建立起稳定可靠的基因修饰猪品系研究奠定基础。在本研究中，从版纳微型猪近交系（Banna Mini-pig Inbred Line，BMI）的JS151家系获得7个妊娠35d胎儿，分离猪胎儿成纤维细胞（Porcine fetal fibroblastsPFFs），利用SRY-PCR法鉴定猪胎儿性别。针对GGTA1基因的外显子6，设计构建了2对TALENs，即TALENs Set1#和TALENs Set2#，为了检测TALENs的打靶效率，经体外转录的获得TALENs mRNA，显微注射到1细胞期的猪孤雌激活胚胎。在检测的孤雌激活囊胚中，TALENs Set1#在GGTA1靶位点插入/缺失突变的效率高达73.1%（19/26）。将TALENs质粒对与带有新霉素基因neo的质粒pcDNA3.1共转染BMI雌性胎儿成纤维细胞。经8-10d的筛选，在获得细胞克隆中，TALENs Set1#打靶效率达到89.5%（187/209）。值得注意的是，有27.8%（58/209）的细胞克隆是双等位基因敲除。5株基因双敲的细胞株作为核移植的供体进行SCNT，获得了3头GGTA1基因双敲除的雌性小型猪。经检测3头猪的细胞表面Gal表位完全缺失。GGTA1基因敲除猪的成纤维细胞比野生型猪的细胞在含补体的正常人血清中具有更高的溶解耐受性。在已获得GGTA1KO的版纳微型猪近交系母猪的研究基础上，为了能通过育种方式扩大纯合GGTA1基因敲除猪的数量，下一步研究是构建GGTA1KO公猪。选择BMI的雌性胎儿成纤维细胞为供体，进行TALENs转染和筛选，细胞水平上GGTA1基因敲除效率为72.5%，构建重构胚后经SCNT移植到6头受体母猪，检测到2头怀孕，其中一头受体在妊娠79d流产1头GGTA1基因敲除公猪，另1头受体母猪生产了1头GGTA1基因敲除公猪。利用获得的GGTA1KO公猪和母猪，为下一步通过连续的近交方式扩大种群研究奠定了基础。本研究利用TALENs技术结合体细胞核移植技术能高效直接地获得GGTA1基因敲除猪。在本研究中获得的带有近交特征的小型猪为异种器官移植研究奠定了技术基础。
岳敏[2]（2014）在《西藏小型猪生长相关基因的研究》文中研究表明动物的生长是一个复杂的生理过程,受到体内外多种因素的影响。包括动物的品种及性别、营养水平、生活环境、母体效应等。多种因素最终通过神经内分泌的整合、调控而发挥作用,其中调控关键的是由生长激素释放激素-生长激素-胰岛素样生长因子构成的神经内分泌生长轴。神经内分泌生长轴主要包括生长激素释放激素、生长抑素、生长激素、胰岛素样生长因子以及这些激素的受体、结合蛋白。哺乳动物在体内外各种因素的刺激下,下丘脑开始分泌生长激素释放激素,同时也释放生长抑素,生长激素的分泌受到生长激素释放激素和生长抑素的双重控制,即生长激素释放激素刺激生长激素的分泌,而生长抑素抑制生长激素的分泌。生长激素分泌后与生长激素结合蛋白结合经血液循环运输到体内各组织器官,与靶器官上的生长激素受体结合,启动细胞内的信号转导机制,促进胰岛素样生长因子-1的表达。胰岛素样生长因子-1主要由肝脏合成后释放到血液中,再与胰岛素样生长因子结合蛋白结合运输至动物体内的多种组织,促进蛋白质的合成,促进细胞增殖,从而促进哺乳动物以骨骼肌为主的生长。生长激素还作用于肝外组织,使之分泌胰岛素样生长因子,发挥自分泌或旁分泌作用。生长激素在胰岛素样生长因子-1的介导下发挥其促生长作用,一定范围内肝脏中的胰岛素样生长因子-1的分泌随血液中生长激素含量的升高而升高;当血液中的胰岛素样生长因子-1含量超过一定浓度,则会反馈抑制垂体中生长激素的表达,促进下丘脑中生长抑素的分泌,在下丘脑和垂体双重水平上抑制生长激素的合成与分泌。小型猪在分类学上与普通家猪相同,同属于哺乳纲,偶蹄目,不反刍目,野猪科,猪属动物。由于猪和人体在解剖、生理学方面很相似,1700年英国人JohnAuther就曾提出可用猪作为人的循环系统等研究的模型。但家猪体型过大（有些品种成年体重在400kg以上）,使用起来非常不方便。早在二十世纪50年代美国就开始选育适于实验用的小型猪。育成的小型猪在解剖结构、生理学方面和家猪相同,但体型较小,便于科学实验。目前小型猪在生物医学等领域中亦得到了广泛的应用。尤其是在心血管系统疾病、消化系统疾病、内分泌系统疾病、皮肤疾病的研究方面,以及异种器官移植、医疗器械的检测、药物动态代谢的方面,小型猪都是很有利用价值的实验动物。猪齿的牙质和齿像的构造也和人相似,可用于牙科医学实验。我国具有独特而又丰富的小型猪资源,它们在原产地均为长期近亲交配形成的封闭群体,具有体型小、遗传稳定等特点,与国外的多品种杂交小型猪相比,具有明显的优势。以特有小型猪资源为基础,进行封闭繁育,不仅保存了珍贵的品种资源,而且使品种遗传及表型特征更加稳定,更加符合生命科学研究的要求,达到了保种与选育的双重目的。这是我国具有独特的小型猪资源所带来的无可比拟的优势。我国的小型猪品种有:西藏小型猪、五指山小型猪、版纳微型猪、贵州小香猪、广西巴马小型猪和滇南小耳猪等。其中五指山小型猪、版纳小型猪和广西巴马小型猪的生长相关基因已经有人进行了研究,西藏小型猪与生长相关的基因研究较少。西藏小型猪,来源于青藏高原、海拔2500-4300米的农区和半农牧区,是唯一能够适应高海拔气候和以放牧为主的猪种,封闭的地理环境使西藏小型猪保存了非常纯正的品种资源。本课题组于2004年将西藏小型猪从西藏引进至广州,目前已完成风土驯化及实验动物化研究,并开展了相关动物模型、药物实验及转基因克隆等研究。从免疫学、遗传学研究发现,该品系具有独特的免疫相关指标和遗传特征,加上其独特的外形,是一种优良的实验用小型猪品种。西藏小型猪成年体重仅有25-40kg,是正常肉用猪体重的15-20%。本实验就是对西藏小型猪的生长相关性基因GH、GHR、IGF-1基因进行了系统的研究,为西藏小型猪的小体型提供分子理论和实验依据,为进一步“微型化”群体的培育打下基础。本论文研究中:（1）采用了 PCR产物测序的方法进行GH、GHR基因的分型及SNP位点的寻找,并进行不同基因型的部分生长性状比较分析。结果显示:GH基因在检测区域中发现有5个突变位点,分别为A12G、T45C、G84A、G93A、C133T。而GHR基因在检测区域则未发现突变位点。GH基因,T45C突变位点上TC基因型的西藏小型猪的6-8月龄的腹围值较小,G84A突变位点上AA型的西藏小型猪的3-5月龄的体重、体长值较小,G93A突变位点上GG基因型的西藏小型猪的6-8月龄的体长、体高值较小。我们推测在GH基因T45C、G84A、G93A位点突变的TC、AA、GG基因型可能与体型较小有关。（2）克隆得到了西藏小型猪GHR、IGF-1基因的cDNA序列。结果发现:西藏小型猪GHR基因的片段长1912bp,包含编码区1721bp,该编码区编码了572个氨基酸,与版纳微型猪（JF276446.1）、五指山小型猪（DQ422962.1）的GHR基因高度同源达99%。将西藏小型猪GHR基因的编码区与GenBank中搜索到猪的GHR基因（NM214254.2）的cDNA序列进行比对分析发现,在1225pb处发生了T→G的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,由丝氨酸变成了丙氨酸;与五指山猪GHR基因的cDNA序列进行比对分析发现,在1248bp、1287bp处分别发生了G→A的突变,但该位点的突变并未引起相应编码氨基酸的改变;与版纳微型猪相比,在1656bp处发生了T→C的突变,该位点的突变也未引起相应编码氨基酸的变化。所获得的西藏小型猪IGF-1基因的片段包含编码区567bp,该编码区编码了186个氨基酸,与猪（NM214256.1）的IGF-1基因高度同源达99%。将西藏小型猪IGF-1基因的编码区与GenBank中搜索到猪的IGF-1基因的cDNA序列进行比对分析发现,在440bp、455pb处发生了G→A、C→T的突变,该位点的突变引起相应编码氨基酸的变化,分别由组氨酸变成了精氨酸、亮氨酸转变成了丝氨酸。具体该位点的突变是否导致蛋白质功能的改变有待于进一步研究。（3）通过实时的荧光定量PCR技术,对西藏小型猪0岁（1日龄）、0.1岁（36日龄）、0.25岁（90日龄）、0.5岁（180日龄）、1岁（360日龄）、2岁（720日龄）、3岁（1080日龄）的心、肝、脾、肺、肾、肌肉、皮肤组织的GH、GHR和IGF-1基因进行相对表达量的测定分析,从而明确GH、GHR和IGF-1基因在西藏小型猪不同年龄阶段和不同脏器中的表达情况。结果显示:在不同脏器的表达中,GH基因在0岁、0.25岁、0.5岁、1岁表达量最低都是肌肉,在0岁、0.5岁时在皮肤中的表达量最高,在0.25岁、1岁时在肺组织中表达量最高,在0.1岁、3岁时表达量最高的是肝脏。GHR基因在0.25、0.5、1、2、3岁的肌肉组织中表达量最低,在0、0.1岁时心脏组织的表达量最低,在1、2岁时表达量最高的是肺,在0、0.25岁的肾脏组织中表达量最高。IGF-1基因在0、0.25、0.5、1、2岁时肌肉组织的表达量最低,在0、0.25、0.5岁时皮肤组织中表达量最高,在0.1、2、3岁时肝脏组织的表达量最高。在不同年龄阶段的表达中,GH和GHR基因在0.1岁时达到峰值,而IGF-1基因在0.25岁时达到峰值。所以西藏小型猪的生长相关基因的表达呈现出明显的时空特异性。（4）构建了西藏小型猪GHR基因的真核表达载体GHR-pIRES2-EGFP转染到西藏小型猪胚胎成纤维细胞中,采用相对定量RT-PCR方法检测IGF-1基因的表达,结果发现:转染了西藏小型猪生长激素受体的西藏小型猪的胚胎成纤维细胞内的胰岛素样生长因子-1出现了表达上调的现象。
王淑燕,霍金龙,潘伟荣,施晨,曾养志[3]（2014）在《版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析》文中研究说明目的获得版纳微型猪近交系（BMI）生长激素受体基因（GHR）序列,通过生物信息学分析预测GHR功能并进行GHR mRNA多组织表达谱分析。方法以版纳微型猪近交系的肝脏组织为材料提取RNA,RTPCR方法扩增GHR基因编码区序列,将序列连接至pMD18-T载体进行克隆、测序和生物信息学分析;半定量PCR检测GHR mRNA在BMI不同组织中表达量的差异。结果克隆出了BMI GHR编码区序列,提交GenBank获得登录号KC999114。该基因CDS长1917 bp,编码638个氨基酸。生物信息学分析表明,与长白猪的GHR序列相比BMI存在4处氨基酸替换,分别为p.E381D、p.A409S、p.L556V和p.A580G,均发生在胞内域。GHR基因多组织表达谱分析显示:GHR mRNA几乎在各组织中均有表达,在肌肉中表达量最高,在小肠、心、肝、神经纤维、脾、卵巢中表达量较高,在肺、胃、大脑、胰和肾中的表达量较低。结论成功克隆了版纳微型猪近交系GHR全长编码区序列,进行了生物信息学功能分析和组织表达谱分析,为进一步阐明版纳微型猪近交系生长矮小机理奠定了基础。
马雷,汤球,刘志学,余琛琳,崔淑芳[4]（2011）在《小型猪腹壁拉链模型的建立》文中研究说明目的建立小型猪腹壁拉链模型并对其生物学特性进行研究,为教学和科研工作的开展提供便利的研究工具。方法通过外科手术的方法将定制的生物拉链固定于小型猪体表,建立小型猪腹壁拉链模型,观察小型猪的体征和精神状态,利用全自动血液分析仪及尿液分析仪对其血液和尿液生化指标进行动态检测。结果模型建立后7～49 d小型猪的活动、精神状态良好,其生理生化指标表现稳定,与对照相比无显着变化。结论本课题组建立的小型猪腹壁拉链模型建立后7～49 d体征、精神状况良好,生理生化指标稳定,可以推广应用于相关的科研、教学试验。
陈学习,赵晓梅[5]（2010）在《小型猪动物模型在医药学领域的研究应用与思考》文中认为实验用小型猪在我国具有丰富而又独特的资源,它们在原产地均为长期近亲交配形成的封闭群体,如贵州、西双版纳、巴马、五指山及西藏等地区均有选育各具特色的小型猪品系。自20世纪70年代末以来得到较好的开发利用,并有望取代实验猴、犬等实验动物,为生命科学研究提供完善的比较参照系统及丰富的基因类型。现就中国实验用小型猪在医药学领域的研究、应用现状进行初步探讨。
冯书堂[6]（2010）在《遗传资源创新是我国地方猪种保存和利用的重要途径——记我国近交系小型猪培育、利用20年》文中研究说明近交系实验动物基因高度纯合,能象物理学研究中的精密仪器和化学反应中的分析纯试剂那样,为生物医学及生命科学研究提供灵敏的、偏差极小的实验结果。为满足人类生
靳二辉[7]（2008）在《近交系五指山小型猪解剖组织学研究及内源性反转录病毒（PERV）的检测》文中提出五指山猪是我国特有的地方猪种之一,原产于偏僻边远的海南省五指山地区,上世纪80年代引种到北京畜牧兽医研究所,经20多年近交繁育,目前,已培育成近交系数高达0.979的小型猪群体,成年体重仅为30 kg-35kg。近交系五指山小型猪以其体型矮小、遗传稳定、近交程度高等诸多优点,广泛应用于生物医学的各研究领域,成为人类疾病研究理想的动物模型,并列为我国异种器官移植的首选猪种。然而,近些年来,PERV可以在体外感染人细胞的研究发现对猪用于人类异种器官移植的安全性提出了质疑,筛选无PERV的猪用于异种移植变得非常重要。为此,本研究以近交16代的五指山小型猪为研究对象,对其消化系统、泌尿系统和心脏的解剖结构,心脏、肝脏、肾脏、免疫系统和部分生长轴器官的显微和超微结构进行了观察研究,并对其15种组织的PERV-RNA的表达情况进行了检测,主要研究结果如下:1近交系五指山小型猪消化、泌尿器官及心脏的解剖学研究本试验通过大体解剖学方法对近交系五指山小型猪消化、泌尿器官及心脏的解剖特点进行观察,结果显示:近交系五指山小型猪前臼齿发育一般较晚,胃外观呈“V”形,小肠和大肠较其它猪种短,肝脏呈圆角梯形。肾前端较后端钝圆,后端距正中线较远,部分五指山小型猪有两条肾动脉入。肾,膀胱没有明显的膀胱三角。从2-12月龄,心脏横径变化较大,右心耳与腔静脉窦之间界嵴不发达,冠状窦口处没有瓣膜,奇静脉直接开口于此。与人类的相比,舌上叶状乳头发达,轮廓乳头较少,胃贲门和幽门相距较近,空肠和回肠较长,盲肠粗大,结肠形成结肠圆锥;肾脏、膀胱大体形态和位置与人类的相比基本相似,而肝脏和胰腺的形态与人类的相比差异较大。12月龄心脏的重量、体积等解剖常数较成人类的小,左右肺静脉直径较小,前后腔静脉管径一致。这些结构特点表明,近交系五指山小型猪消化系统与人类的相比差异较大,其用于异种器官移植存在解剖学上的困难。而心脏和肾脏与人类的相比较为接近,适用于异种器官移植。2近交系五指山小型猪免疫器官的组织学观察为给近交系五指山小型猪用于建立人类免疫相关疾病模型提供基础形态学方面的资料,本试验采用石蜡切片和HE染色对其免疫器官的组织特点进行观察研究。结果显示:从出生到性成熟,胸腺实质内处于分裂期胸腺细胞和成熟胸腺细胞的数量均增多,胸腺小体的数量也增多。成年时,胸腺细胞数量减少,排列疏松,胸腺小体和胸腺上皮细胞均减少。2月龄时胸腺小体周围可见许多大小不同的空泡状细胞和变形细胞碎片。脾白髓动脉周围淋巴鞘和脾小结在4月龄前也随年龄增长而逐渐增多增大,但12月龄时有所减少并维持在一定水平,其变化与大鼠和鸡的基本一致。2月龄时,淋巴结皮质在内,髓质在外,4月龄时两者分界不明显。与2和4月龄相比,12月龄淋巴小结较大,淋巴细胞排列疏松,髓质内淋巴细胞较少,毛细血管增多。从整体上观察,免疫器官的组织学结构与人和其它哺乳动物之间没有明显的差异。3近交系五指山小型猪心、肝、肾显微和超微结构研究心、肝和肾移植在同种和异种器官移植中都具有重要的地位和作用,研究这3种器官的结构特点对其应用于移植具有重要的意义。本试验通过显微和超微组织学技术对近交系五指山小型猪心、肝和肾的形态特征进行研究,结果表明,2月龄小型猪这些器官结构还没有发育完全,4月龄小型猪各结构非常明显,正处于旺盛的发育期。但从整体角度观察,12月龄时,心室壁、肝脏和肾脏的组织学结构以及心室肌、肝脏和肾皮质的超微结构与人类的最为相近,适合作为异种移植的器官供体。4近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的形态学研究近交系五指山小型猪脑垂体位于成形的垂体窝内,腺垂体包绕神经垂体,中间部较狭窄,其内滤泡样结构不明显,腺垂体促性腺激素细胞分泌颗粒最大,促肾上促肾上腺皮质激素细胞分泌颗粒最小,神经垂体轴突内分泌颗粒较少,赫令体不明显。甲状腺腺泡随年龄的增长逐渐增大,腺泡上皮细胞微绒毛不发达,腺泡旁细胞有高电子密度和低电子密度两种。胰腺腺泡排列紧密,腺泡间结缔组织不发达,胰岛周围没有结缔组织包绕,相邻腺泡细胞侧面有连接复合体,胞质内充满大而圆的酶原颗粒,泡心细胞较大,部分呈立方形,腺泡间毛细血管可见立方形的胞核。以上结果表明,近交系五指山小型猪脑垂体、甲状腺和胰腺解剖组织学和超微结构与人类和其他哺乳动物的有一定差异。5近交系五指山小型猪PERV的检测采用RT-PCR技术对近交系五指山小型猪15种组织内PERV的表达情况进行了检测,发现PERV在心脏组织中几乎没有表达,在肝脏、肾脏和脑组织中的表达量较低,在免疫、生殖和内分泌组织中普遍存在,尤其在免疫组织中表达量较高,这表明PERv对免疫系统有较强的感染力。
袁建房[8]（2008）在《版纳微型猪近交系动物瘢痕模型的建立（实验Ⅰ）》文中认为[目的]探讨不同创伤因素对版纳微型猪近交系背部增生性瘢痕形成的影响,为瘢痕研究提供准确、实用、经济、可重复的动物模型。[方法]在版纳微型猪近交系背部皮肤上制作4×4cm皮肤全层切割伤、Ⅲ°烧伤创面。每间隔3天用数码相机对创面愈合及瘢痕增生程度照相。肉眼观察不同大小、不同致伤原因所致创面愈合状况及瘢痕形成情况。记录创面上皮化时间,及瘢痕的色泽、质地、充血等情况,切取标本制作石蜡切片分别作HE染色光学显微镜观察成纤维细胞数量及胶原排列情况,用免疫组化法染色各期标本组织中Ⅰ、Ⅲ型胶原含量及比例,染色结果计算机图像定量分析。[结果]切割伤创面在20天左右愈合,创面未见增生块。烧伤创面在30天左右自行脱痂,创面收缩不明显,创面逐渐上皮化（自脱痂至上皮化平均时长约7天）,上皮化时即可触及略高于皮面的硬结,呈粉红色,触之质韧,增生块外形不规则,增生范围不超过原创缘。此硬结随着时间推移逐渐增高,到上皮化后两周最为明显,以后逐渐消退变平,增生块高于正常皮肤持续时间约2个月,持续观察4个月后瘢痕仍呈现淡红色,间夹杂黑色斑纹,质地变软,范围缩小。HE染色可见胶原纤维增生明显,排列不规则,形成漩涡状或结节状结构,免疫组化染色Ⅰ型胶原约占74%,Ⅲ型胶原约占26%,与人类HS临床病理学相似,二者差异无显着性（P＞0.05）。[结论]版纳微型猪近交系背部皮肤Ⅲ度烧伤建立外观和生化特点与人增生性瘢痕相似的增生性瘢痕实验动物模型是可行的。虽然BMI动物瘢痕模型还有待改进,但却是一个系统地研究增生性瘢痕时实用的、可重复的、经济的实验动物模型。
靳二辉,杨述林,冯书堂,彭克美,李奎[9]（2007）在《实验用小型猪在比较医学中的研究应用与发展》文中提出
王建东[10]（2007）在《恒河猴凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ的遗传分子研究》文中指出恒河猴在形态学、生理生化特性和代谢方面与人类非常相似，其遗传基因与人类也有近98％的同源性。应用恒河猴猴进行实验研究的结果，容易推广于人类，因此早已作为生物医学领域研究的理想实验动物。近年来，随着器官移植中同种供器官源短缺问题的日益严重，异种器官移植又重新引起了人们的重视。肝脏是机体最主要的生物合成器官，其合成的凝血因子在维持机体血液循环中发挥着重要的作用。然而，在猪-恒河猴的肝移植模型中取得的成果，是否适用于人类，目前还不清楚。因此，有必要对恒河猴凝血系统的分子遗传背景作详细研究，以了解恒河猴凝血因子的结构和凝血机制，及其与人凝血因子的差异。为了检测恒河猴肝脏cDNA文库的基因表达特征，我们随机挑选401个恒河猴肝脏cDNA文库克隆进行3’端单向测序，获得393条有效EST序列，经拼接产生了221个Unigenes序列。Swissprot数据库比对发现有188个Unigenes序列与已知蛋白质匹配，其中16个Unigenes序列与已有的恒河猴蛋白质匹配，剩余的172个Unigenes序列中有171个与人类蛋白质高度同源。BLASTN比对显示，另外的33个Unigenes序列中，有26个Unigenes序列与已知恒河猴基因匹配，其余7个可能为恒河猴的新基因。dbEST和恒河猴基因组数据库比对结果表明Contig28、Singlet165、243为新发现的恒河猴EST序列。凝血因子IX和XI在凝血过程中都具有重要的作用，为了能够从分子水平研究恒河猴凝血因子IX和XI结构和功能，及其与人的匹配关系，我们采用PCR筛选法从恒河猴肝脏cDNA文库中克隆得到了凝血因子IX和XI的cDNA序列。序列分析结果显示，克隆得到了恒河猴FIX基因全长cDNA序列2668 bp；恒河猴FXI基因部分cDNA序列1646bp。恒河猴FIXcDNA序列已提交GenBank，获得基因序列登记号为：EU128170。我们利用生物信息学方法对克隆得到的恒河猴FIX cDNA和所编码的蛋白进行了初步分析。结果表明恒河猴FIX核酸序列与人FIX同源性为96．21％，蛋白质同源性为97.18％。该蛋白含有4个结构域，Gla、EGF1、EGF2和Trypsin，EGFl1四个物种中同源性最高的结构域，而EGF2在两者间差异最大，同源性只有92．31％。恒河猴和人的糖基化位点和数目基本一致，Cys位置和数目也高度保守。功能活性位点的比较显示恒河猴与人FIX具有相同的催化三联体和γ羧化谷氨酸位点。在重链序列中，形成底物结合槽的活性位点和大分子抑制物作用位点如autolysis loop、the99-100p，以及Ca2+结合区等在两者间都很相似。在FIX重链的模拟三维结构分析中，恒河猴和人的蛋白质构相也极为相似。以上结果提示，恒河猴FIX和人FIX可能具有同样的生理功能。此外，我们还初步探索了恒河猴FVⅡ的体外蛋白表达方法。成功构建了带有6His表达标签的毕赤酵母真核表达重组质粒pPIC-9K-MCFVⅡ和大肠杆菌原核表达重组质粒pET-DsbA-MCFVⅡ。在大肠杆菌原核表达系统中，目的蛋白主要以包涵体形式表达，但是在菌液上清和菌体裂解液中也能检测到可溶形式的目的蛋白。在毕赤酵母表达系统中，则未检测到明显的蛋白表达。因此，建立有效的恒河猴FVⅡ体外表达系统还需要进一步的实验研究。综上所述，本论文初步研究恒河猴肝脏cDNA文库的基因表达谱特征，鉴定得到了恒河猴3个新EST序列；克隆得到了重要的凝血因子FIX全长cDNA序列和FⅪ部分cDNA序列；通过生物信息学分析初步比较了恒河猴凝血因子FⅨ与人的差异；并对凝血因子FⅦ体外表达方法进行了初步探索，为今后研究恒河猴凝血系统的机制及其与人凝血系统存在的差异，以及进一步探索异种移植中凝血紊乱的分子机制和肝脏功能匹配问题奠定了基础。
二、版纳小型猪近交系心脏的异种移植解剖学观察（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、版纳小型猪近交系心脏的异种移植解剖学观察（论文提纲范文）
（1）利用TALENs技术高效制备GGTA1基因敲除近交小型猪的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写词表 |
| 前言 |
| 第一章 文献综述 |
| 1.1 GGTA1 基因与异种器官移植 |
| 1.2 猪体细胞核移植技术 |
| 1.3 TALENS 技术与基因敲除技术 |
| 1.3.1 ZFNs |
| 1.3.2 TALENs 技术 |
| 1.3.3 CRISPR/ Cas9 技术 |
| 1.4 版纳微型猪近交系 |
| 1.5 本课题选题依据及创新性 |
| 第二章 研究内容 |
| 1 材料与试剂 |
| 1.1 实验动物 |
| 1.2 细胞及菌株 |
| 1.3 质粒 |
| 1.4 试剂及溶液配制 |
| 1.5 工具酶及试剂盒 |
| 1.6 仪器与耗材 |
| 2 实验方法 |
| 2.1 PFFs 细胞系的建立及性别鉴定 |
| 2.2 TALENs 构建和体外活性检测 |
| 2.3 基因敲除细胞筛选鉴定 |
| 2.4 基因敲除猪的制备 |
| 2.5 克隆猪的鉴定 |
| 2.6 脱靶分析 |
| 2.7 GGTA1 基因敲除公猪的制作 |
| 3 结果与分析 |
| 3.1 PFFs 的分离培养及性别鉴定 |
| 3.2 TALENs 构建和体外活性检测 |
| 3.3 GGTA1 基因敲除细胞克隆筛选鉴定 |
| 3.4 GGTA1 KO 猪的获得 |
| 3.5 GGTA1 KO 猪表型分析 |
| 3.6 脱靶分析 |
| 3.7 GGTA1 KO 公猪的制作 |
| 4 讨论 |
| 4.1 PFFs 的建立及性别鉴定 |
| 4.2 TALENs 技术 |
| 4.3 版纳微型猪近交系 |
| 5 结论 |
| 参考文献 |
| 导师简介 |
| 作者简介 |
| 致谢 |
（2）西藏小型猪生长相关基因的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 综述 |
| 第一节 研究背景与科学意义 |
| 1.1 小型猪研究的现状及其进展 |
| 1.2 国内、外小型猪的介绍 |
| 1.3 小型猪在生物医学中的应用 |
| 1.4 本研究的意义 |
| 第二节 生长相关基因国内外的研究现状 |
| 2.1 神经内分泌生长轴 |
| 2.2 与生长相关基因的研究 |
| 2.3 本研究的目标和内容 |
| 第二章 研究内容 |
| 第一节 西藏小型猪GH、GHR基因多态性的研究 |
| 前言 |
| 1.1 实验材料 |
| 1.2 实验方法 |
| 1.3 实验结果 |
| 1.4 讨论 |
| 第二节 西藏小型猪GHR、IGF-1基因的克隆测序分析 |
| 前言 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 结果 |
| 2.4 讨论 |
| 第三节 西藏小型猪GH、GHR、IGF-1基因在不同年龄阶段和在不同组织中表达的差异分析 |
| 前言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 结果与分析 |
| 3.3 讨论 |
| 第四节 西藏小型猪GHR基因的真核表达 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 结果与分析 |
| 4.3 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间发表论文 |
| 英文缩写词表 |
| 致谢 |
| 附件 |
（3）版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析（论文提纲范文）
| 1 材料与方法 |
| 1. 1 材料与试剂 |
| 1. 2 方法 |
| 1. 2. 1 引物设计 |
| 1. 2. 2 RNA提取及c DNA样品制备 |
| 1. 2. 3 GHR基因的扩增 |
| 1. 2. 4 GHR序列生物信息学分析 |
| 1. 2. 5 GHR mRNA多组织表达谱分析 |
| 2 结果与分析 |
| 2. 1 RNA质量检测结果 |
| 2. 2 GHR基因扩增结果 |
| 2. 3 GHR序列生物信息学分析结果 |
| 2. 4 GHR mRNA多组织表达谱分析结果 |
| 3 讨论 |
（4）小型猪腹壁拉链模型的建立（论文提纲范文）
| 1 材料和方法 |
| 1.1 一般材料 |
| 1.1.1 实验动物; |
| 1.1.2 生物拉链 |
| 1.2 方法 |
| 1.2.1 小型猪腹壁拉链模型的建立: |
| 1.2.2 小型猪腹壁拉链模型体征生理数据测定: |
| 1.2.3 小型猪腹壁拉链模型血液生理生化指标和尿液常规指标的测定: |
| 2 结果 |
| 2.1 小型猪腹壁拉链模型的构建 |
| 2.2 小型猪腹壁拉链模型生理学数据的测定 |
| 3 讨论 |
（5）小型猪动物模型在医药学领域的研究应用与思考（论文提纲范文）
| 1 在现代医药学领域的研究应用 |
| 1.1 心血管系统研究应用 |
| 1.2 消化系统研究应用 |
| 1.3 皮肤、整形研究应用 |
| 1.4 器官移植研究应用 |
| 1.5 口腔疾病研究应用 |
| 1.6 其它 |
| 2 在中医药领域的研究应用 |
| 3 思考与展望 |
（6）遗传资源创新是我国地方猪种保存和利用的重要途径——记我国近交系小型猪培育、利用20年（论文提纲范文）
| 1??开阔视野、奋力探索、实现小型猪遗传资源的创新 |
| 2??近交系小型猪遗传资源创新取得的成就 |
| 2.1??由2头猪建立近交系群体, 确立为国家第一批畜禽遗传保种场 (C1101001) |
| 2.2??建立近交系培育技术方法[2], 授权发明专利 (ZL02149030.9) |
| 2.3??高寒地区引种扩繁, 证明了我国近交系品种猪培育成功的可靠性 |
| 2.4??近交多方验证、揭示其遗传稳定性分子基础[3] |
| 2.5??建立了近交系小型猪与我国其它小型猪品系、品种间的鉴定方法和标准 |
| 2.6??初步揭示近交系小型猪其矮小型分子遗传机理[4] |
| 2.7??初步揭示近交系小型猪与人类免疫同源性分子遗传机理[5、6] |
| 2.8??近交系小型猪内源性逆转录病毒 (PERV) 生物安全性研究 |
| 2.9??开展了近交系小型猪SPF净化研究[3、8] |
| 3??国家重视、多方资助与合作 |
| 4??讨?论 |
| 4.1??我国小型猪遗传资源的保种与利用途径 |
| 4.2??近交系小型猪急待开展的工作 |
（7）近交系五指山小型猪解剖组织学研究及内源性反转录病毒（PERV）的检测（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略语表 |
| 第一章 前言 |
| 1 立题依据 |
| 2 文献综述 |
| 2.1 小型猪 |
| 2.2 异种移植 |
| 2.3 猪内源性反转录病毒 |
| 3 本研究的目的和意义 |
| 第二章 近交系五指山小型猪消化、泌尿器官及心脏解剖学研究 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 材料与方法 |
| 2.2.1 试验材料 |
| 2.2.2 试验方法 |
| 2.3 试验结果 |
| 2.3.1 消化器官的解剖特征 |
| 2.3.2 泌尿器官的解剖学特征 |
| 2.3.3 心脏的解剖学特征 |
| 2.4 讨论 |
| 2.4.1 近交系五指山小型猪消化器官 |
| 2.4.2 近交系五指山小型猪泌尿器官的解剖特点 |
| 2.4.3 近交系五指山小型猪的心脏 |
| 2.5 小结 |
| 图版 |
| 第三章 近交系五指山小型猪免疫器官的组织学观察 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 材料与方法 |
| 3.2.1 试验材料 |
| 3.2.2 试验方法 |
| 3.3 试验结果 |
| 3.3.1 胸腺的组织结构 |
| 3.3.2 脾脏的组织结构 |
| 3.3.3 淋巴结的组织结构 |
| 3.4 讨论 |
| 3.4.1 五指山小型猪免疫器官随年龄变化的结构特点 |
| 3.4.2 五指山小型猪免疫器官比较组织学特点 |
| 3.5 小结 |
| 图版 |
| 第四章 近交系五指山小型猪心、肝、肾的显微和超微结构 |
| 4.1 引言 |
| 4.2 材料与方法 |
| 4.2.1 试验材料 |
| 4.2.2 试验方法 |
| 4.3 试验结果 |
| 4.3.1 近交系五指山小型猪心、肝和肾的显微结构 |
| 4.3.2 近交系五指山小型猪心、肝和肾的超微结构 |
| 4.4 讨论 |
| 4.4.1 近交系五指山小型猪心、肝和肾显微结构特点 |
| 4.4.2 近交系五指山小型猪心、肝和肾超微结构特点 |
| 4.5 小结 |
| 图版 |
| 第五章 近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的形态学研究 |
| 5.1 引言 |
| 5.2 材料与方法 |
| 5.2.1 试验材料 |
| 5.2.2 试验方法 |
| 5.3 试验结果 |
| 5.3.1 近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的解剖和组织学结构 |
| 5.3.2 近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的超微结构 |
| 5.4 讨论 |
| 5.4.1 近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的解剖和组织学特点 |
| 5.4.2 近交系五指山小型猪垂体、甲状腺和胰腺的超微结构特点 |
| 5.5 小结 |
| 图版 |
| 第六章 近交系五指山小型猪PERV的检测 |
| 6.1 引言 |
| 6.2 材料与方法 |
| 6.2.1 试验材料 |
| 6.2.2 试验方法 |
| 6.2 结果 |
| 6.2.1 gag、envA和envB基因组织表达谱 |
| 6.2.2 pol基因组织表达谱 |
| 6.3 讨论 |
| 6.3.1 PERV的研究 |
| 6.3.2 PERV的基因结构 |
| 6.3.3 我国特有小型猪PERV的检测 |
| 6.3.4 近交系五指山小型猪PERV的检测 |
| 6.4 小结 |
| 结论 |
| 下一步研究计划 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 附录1 攻读硕士学位期间以第一作者发表的论文 |
| 附录2 攻读硕士学位期间参加的学术交流活动 |
（8）版纳微型猪近交系动物瘢痕模型的建立（实验Ⅰ）（论文提纲范文）
| 一、学位论文 |
| (一)中文摘要 |
| (二)英文摘要 |
| 前言 |
| 材料、仪器、设备和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 二、综述 |
| 三、已刊文章目录 |
| 四、致谢 |
（9）实验用小型猪在比较医学中的研究应用与发展（论文提纲范文）
| 1 比较医学的定义和研究内容 |
| 1.1 比较医学的定义 |
| 1.2 比较医学的研究内容 |
| 2 小型猪在比较医学中的重要性 |
| 3 小型猪在比较医学中的应用 |
| 3.1 在心血管和糖尿病中的应用 |
| 3.2 在免疫学和异种器官移植中的应用 |
| 3.3 在遗传性和营养性疾病中的应用 |
| 3.4 在皮肤病和外科中的应用 |
| 3.5 在肿瘤学中的应用 |
| 4 猪的比较医学发展前景 |
（10）恒河猴凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ的遗传分子研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 前言 |
| 技术路线 |
| 第一部分 恒河猴肝脏cDNA文库表达序列标签(EST)测序及序列分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 图表 |
| 第二部分 恒河猴凝血因子Ⅸ和Ⅺ的cDNA克隆 |
| 1.前言 |
| 2.材料与方法 |
| 3.实验结果 |
| 4.讨论 |
| 5.结论 |
| 6.图表 |
| 第三部分 恒河猴凝血因子Ⅸ cDNA序列生物信息学分析 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 图表 |
| 第四部分 恒河猴凝血因子Ⅶ体外表达 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 3 实验结果 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 6 图表 |
| 全文总结 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 中英文对照 |
| 个人简介 |
| 致谢 |
四、版纳小型猪近交系心脏的异种移植解剖学观察（论文参考文献）
- [1]利用TALENs技术高效制备GGTA1基因敲除近交小型猪的研究[D]. 信吉阁. 吉林大学, 2014(03)
- [2]西藏小型猪生长相关基因的研究[D]. 岳敏. 南方医科大学, 2014(05)
- [3]版纳微型猪近交系GHR基因克隆及生物信息学分析[J]. 王淑燕,霍金龙,潘伟荣,施晨,曾养志. 中国实验动物学报, 2014(01)
- [4]小型猪腹壁拉链模型的建立[J]. 马雷,汤球,刘志学,余琛琳,崔淑芳. 中国比较医学杂志, 2011(12)
- [5]小型猪动物模型在医药学领域的研究应用与思考[J]. 陈学习,赵晓梅. 福建中医学院学报, 2010(04)
- [6]遗传资源创新是我国地方猪种保存和利用的重要途径——记我国近交系小型猪培育、利用20年[J]. 冯书堂. 猪业科学, 2010(01)
- [7]近交系五指山小型猪解剖组织学研究及内源性反转录病毒（PERV）的检测[D]. 靳二辉. 华中农业大学, 2008(02)
- [8]版纳微型猪近交系动物瘢痕模型的建立（实验Ⅰ）[D]. 袁建房. 昆明医学院, 2008(10)
- [9]实验用小型猪在比较医学中的研究应用与发展[J]. 靳二辉,杨述林,冯书堂,彭克美,李奎. 实验动物科学, 2007(06)
- [10]恒河猴凝血因子Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ的遗传分子研究[D]. 王建东. 四川大学, 2007(05)