一、食管癌中AKT和PTEN蛋白表达及其临床相关性研究（论文文献综述）
刘小红[1]（2021）在《食管癌变过程中PTEN、p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1的表达及其与临床病理参数的关系》文中研究说明目的:1、检测PTEN、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1基因在食管鳞状上皮癌变过程（正常组织低级别上皮内瘤变组织高级别上皮内瘤变组织鳞状细胞癌组织）中的蛋白表达状况。2、分析四种基因蛋白表达的相关性及其与食管鳞状细胞癌中临床病理参数的关系。方法:1、收集食管鳞状细胞癌组织89例及癌旁组织（高级别上皮内瘤变组织34例、低级别上皮内瘤变组织17例、正常食管组织59例）,制作组织芯片。2、运用免疫组化方法进行PTEN、p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K抗体免疫组化染色,观察各组样本PTEN、p-mTOR、p-4EBP1、p-p70S6K蛋白表达水平。3、采用H-score评分法评分,比较组间蛋白表达差异,分析各基因蛋白表达之间的相关性,以及与食管鳞癌临床病理参数之间的关系。结果:1、（1）PTEN在食管正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、鳞状细胞癌中蛋白表达水平逐渐降低（H-score≥30的比率分别为74.58%,58.82%,58.82%,19.10%）;（2）p-mTOR蛋白在鳞状细胞癌、高级别上皮内瘤变中明显高表达（93.26%,100.00%）,显着高于低级别上皮内瘤变组及正常组（70.59%,69.49%）;（3）p-p70S6K在食管正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变中蛋白表达水平逐渐增加（32.20%,70.59%,85.29%）,在鳞状细胞癌中表达水平反而下降（43.82%）;（4）p-4EBP1在食管正常组织、低级别上皮内瘤变、高级别上皮内瘤变、鳞状细胞癌中蛋白表达呈递增趋势（22.03%,35.29%,55.88%,58.43%）。2、各基因蛋白在正常组、低级别瘤变组、高级别瘤变组、鳞状细胞癌组中H-score评分分别为:PTEN[60.00（20.00,80.00）,60.00（7.50,80.00）,55.00（5.00,105.00）,0.00（0.00,15.00）];p-mTOR[110.00（30.00,140.00）,170.00（60.00,240.00）,285.00（200.00,296.25）,240.00（150.00,292.50）];p-p70S6K[30.00（30.00,80.00）,120（30.00,120.00）,180（85.00,217.50）,5.00（0.00,60.00）];p-4EBP1[10.00（0.00,30.00）,30.00（0.00,80.00）,30.00（0.00,85.00）,40.00（0.00,140.00）]。四组比较差异有统计学意义（P<0.01）,且两两比较部分组间差异同样具有统计意义（P<0.05）。3、食管鳞状细胞癌中,PTEN蛋白表达与肿瘤浸润深度相关（P<0.05）。p-mTOR蛋白表达与肿瘤临床分期、病理分级、浸润深度有关（P<0.05）。p-p70S6K蛋白表达与肿瘤临床分期及浸润深度有关（P<0.05）。4、p-p70S6K与p-4EBP1在食管鳞癌中蛋白表达具有弱正相关（P<0.01）,其余因子彼此之间无相关性（P>0.05）。结论:1、p-mTOR及p-4EBP1基因蛋白在食管鳞状细胞癌中高表达,p-p70S6K是食管癌变过程中的早期事件,PTEN在食管鳞状细胞癌中低表达。2、PTEN、p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1基因蛋白表达在食管鳞状上皮癌变各阶段具有显着性差异（P<0.05）。3、PTEN、p-mTOR、p-p70S6K与食管鳞癌浸润深度、病理分级及临床分期相关。4、p-p70S6K与p-4EBP1基因蛋白表达具有弱正相关（P<0.05）。
李一桐[2]（2021）在《健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响》文中进行了进一步梳理背景与目的胃癌是常见的恶性肿瘤之一,我国作为胃癌发病率及死亡率较高的国家,胃癌严重威胁人们群众的生命健康。流行病学研究显示,慢性萎缩性胃炎伴异型增生与胃癌的发生密切相关,是目前公认最主要的胃癌前病变。重度异型增生患者发展为胃癌的机率可达60-80%,但慢性萎缩性胃炎伴异型增生发展为癌变的机制尚不明确。现代医学治疗胃癌前病变只能通过对症治疗,疗效欠佳,而中医药对本病的治疗有确切的疗效和宝贵的经验,其对异型增生的逆转作用,已得到普遍认可。因此,对中医药治疗慢性萎缩性胃炎异型增生的机制进行深入研究,有重要的意义。本团队前期已经研究了健脾清化汤对幽门螺旋杆菌感染相关胃炎的治疗作用,初步发现健脾清化汤可能通过对HSP70/NF-κB通路的调控,减轻幽门螺旋杆菌对胃黏膜细胞的炎性损伤。为后续的进一步研究奠定了理论基础。本实验运用MNNG配合HP感染、雷尼替丁、饥饱失常多因素综合造模法建立慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠模型,选用健脾清化化瘀汤（党参、丹参、莪术、白术、茯苓、甘草、黄连、大黄、蒲公英、白花蛇舌草、三七、土茯苓、陈皮、半夏曲）作为干预药物,观察其对慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠一般情况及胃黏膜病理情况的影响,并采用免疫组化及RT-PCR检测miR-21、PTEN基因转录和蛋白表达情况,以探讨健脾清化化瘀汤治疗慢性萎缩性胃炎,逆转异型增生的分子作用机制。方法1.实验分组:将90只雄性SD大鼠按照随机数字表法随机分为6组,包括正常组、模型组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤低剂量组、健脾清化化瘀汤中剂量组、健脾清化化瘀汤高剂量组。进行造模前适应性饲养7d。2.造模方法:正常组给予SPF级大鼠标准饲料及饮用水,至实验结束;其余5组每只大鼠用HP菌液灌胃7次,平均2次/周,HP菌液浓度1x109CFU/mL,2ml/只。其后给予大鼠正常食水2周以便于HP定植,进行13C尿素呼气实验以确认HP感染。确认HP感染后,除正常组外,其余5组大鼠予150ug/ml MNNG溶液灌胃,3ml/只,频率5次/周,同时予100ug/ml MNNG溶液自由饮用,配合饥饱失常法（2d足量饲料喂养,1d禁食）,5组大鼠均予0.03%雷尼替丁饲料喂养,持续造模28周。3.干预方法（1）正常组、模型组给予普通饲料及饮用水,可以自由摄食摄水,运用生理盐水进行灌胃,1次/d,不给予其他任何干预。（2）健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组按照《药理实验方法学》中规定,分别以8.35g/（kg·d）、16.70 g/（kg·d）、33.39 g/（kg·d）剂量进行中药灌胃治疗,1 次/d,灌胃前禁食4h,其余时间可自由摄食摄水,均为普通饲料及饮用水。干预持续10周。（3）iNOS抑制剂组以氨基胍溶液50mg/（kg·d）剂量进行灌胃干预,1次/d,灌胃前禁食4h,其余时间可自由摄食摄水,均为普通饲料及饮用水。干预持续10周。4.检测及方法:治疗10周后处死大鼠,迅速取材胃组织,运用HE染色观察大鼠胃黏膜病理变化;运用免疫组化法检测胃组织PTEN蛋白表达,并计算AOD值;运用RT-PCR法检测胃组织 miR-21、PTEN mRNA 表达。结果1.一般情况:药物干预阶段,正常组大鼠形体肥胖,反应灵敏,精神良好,饮食、饮水量正常,毛色光亮,有光泽,爪甲、唇周颜色正常;模型组反应迟钝,精神萎靡,偶有易激惹,饮食、饮水量明显减少,毛色散暗,无光泽,爪甲唇周颜色淡白;健脾清化化瘀汤低、中、高剂量组及iNOS抑制剂组大鼠状态较正常组精神欠佳,饮食水量略少,但状态均优于模型组,中药治疗组及iNOS抑制剂组干预阶段大鼠一般情况未见明显差异。正常组、iNOS抑制剂组、健脾清化化瘀汤高剂量、中剂量组大鼠体质量整体呈上升趋势,模型组及健脾清化化瘀汤低剂量组大鼠体质量略有下降。2.胃黏膜病理变化:造模组大鼠胃黏膜可见粘膜层变薄,腺体数量减少,腺体排列紊乱,慢性炎性细胞浸润,可达黏膜肌层,可见杯状细胞,细胞形态不一,细胞核出现异常。干预治疗10周后,健脾清化化瘀汤高、中剂量组、iNOS组肉眼及及镜下较模型组有不同程度改善,可见腺体排列相对规则,腺体数目尚可,肠上皮化生及异型增生较少见。健脾清化化瘀汤低剂量组胃黏膜好转不明显。3.PTEN蛋白表达量比较:与正常组相比,模型组PTEN蛋白表达显着降低（P<0.01）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组PTEN蛋白表达上调（P<0.05;P<0.05;P<0.01）,健脾清化化瘀汤低剂量组PTEN蛋白表达无差异（P>0.05）;4.miR-21表达量比较与正常组相比,模型组miR-21表达显着升高（P<0.001）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组miR-21表达下调（P<0.001;P<0.001;P<0.001）,健脾清化化瘀汤低剂量组miR-21表达无差异（P>0.05）;5.PTEN mRNA表达量比较与正常组相比,模型组胃黏膜中PTEN mRNA表达显着下调（P<0.001）;与模型组相比,健脾清化化瘀汤中、高剂量组、iNOS抑制剂组大鼠胃黏膜PTEN mRNA表达上调（P<0.001;P<0.001;P<0.001）,健脾清化化瘀汤低剂量组PTEN mRNA表达无差异（P>0.05）。结论1、健脾清化化瘀汤可有效改善慢性萎缩性胃炎伴异型增生大鼠一般情况,缓解胃黏膜病变,可能逆转异型增生,阻断胃癌前病变向胃癌进展。2、健脾清化化瘀汤可能通过下调胃黏膜miR-21表达,从而解除miR-21对抑癌基因PTEN表达的抑制,提高PTEN的表达,进一步调控PTEN下游信号通路,达到治疗CAG伴异型增生的作用。3、miR-21可能是胃癌前病变发病的关键因素,可能是治疗CAG异型增生的潜在重要靶点。
王新宇[3]（2021）在《LEF1-ID3-HRAS信号轴促进食管鳞癌增殖、转移及上皮-间质转化的机制研究》文中提出食管癌（Esophageal cancer,EC）是全球发病率第七位、死亡率第六位的恶性肿瘤,成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。在我国,食管鳞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是主要的食管癌类型,约占90%以上。以手术为主的综合治疗是治疗早中期食管癌的主要治疗手段,5年生存率徘徊在30-50%左右,其中术后局部复发和远处转移是影响患者预后的主要因素之一。近年来靶向治疗在一些恶性肿瘤中显示出良好的效果,但对于食管鳞癌,靶向治疗进展较为缓慢。从分子水平上寻找有效的靶点减少食管鳞癌的复发与转移,是目前治疗食管鳞癌的策略之一,具有重要的临床价值和意义。上皮间质转化（Epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指在一定条件下,上皮细胞向间质细胞表型转化的过程。在生理情况下,EMT参与生长发育中原肠胚形成、组织形态发生和伤口愈合过程。而在病理情况下,EMT可导致上皮细胞极性的丧失、黏附性降低和迁移能力增强,此时赋予了细胞侵袭和转移的能力,因此EMT也是公认的肿瘤细胞复发与转移的机制之一。淋巴增强因子1（Lymphoid enhancer-binding factor 1,LEF1）是Wnt/β-cantenin信号通路中一个关键的核内转录因子。生理情况下LEF1在干细胞的干性维持和器官发育具有重要的作用,但异常表达的LEF1可能打乱正常细胞间的调控机制,造成细胞的异常增殖进而导致肿瘤形成。已经证实,LEF1在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移、和肿瘤干细胞特性过程中发挥重要作用,因此可以作为一个潜在的分子标志物和治疗靶点。LEF1在食管癌中的作用目前研究较少。本课题组前期的研究显示,相比于正常食管上皮组织,LEF1在食管鳞癌中高表达,且LEF1高表达患者的预后更差,这提示我们LEF1可以作为一个食管鳞癌的预后标志物。但LEF1在食管鳞癌中是否具有生物学功能,其机制又是什么,目前未见文献报道。我们推测LEF1在食管鳞癌的发生、发展过程中可能具有重要作用。因此本课题中我们在此前的基础上继续探索LEF1在食管鳞癌中的功能及相关机制。第一部分LEF1在食管鳞癌中的功能及机制研究目的:探索LEF1在食管鳞癌中的生物学功能及下游分子机制。方法:1.使用Oncomine数据库分析LEF1在食管鳞癌组织和正常食管组织中的表达水平。2.构建过表达和干扰LEF1的稳转食管鳞癌细胞株。3.实时荧光定量PCR检测基因的m RNA水平,Western Blot检测基因的蛋白水平。4.CCK-8法检测细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移、侵袭能力。5.裸鼠皮下成瘤比较组间的致瘤能力。6.转录组测序寻找基因下游调控关系。7.JASPAR数据库预测转录因子与下游靶基因的结合位点。8.双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫共沉淀技术验证转录因子与下游靶基因的结合并确定结合位点。9.回复实验验证表型挽救能力;10.连续切片行免疫组化观察两种蛋白的表达相关性。结果:1.LEF1在食管鳞癌组织中高表达:通过数据库验证,结合我们既往的研究,同正常食管组织相比,LEF1在食管鳞癌中高表达。2.过表达LEF1增强食管鳞癌细胞的增殖能力和皮下成瘤能力:（1）同对照组相比,过表达LEF1能增强Eca109和TE1细胞的增殖能力,而敲减LEF1则抑制了Eca109和TE1细胞的增殖能力。（2）同对照组相比,接种过表达LEF1细胞的裸鼠皮下成瘤体积明显增大（P<0.05）,而接种敲减LEF1细胞的裸鼠皮下成瘤体积明显缩小（P<0.01）。3.过表达LEF1增强食管鳞癌细胞的迁移、侵袭和EMT能力:（1）过表达LEF1显着下调上皮标志物E-Cadherin的表达水平,并上调间质标志物N-Cadherin的表达水平。而敲减LEF1显着上调E-Cadherin的表达水平,并下调N-Cadherin的表达水平。（2）过表达LEF1不仅显着促进Eca109和TE1细胞的迁移能力（P<0.01,P<0.01）,也促进它们的侵袭能力（P<0.01,P<0.01）。而敲减LEF1则抑制Eca109和TE1细胞的迁移能力（P<0.01,P<0.01）,也抑制了它们的侵袭能力（P<0.01,P<0.01）。4.LEF1是通过直接结合ID3发挥生物学功能的:（1）根据转录组测序的结果,筛选并验证出LEF1可激活TGF-beta信号通路。再根据富集分析的结果使用q RT-PCR验证以及JASPAR数据库预测,确定了ID1和ID3很可能是LEF1的下游靶基因。（2）双荧光素酶报告基因实验显示LEF1可增强ID1和ID3的启动子活性,Ch IPPCR显示ID1启动子上游-1631～-1616区域、ID3启动子上游-1114～-1100区域存在LEF1的结合位点。（3）通过检测14对新鲜食管鳞癌样本中LEF1、ID1和ID3的表达情况,发现相比于ID1,LEF1与ID3的关联更紧密。回复实验显示干扰ID3后,对LEF1产生的增殖、EMT功能影响较干扰ID1明显,提示LEF1是通过调控ID3的表达,进而发挥致癌作用。（4）通过连续切片行免疫组化检测LEF1与ID3的表达相关性,发现LEF1与ID3的表达具有一致性。结论:LEF1在食管鳞癌组织中高表达,过表达LEF1能够促进食管鳞癌细胞的生长、迁移、侵袭及EMT能力。LEF1通过直接结合ID3,调控后者的表达,从而产生生物学功能。第二部分ID3在食管鳞癌中的功能及机制研究目的:探索分化抑制因子3（Inhibitors of DNA binding and cell differentiation 3,ID3）在食管鳞癌中的生物学功能及下游分子机制。方法:1.使用Oncomine和UALCAN数据库分析ID3在食管鳞癌组织和正常食管组织中的表达水平,并使用免疫组化在组织样本中进行验证。2.分析ID3的表达水平和食管鳞癌患者临床资料以及预后之间的联系。3.构建过表达和干扰ID3的稳转食管鳞癌细胞株。4.实时荧光定量PCR检测基因的m RNA水平,Western Blot检测基因的蛋白水平。5.CCK-8法和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,划痕实验和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。6.裸鼠皮下成瘤比较组间的致瘤能力,尾静脉注射肿瘤细胞建立肺转移模型比较组间的肺转移能力。7.转录组测序探索基因下游调控网络。8.回复实验验证表型挽救能力。结果:1.ID3在食管鳞癌组织中高表达,且与部分不良临床病理资料相关,同时与预后成负相关:（1）利用92例石蜡标本行免疫组化检测发现,64.13%的患者食管鳞癌组织ID3高表达,35.87%低表达。而正常食管组织中ID3高表达仅占27.17%,低表达占72.83%,差异具有统计学意义（P<0.01）。显示同正常食管组织相比,ID3在食管鳞癌中高表达。（2）分析ID3和食管鳞癌患者临床资料间的关联发现,ID3高表达的病人有更差的组织学分化（P=0.011）、更高的病理T分期（P<0.01）与TNM分级（P<0.01）。（3）ID3高表达的患者预后明显差于ID3低表达的患者,差异具有统计学意义（P<0.001）。Cox单因素分析示,组织分化（P=0.035）、病理N分期（P=0.025）以及ID3表达水平（P=0.002）是影响总体生存期的因素。多因素分析示ID3表达水平是食管鳞癌患者总体生存期的独立预后因素（P=0.007）。提示ID3可以作为食管鳞癌患者的一个预后标志物。此外,联合LEF1和ID3的表达情况发现,LEF1高表达且ID3高表达组患者的预后最差,LEF1低表达且ID3低表达组患者预后最好,说明LEF1和ID3两者联合较单一指标可以更准确的预测食管鳞癌患者的预后。2.ID3促进食管鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT能力:（1）CCK-8增殖实验显示,同对照组相比,过表达ID3能增强Eca109和TE1细胞的增殖活性（P<0.01,P<0.01）,平板克隆实验中ID3过表达组可以明显增加Eca109和TE1细胞的克隆数（P<0.01,P<0.05）。而干扰ID3后行CCK-8增殖实验显示能明显降低Eca109和TE1细胞的增殖活性,平板克隆实验中干扰ID3可以明显减少Eca109和TE1细胞的克隆数。（2）划痕实验显示,过表达ID3后,Eca109和TE1细胞间隔明显减少（P<0.05,P<0.01）,而干扰ID3后,Eca109和TE1细胞间隔增宽。Transwell实验显示过表达ID3不仅显着促进Eca109和TE1细胞的迁移能力（P<0.01,P<0.05）,也促进它们的侵袭能力（P<0.01,P<0.05）,而干扰ID3则明显抑制Eca109和TE1细胞的迁移和侵袭能力。（3）过表达ID3后,上皮标志物E-Cadherin明显减少,间质标志物N-cadherin、Snail、Slug、Vimentin、MMP2和MMP9明显增加。而干扰ID3后,上皮标志物ECadherin明显增加,间质标志物N-cadherin、Snail、Slug、Vimentin、MMP2和MMP9明显减少。提示ID3能促进食管鳞癌上皮间质转化。（4）ID3过表达后可以显着增加裸鼠皮下成瘤的体积（P<0.01）,而干扰ID3后可以显着减少成瘤的体积（P<0.01）,提示了ID3可促进食管鳞癌细胞的生长。（5）裸鼠尾静脉注射过表达ID3细胞的裸鼠肺部转移瘤数量均多于对照组,过表达组平均成瘤数16.75±1.11个,对照组为6±0.82个,差异具有统计学意义（P<0.01）。干扰ID3组中的裸鼠肺部转移瘤数量明显少于对照组,干扰组平均成瘤数2.25±0.63个,对照组则为12.25±1.03个,差异具有统计学意义（P<0.01）。证明了过表达ID3可促进食管鳞癌细胞的肺转移,而干扰ID3可抑制食管鳞癌细胞的肺转移。3.ID3可激活ERK/MAPK信号通路,而ERK/MAPK信号通路也能诱导ID3的表达,局部形成正反馈调节:（1）根据转录组测序的结果,筛选并验证了ID3可激活ERK/MAPK信号通路,而ID3对JNK/SAPK和p38两条MAPK级联通路无影响。（2）使用ERK/MAPK信号通路抑制剂U0126加入过表达ID3的Eca109及TE1细胞中发现,细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT作用均明显受到抑制,说明在食管鳞癌细胞中ID3是通过ERK/MAPK信号通路产生生物学功能的。（3）ERK/MAPK信号通路激活剂TPA加入Eca109及TE1细胞中,ID3的表达明显升高。加入TPA的同时加入U0126,则ID3的表达较单独加入TPA下降,且随着U0126的浓度增加,ID3下降的程度也更多。说明ERK/MAPK信号通路能调控ID3的表达,激活ERK/MAPK信号通路能明显上调ID3的表达,抑制ERK/MAPK信号通路则能明显降低ID3的表达。4.ID3是通过升高HRAS的表达激活ERK/MAPK信号通路的:（1）通过q RT-PCR及WB验证出HRAS无论在m RNA还是在蛋白水平均发生了明显的升高。（2）在过表达ID3的Eca109及TE1细胞中转入HRAS干扰质粒,细胞的增殖、侵袭、迁移及EMT能力均受到抑制,说明ID3是通过激活HRAS,进而激活ERK/MAPK信号通路产生生物学功能的。结论:ID3通过促进HRAS的表达激活ERK/MAPK信号通路,进而产生生物学功能。而激活了的ERK/MAPK信号通路又可以反过来促进ID3的表达,通过正反馈调节放大了局部促进作用。
陈雪[4]（2021）在《基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制》文中研究表明研究目的:本团队在前期临床实验中已发现固正消癌方在提升大肠癌患者的生存质量、改善患者功能状态以及缓解患者病痛等方面发挥出极大优势,在较好的疗效基础上,本实验利用生物分子学技术,观察固正消癌方对PI3K/AKT/mTOR信号通路以及PTEN的影响,为固正消癌方治疗肠癌,抑制癌细胞的转移增殖提供更直面客观的理论依据,为制定大肠癌的诊疗共识提供新视点。研究内容:1.采用江苏省中医院病理科提供的2018-2019年间的20对病理组织（结直肠癌组织及相应癌旁组织各20例）和2020年6月1日一10月31日五个月内于我院肛肠科行肠癌手术后留存的标本组织5对（结直肠癌组织以及相应癌旁组织各5例）,分别应用免疫组化方法以及q-PCR技术检测PTEN、PI3K、AKT、mTOR蛋白分子在各样本组织和标本组织中的含量,统计各蛋白因子在结直肠癌组织及相应癌旁组织中的表达量并计算差异情况,由此间接反映各因子是否参与人结直肠癌的发展。2.建立裸鼠皮下瘤模型,处死裸鼠完成荷瘤组织剥离并称重,记录各组裸鼠肿瘤重量变化并分析其差异性,采用Western Blot方法及免疫组化方法检测各组样本中PTEN、PI3K、AKT、mTOR、p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的蛋白表达含量并统计各组间差异。研究结果:1.临床实验中,免疫组化法结果示:癌旁组织中PTEN的表达量显着高于肠癌组（P<0.05）;癌旁组织中PI3K、AKT、mTOR的表达量显着低于癌症组织（P<0.05）。q-PCR结果示:结直肠癌组PTEN、PI3K、AKT、mTOR蛋白含量,与癌旁组织对比,PTEN表达量降低,PI3K、AKT、mTOR表达量升高,均有显着性差异（P<0.05）。2.裸鼠荷瘤重量检测结果示:固正消癌方低剂量组平均瘤重较模型组平均瘤重无明显差异（P>0.05）;固正消癌方中剂量组及高剂量组两组瘤重较模型组均降低（P<0.05）3.动物实验中,Western Blot结果示:与模型组相比,PTEN表达量在固正消癌方低、中、高剂量组均显着增高（P<0.05）;固正消癌方低、中、高剂量组的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR表达量与模型组相比均显着降低（P<0.05）。免疫组化结果示:与模型组相比,固正消癌方低剂量组中p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量有下调趋势,但无统计学意义（P>0.05）,固正消癌方中、高剂量组中的p-PI3K、p-AKT、p-mTOR蛋白表达量显着低于模型组（P<0.05）;与模型组相比,固正消癌方低、中剂量组中PTEN表达量没有统计学差异（P>0.05）,高剂量组中PTEN表达量显着高于模型组（P<0.05）;与模型组相比,加入固正消癌方后低、中、高剂量三组中PI3K、AKT、mTOR总表达量有下调趋势均无统计学意义,（P>0.05）。研究结论:（1）PTEN蛋白在人结直肠癌组织中的低表达以及PI3K、AKT、mTOR等蛋白在人结直肠癌组织中的高表达共同说明了 PI3K/AKT/mTOR信号通路在人肠癌的发生发展中呈激活状态,是我们一直所探索的影响肠癌发病机制的关键信号轴之一。（2）固正消癌方可抑制裸鼠皮下种植瘤的增长同时抑制HT-29细胞的异常分化增殖。（3）固正消癌方可上调裸鼠种植瘤中PTEN表达量,降低p-PI3K、p-AKT、p-mTOR表达量,且与药物剂量呈相关性,高剂量的固正消癌方作用效果更显。（4）固正消癌方可通过调控PTEN基因抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性状态来发挥治疗大肠癌的作用。
张难[5]（2021）在《MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制》文中研究表明恶性肿瘤是威胁人类健康的三大疾病之一,食管癌（Esophageal Cancer）在世界范围内的发病率位于所有恶性肿瘤的第8位,死亡率位于第6位。我国食管癌的发病人数占世界范围的50%以上,据统计,2015年我国食管癌发病24.6万,发病率为17.87/10万;死亡18.8万例,死亡率为13.68/10万。从病理类型上看,食管癌的主要分为鳞癌和腺癌,欧美主要以腺癌为主,在我国90%以上均为鳞癌,其发病具有明显的家族聚集性和地域性。食管鳞癌的发生主要由环境、饮食习惯、地域等多种因素综合作用所致。食管鳞癌同其他恶性肿瘤一样,由促癌基因和抑癌基因表达失调共同所致。但是,由于目前对于此类食道癌发病相关分子表达变化及其分子机制仍不明确,研究食管癌的发病机制具有极其重要的意义,能够为食管癌的治疗提供新的靶点,对于提高食管癌患者的治疗效果及改善预后具有重要的意义。MicroRNA（MiRNA）是一类内源性非编码的小RNA,通常由2l-25个核苷酸组成的,在人体内起着调节细胞基本生理功能的作用。研究显示miRNA可通过调节下游靶基因影响肿瘤的发生和发展,有望成为肿瘤治疗的潜在靶点。这些miRNA既有抑癌作用、也发挥促癌效应。既往研究证实多种miRNA在食管鳞癌组织及细胞中表达失调,其表达变化与食管鳞癌的恶性度及预后相关。MiR-301a-3p是miR-301家族的一员,广泛表达于人体各个器官,具有重要的生物学功能,同多种肿瘤发生相关。但是,miR-301a-3p在食管鳞癌发生中的作用尚不明了。为了研究其在食管鳞癌中的作用,本文首先比较了食管癌组织与癌旁组织、食管鳞癌细胞与正常粘膜细胞中miR-301a-3p表达水平,并分析其表达水平与患者临床特征、术后病理分期之间的相关性;接着验证了miR-301a-3p对食管癌细胞增殖活性的影响;然后分析寻找并验证miR-301a-3p的下游靶基因,最后探讨miR-301a-3p调节食管癌细胞增殖活性的分子机制。第一部分miR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及临床意义目的:明确miR-301a-3p在食管鳞癌组织、细胞中及正常食管粘膜组织、细胞中分别表达情况,及其表达水平与食管鳞癌患者临床病理特征之间的关系。方法:收集行手术切除的食管鳞癌患者的肿瘤及配对正常组织标本,并培养食管鳞癌细胞系及正常食管粘膜上皮细胞系,用Real-time PCR方法检测miR-301a-3p在食管鳞癌组织、正常组织及不同细胞系中的表达差异。收集患者临床资料,分析miR-301a-3p表达水平与患者临床特征及病理学之间的关系。结果:miR-301a-3p在食管鳞癌组织中的表达水平显着高于正常组织（P<0.01）;与正常食管粘膜细胞HET-1A相比,miR-301a-3p在食管鳞癌细胞系Eca109、TE-1中的表达均显着升高（P<0.001）。MiR-301a-3p高表达与术后病理中的淋巴结转移（P=0.017）、肿瘤长度超过4cm（P=0.03）以及TNM分期（P=0.009）呈显着相关。小结:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞系中的表达水平比正常食管粘膜组织和正常食管细胞系中升高,miR-301a-3p的相对表达量高低与食管鳞癌的肿瘤长度、淋巴结转移情况以及TNM分期相关。第二部分miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路影响食管鳞癌细胞增殖目的:miR-301a-3p在多数肿瘤中发挥促癌基因的效果,在不同的肿瘤中发挥作用的机制不同。本部分研究miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路对食管鳞癌细胞增殖及克隆的影响。方法:通过在食管鳞癌细胞系中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor使其过表达或抑制其表达,用Real time PCR法验证过表达及抑制效果。通过MTT实验和克隆平板实验检测miR-301a-3p对食管鳞癌细胞增殖及克隆形成能力的影响。使用免疫印迹试验检测转染后PI3K/AKT通路中p-AKT/AKT比值,以及下游蛋白BCL-2,BAX的表达变化。在回复实验中使用PI3K特异性抑制剂LY294002处理被miR-301a-3p转染的Eca109细胞系后,再检测p-AKT/AKT比值,以及BCL-2,BAX的表达变化。通过以上实验明确miR-301a-3p对食管鳞癌细胞系Eca109的作用,并验证其调控PI3K/AKT信号通路。结果:1.转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后miR-301a-3p的表达变化。在实验中使用Eca109细胞建立体外细胞模型,使用Real-time PCR检测不同分组中miR-301a-3p的表达情况,结果显示:在实验组中转染miR-301a-3p mimics后,miR-301a-3p表达量显着增高,与阴性对照组的相对表达量分别为:3.96±0.39,1±0.08,具有统计学差异（P<0.01）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组与阴性对照组的相对表达量分别为:0.34±0.08,1±0.13,具有统计学差异（P<0.01）。证实转染成功,可以进行后续的实验。2.miR-301a-3p表达对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力的影响。MTT实验显示,细胞转染48小时后,转染miR-301a-3p mimics的实验组Eca109细胞系和转染Negative Control（NC）mimics的对照组的OD值分别为0.765±0.050vs0.560±0.049（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor后的48小时,实验组和对照组的OD值分别为0.483±0.054 vs0.616±0.040（P<0.05）,证实与对照组相比,Eca109细胞转染miR-301a-3p mimics后增殖能力显着增强,转染miR-301a-3p inhibitor后增殖能力显着下降,证明miR-301a-3p具有促进细胞增殖的作用。在细胞克隆实验中,转染miR-301a-3p mimics的实验组和转染NC mimics的阴性对照组的克隆形成数分别为:201±15 vs 138±12（P<0.05）;在转染miR-301a-3p inhibitor的实验组和对NC inhibitor的对照组中分别为:58±6vs116±12（P<0.05）。证明转染miR-301a-3p mimics后Eca109细胞克隆形成能力显着增强,转染miR-301a-3p inhibitor后Eca109细胞克隆形成能力显着下降。3.miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BAX和BCL-2表达的影响。转染miR-301a-3p mimic实验组Eca109细胞系的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达高于对照组,BAX表达低于对照组（P<0.05）。转染miR-301a-3p inhibitor的实验组中p-AKT/AKT和BCL-2表达低于对照组,BAX表达高于对照组（P<0.05）。4.回复实验:使用LY294002处理miR-301a-3p mimics转染的Eca109细胞后,BCL-2蛋白表达升高,BAX蛋白表达降低,与对照组的Eca109细胞系中BCL-2蛋白,BAX蛋白表达差异具有统计学意义。证明miR-301a-3p通过PI3K/AKT通路调节BCL-2、BAX表达。小结:miR-301a-3p可增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成的能力,通过激活PI3K/AKT通路及下游BCL-2、BAX蛋白在食管鳞癌细胞中促进肿瘤增殖和克隆形成。第三部分miR-301a-3p在食管鳞癌细胞中的作用靶基因的筛选及验证目的:通过第二部分的实验观察到,miR-301a-3p可通过激活PI3K/AKT通路提高食管鳞癌细胞的增殖和克隆能力,但其具体作用的靶基因尚不明确。本部分研究筛选miR-301a-3p靶基因并进行验证,阐明其作用机制。方法:用miRBase软件（http://www.mirbase.org）预测miR-301a-3p靶基因,找到表达受到miR-301a-3p负性调控且在PI3K/AKT通路发挥作用的蛋白PTEN。在17对食管鳞癌患者的肿瘤组织及正常组织中,用Western Blot方法检测PTEN的表达情况,用RT-PCR的方法检测miR-301a-3p的表达,并检测二者之间的相关性。在Eca109细胞中转染miR-301a-3p mimics/inhibitor后,检测靶基因PTEN在细胞中的表达水平。构建含有靶基因PTEN m RNA的3’UTR区的荧光酶报告质粒,通过双荧光素酶报告基因实验,验证miR-301a-3p与PTEN的m RNA的3’UTR区是否直接结合来调控其表达。接下来在Eca109细胞系中进行回复实验,分为四组,并在各组内共同进行MTT实验及克隆形成试验,检测细胞的增殖能力;进一步应用Western Blot方法检测各组细胞中p-AKT/AKT比值,BCL-2和BAX的表达情况。通过以上回复试验,验证PTEN是否能逆转miR-301a-3p在Eca109细胞系的调控作用。结果:1.通过预测发现,miR-301a-3p和PTEN 3’UTR的398-418 nt存在互补结合位点。荧光素酶活性分析结果显示,Eca109细胞中野生型PTEN的荧光活性被miR-301a-3p显着抑制,但miR-301a-3p并不影响Eca109细胞中突变型PTEN的荧光素酶活性,表明miR-301a-3p可以和PTEN进行特异性结合。2.在组织及细胞中miR-301a-3p与PTEN表达呈负相关。收集了17对ESCC组织和正常组织。Western Blot及Real time-PCR结果显示,与正常组织相比,ESCC组织中PTEN蛋白水平降低（P<0.01）,PTEN在食管鳞癌组织中的表达水平与miR-301a-3p的表达呈负相关（R2=0.5945,P<0.01）。在Eca109细胞系中转染miR-301a-3p mimics后,PTEN的表达显着降低（P<0.05）;反之,转染miR-301a-3p inhibitor后,PTEN的表达升高（P<0.01）。3.PTEN可逆转miR-301a-3p对食管鳞癌细胞Eca109增殖能力和克隆形成能力影响。首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关对照组进行实验,转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:MiR-301a-3p mimics+PTEN组的细胞的增殖和克隆形成能力较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组明显降低（P<0.05）。证明PTEN能逆转miR-301a-3p对细胞增殖和克隆形成能力的促进作用。再应用miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及相关的对照组进行实验,在转染一定时间后,进行MTT细胞增殖实验和克隆形成实验。结果显示:miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组的细胞增殖和克隆能力较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组明显增强（P<0.05）。证明si-PTEN与miR-301a-3p inhibitor转染后,能回复miR-301a-3p inhibitor对细胞增殖能力的抑制作用。4.PTEN可回复miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2表达的影响。分组情况与上一步相同,首先应用miR-301a-3p mimics+PTEN组及其相关的对照组进行实验,在转染48小时后,应用Western Blot方法,检测Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的相对表达情况。miR-301a-3p mimics+PTEN组较miR-301a-3p mimics+NC PTEN组p-AKT/AKT比值及BCL-2的相对表达量均降低,BAX相对表达量升高（P<0.05）。结果证明miR-301a-3p能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的表达量升高,BAX的表达量降低,而共转染PTEN后能逆转miR-301a-3p对p-AKT/AKT比值、BCL-2和BAX蛋白表达的作用。同样,在转染48小时后,应用Western Blot方法检测miR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组及其相关的对照组中Eca109细胞中p-AKT/AKT比值,BAX和BCL-2的表达。MiR-301a-3p inhibitor+si-PTEN组较miR-301a-3p inhibitor+NC si-PTEN组p-AKT/AKT比值,BCL-2的相对表达均升高,BAX相对表达降低（P<0.05）。结果证实miR-301a-3p inhibitor能使得p-AKT/AKT比值和BCL-2的相对表达降低,BAX相对表达升高,而共转染si-PTEN后能回复miR-301a-3p inhibitor对信号通路及蛋白的作用。小结:miR-301a-3p可通过特异性靶向结合PTEN调节PI3K/AKT通路促进Eca109细胞增殖。结论:miR-301a-3p在食管鳞癌组织及细胞中表达上调,miR-301a-3p的高表达与食管鳞癌的淋巴结转移、肿瘤长度以及TNM分期相关;miR-301a-3p可促进食管鳞癌细胞增殖和克隆形成;通过激活PI3K/AKT通路,调节下游BCL-2、BAX蛋白表达变化,miR-301a-3p可起到增强食管鳞癌细胞增殖和克隆形成,促进肿瘤生长的作用;miR-301a-3p通过与PTEN的m RNA 3’UTR区靶向结合,抑制其表达,从而促进食管鳞癌细胞增殖。
王兵[6]（2021）在《MTDH在食管鳞癌组织及血清中的表达及其临床预后相关性的实验研究》文中提出目的:食管癌是全世界恶性肿瘤中发病和死亡排名前十之一的肿瘤,疾病早期诊断不易,患者预后较差。近年来研究发现异粘蛋白（Metadherin,MTDH）在人类多种癌症中上调,被报道与人类多种癌症的发生发展密切相关。然而,MTDH在人食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）中的功能意义还不明晰。本研究拟探讨MTDH在ESCC组织和血清中的作用和机制。方法:1.通过生物信息学分析GEO等多种数据库筛选出人ESCC中的差异表达基因MTDH及其与人ESCC中的共表达基因。2.公共数据库明确MTDH在食管癌组织中与正常食管黏膜组织的差异表达,并探索MTDH高低表达是否与患者临床特征有关联。3.应用公共数据库分析MTDH的表达水平与食管癌患者生存的关系。4.将前期得到的差异基因应用R软件进行GO和KEGG富集分析,预测MTDH在人体ESCC中的分子生物学机制。5.公共数据库分析绘制蛋白共表达网络图和MicroRNA表达相关的热图。6.分析与信号通路、共表达蛋白网络的基因以及MicroRNA的相关性。7.应用QRT-PCR、免疫组化实验或酶联免疫吸附实验对ESCC患者的组织和血清的MTDH水平进行检测,并分析其与患者临床特征是否有关联。8.应用统计学中的Kaplan-Meier方法来分析MTDH的表达水平与ESCC患者预后生存的关系,并绘制总生存期和疾病无进展生存期的生存曲线。9.使用COX比例风险模型分析ESCC患者预后风险因素。10.分析其作为ESCC血清诊断标志物的诊断效能,并绘制ROC曲线。结果:1.生信分析显示,MTDH是ESCC的差异表达基因,其在ESCC中显着上调,并且与肿瘤分期及预后生存相关,MTDH高表达的食管癌患者比低表达患者的OS和DFS更短,均有统计学差异（P<0.05）。并预测其参与肿瘤发展的多条信号通路及多项生物过程和功能,并与多种蛋白、MicroRNA相互联系,均有统计学差异（P<0.05）。2.ESCC组织中MTDH的mRNA及蛋白水平均高于癌旁组织（P<0.05）。与患者的G分级、T分期、N分期、M分期及p TNM分期显着相关（P<0.05）,与年龄、性别、饮酒史、吸烟史、肿瘤位置以及肿瘤最大直径均无关（P>0.05）。3.MTDH阳性表达患者的OS为16.262±0.855个月,DFS为14.943±0.981个月;而MTDH阴性表达患者的OS为20.533±1.278个月,DFS为19.857±1.436个月;MTDH表达阳性者的OS（P=0.014）和DFS（P=0.029）均显着低于MTDH表达阴性者。单因素分析显示,MTDH表达（P=0.007）、T分期（P=0.013）、N分期（P=0.028）、M分期（P=0.041）和p TNM分期（P=0.016）显着影响了ESCC患者的预后生存;多因素分析显示,MTDH是独立影响ESCC患者预后生存的危险因素（P=0.020）。4.ESCC患者血清中MTDH和SCC浓度高于健康体检者（P<0.05）。血清MTDH与患者的T分期、N分期、M分期及p TNM分期显着相关（P<0.05）;且血清SCC与患者的N分期、M分期及p TNM分期显着相关（P<0.05）;而与其它的因素均无明显相关性。5.ESCC死亡组患者血清中MTDH浓度高于存活组患者（P<0.001）。6.ROC分析显示,MTDH单独检测、SCC单独检测及两者联合检测的AUC值分别为0.850、0.821和0.927,具有统计学差异（P<0.05）。结论:1.ESCC组织和血清中MTDH表达显着增高,表达的高低与ESCC的G分级、T分期、N分期、M分期、pTNM分期及患者预后不良相关,并且MTDH的高表达是影响ESCC患者预后生存的独立危险因素,血清中MTDH表达可能作为辅助诊断ESCC的生物标志物。2.MTDH在人体内可能参与肿瘤发展的多条信号通路及多项生物学过程和功能,并与多种蛋白、MicroRNA相互联系。3.MTDH参与ESCC的发生发展,是ESCC诊断、治疗以及预测预后的潜在生物标志物。
李晓琳[7]（2020）在《骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗》文中指出食管癌是我国常见病及高发病,全球近一半的食管癌新增和死亡病例均发生在中国,严重影响广大人民群众的健康和社会、经济发展。多数患者就诊时已为局部晚期食管癌,根治性放化疗是其主要治疗手段,但局部失败率较高。乏氧是实体瘤中普遍存在的现象,多项研究证实:食管癌中肿瘤乏氧区域的存在可导致较差的预后。骨桥蛋白（Osteopontin,OPN）作为乏氧相关因子,在多种癌症中表达的增加与肿瘤的发生,发展和转移密切相关,同时OPN表达水平被认为与肿瘤较差的预后相关。但能否作为食管癌乏氧增敏放射治疗疗效的预测因子尚无明确定论。乏氧诱导因子-1α（Hypoxia Inducible Factor-1α,HIF-1α）是乏氧诱导的放疗抵抗的核心研究分子。乳腺癌中OPN可诱导HIF-1α及血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF）高表达,从而使细胞侵袭和转移能力增加。但OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制尚不明确。因此,本研究从临床方向,研究OPN对食管鳞癌放疗增敏疗效及预后的预测价值。并在基础研究方向,探索OPN对食管癌放疗敏感性的影响及机制,并对结果进行验证。从而对局部晚期食管鳞癌患者个体化放疗增敏提供理论依据。目的本课题通过前瞻性临床研究,分析局部晚期食管鳞癌患者OPN表达和乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）的相关性,比较不同OPN表达患者放疗增敏的近期疗效和远期生存,评估OPN的预测价值。通过食管癌细胞体外实验,阐明OPN诱导HIF-1α高表达,对放疗敏感性的影响及作用机制。通过荷瘤鼠体内实验,比较OPN表达不同的肿瘤放疗后生长曲线的差异,以及与HIF-1α等机制分子的相关性分析,验证OPN促进HIF-1α高表达对食管鳞癌放疗敏感性的影响。方法1.本研究前瞻性入组局部晚期食管癌患者。治疗前留取患者血清样本进行OPN检测病理组织标本中免疫组化检测乏氧相关指标OPN、HIF-1α、以及VEGF表达。治疗前行全身PET-CT检查。随机分为甘氨双唑钠（Sodium glycididazole,CMN）联合根治性同步放化疗组（增敏组）和根治性同步放化疗组（对照组）。主要研究终点为客观缓解率（Objective Response Rate,ORR）,次要终点为总生存（Overall Survival,OS）、无进展生存（Progression Free Survival,PFS）和安全性分析。明确OPN对局部晚期食管鳞癌放疗增敏的指导意义。2.通过The Cancer Genome Atlas（TCGA）数据库,提取食管鳞癌相关数据,对比食管癌和正常组织,以及不同分期食管癌之间OPN表达差异,并通过基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis,GSVA）与OPN高表达密切相关的信号通路。3.筛选OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞,通过流式细胞分析检测两组细胞放疗后的基线凋亡能力,通过克隆形成实验检测两组细胞在不同放疗剂量下的基线克隆形成能力。分别构建稳定转染的TE-1 oe-OPN细胞、TE-1 NC细胞和KYSE150 shOPN细胞、KYSE150 NC细胞。通过放疗后克隆形成实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后克隆形成能力的差异。通过TUNEL实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡的差异。通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调和沉默后,食管癌细胞放疗后凋亡蛋白表达的差异。为明确OPN对HIF-1α蛋白表达的影响,在常氧条件下加入不同剂量重组人OPN,通过蛋白免疫印迹实验检测两组细胞HIF-1α及VEGF的表达。并通过蛋白免疫印迹实验检测上调及沉默OPN后食管癌细胞HIF-1α及VEGF的表达。HIF-1α受多条信号通路调控,PI3K和MAPK通路可能是乏氧状态下调控HIF-1α影响放疗敏感性的主要两条通路。为进一步明确OPN调控HIF-1α表达的通路分子,并深入研究分子机制。结合生物信息分析结果,给予TE-1细胞及KYSE150细胞重组人OPN培养后,选择PI3K和MAPK通路抑制剂,蛋白免疫印迹实验检测HIF-1α的表达,筛选OPN主要通过哪一个通路分子调控HIF-1α表达。并通过蛋白免疫印迹实验进一步检测该通路分子及下游分子磷酸化表达。由于乏氧是HIF-1α的主要调控因素,因此在乏氧状态下,通过蛋白免疫印迹实验检测OPN上调及沉默后HIF-1 α的表达,并通过蛋白免疫印迹实验检测通路分子的磷酸化情况,明确OPN和乏氧对HIF-1α调控的协同作用。随后,分别应用该通路分子抑制剂和重组人OPN,对TE-1 NC细胞、TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150NC细胞、KYSE150 shOPN细胞进行放疗后克隆形成能力的挽救实验,TUNEL检测放疗后各组细胞凋亡能力的恢复。4.体外实验构建的稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞以及空白对照组细胞进行裸鼠成瘤。移植瘤放疗后记录肿瘤直径并计算肿瘤体积,比较不同OPN表达肿瘤放疗后生长速度和体积,验证OPN对食管癌放疗敏感性的影响。免疫组化检测不同OPN表达肿瘤组织HIF-1α、p-AKT、VEGF的表达,分析OPN和肿瘤乏氧微环境的相关性。结果1.自2016年至2018年,共入组了 78例患者,其中66例患者纳入进一步统计分析。随机分为甘氨双唑钠联合同步放化疗组（增敏组）和同步放化疗组（对照组）,两组患者之间的基线特征无明显差异。增敏组患者对CMN耐受性良好。增敏组的客观缓解率达到90.32%,对照组的客观缓解率为68.57%。两组之间差异有统计学意义χ2=4.925,P=0.027。然而两组之间的CR率（χ2=0.078,P=0.780）和PR率（χ2=2.344,P=0.126）无明显差异。随访时间截止至2019年11月,两组患者中位的总生存时间为23.37个月,95%CI 18.57-NA。增敏组的中位OS为19.93个月（95%CI 16.33-28）,而在对照组,中位OS尚未达到。增敏组的中位PFS为14.27个月（95%CI 9.57-27.77）,对照组中位PFS为16.23个月（95%CI 10.833-NA）。增敏组和对照组之间的OS（χ2=1.432,P=0.234）及PFS（χ2=0.538,P=0.464）无明显统计学差异。血清OPN相关亚组分析结果显示,入组患者血清OPN中位值为94.87ng/ml,表达范围为9.67-253.47 ng/ml。通过受试者工作特征曲线分析（Receiver operating characteristic curve,ROC）曲线分析血清 OPN 界值为 84.72ng/ml,P=0.002。血清OPN低组ORR率为89.66%,而血清OPN高组ORR率为71.80%,两组之间ORR差异无显着统计学意义（χ2=2.790,P=0.095）。血清OPN高表达患者组,在应用CMN后,较对照组的ORR明显改善（Fisher的精确检验,P=0.033）。而本身血清OPN低表达组患者,应用CMN后,与对照组ORR无差异（Fisher的精确检验,P=0.529）。生存分析结果显示血清OPN高组患者的OS（χ2=17.042,P<0.001）及PFS（χ2=13.563,P<0.001）明显低于OPN低组患者。在增敏组,OPN高表达和低表达亚组之间OS无明显差异（P>0.05）,但在对照组,OPN高表达和低表达亚组OS差异仍非常明显（P<0.001）。本研究检测了 54例入组患者食管癌病理组织的OPN、HIF-1α、VEGF的表达。结果显示组织OPN和血清OPN表达具有相关性r=0.549,P<0.001。在OPN高表达的食管鳞癌患者中,组织HIF-1α表达升高（r=0.537,P<0.001）,VEGF表达略有升高（r=0.271,P<0.050）。进一步分析组织OPN高表达组的ORR率明显低于组织OPN低表达组,差异有明显统计学意义（χ2=9.429,P=0.002）。组织高表达OPN组患者,应用CMN后,其ORR较对照组ORR明显改善（χ2=5.372,P=0.020）,但在组织低OPN表达组患者,应用CMN后,两组ORR无明显差异（Fisher的精确检验,P=1.000）。生存分析结果显示,组织OPN高表达患者的OS明显差于组织OPN低表达组患者（χ2=15.258,P<0.001）。亚组分析结果显示,在应用CMN增敏后,OPN表达的不同患者之间OS无明显差异（P>0.05）。但在对照组,组织OPN表达不同的患者OS差异仍非常明显（P<0.001）。单因素及多因素分析结果显示血清OPN、组织OPN和组织HIF-1α表达均为食管鳞癌患者预后不良的预测因素。2.通过对TCGA数据库中食管鳞癌组织和正常组织的SPP1基因（OPN的基因）表达分析,食管鳞癌中SPP1基因表达较正常组织明显升高（P<0.001）。局部晚期食管鳞癌患者的SPP1基因表达高于早期以及发生转移的晚期患者（P<0.001）。SPP1表达水平高的患者的生存率要明显差于SPP1低表达患者（P=0.004）。SPP1表达升高时,与乏氧及PI3K/AKT通路活化明显相关。3.通过筛选不同OPN表达的4种食管鳞癌细胞系,选择OPN低表达的TE-1细胞和OPN高表达的KYSE150细胞系。放疗后,两组细胞克隆形成能力均明显减低,凋亡明显增加。成功构建稳转OPN高表达的TE-1 oe-OPN细胞以及TE-1 NC细胞,同时构建稳转KYSE150-shOPN细胞和KYSE150NC细胞。TE-1 oe-OPN克隆形成率在放疗2Gy、4Gy、6Gy及8Gy剂量下较TE-1 NC和TE-1明显升高,放疗后凋亡率明显降低;而KYSE150 shOPN细胞放疗后克隆形成能力较KYSE150 NC和KYSE150明显降低,放疗后凋亡率明显升高。TE-1 oe-OPN细胞放疗后凋亡促进蛋白Bax较TE-1 NC和TE-1降低,而凋亡抑制蛋白Bcl-2升高。KYSE150-shOPN细胞放疗后Bax蛋白表达较TE-1 NC和TE-1明显升高,Bcl-2蛋白表达量明显降低。常氧及乏氧下,TE-1细胞和KYSE150细胞分别加入不同剂量人重组OPN处理后,HIF-1α及VEGF蛋白表达均升高,和OPN剂量呈正相关趋势。稳转TE-1 oe-OPN细胞和KYSE150 shOPN细胞的HIF-1α蛋白表达与OPN趋势一致。PI3K抑制剂LY294002可以明显降低由OPN诱导的HIF-1α蛋白表达,且OPN高表达后,PI3K/AKT通路p-ILK、p-AKT、p-P65活性增强。放疗敏感性挽救实验显示,LY294002可以降低TE-1 oe-OPN细胞放疗后克隆形成率,升高凋亡水平,恢复至TE-1 NC水平。在KYSE150 shOPN细胞中,加入重组人OPN,可以恢复其放疗后克隆形成率及凋亡水平至KYSE150 NC水平。4.荷瘤鼠体内实验结果显示,KYSE150肿瘤对照组平均体积为1736.65±102.49 mm3。KYSE150 shOPN细胞成瘤后生长速度及体积较KYSE150及KYSE150 NC略小,但在肿瘤体积至500mm3前各组细胞肿瘤生长速度和体积差异并无统计学意义。KYSE150肿瘤放疗后平均体积为928.88±62.41 mm3,对比KYSE150 shOPN肿瘤放疗后平均体积为688.89±37.94 mm3（P<0.001）。肿瘤生长曲线结果显示在TE-1和TE-1 oe-OPN肿瘤放疗前生长速度及体积无明显差异。放疗后TE-1放疗组肿瘤平均体积为359.04±96.00,放疗后TE-1oe-OPN肿瘤平均体积为873.45±126.65 mm3,明显大于放疗后TE-1肿瘤的体积（P<0.001）。免疫组化结果显示 TE-1 oe-OPN 肿瘤的 HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达的强度和范围较TE-1细胞的肿瘤都明显增强。KYSE15 shOPN肿瘤的HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34表达呈明显降低的趋势。结论临床研究表明,局部晚期食管鳞癌患者中,OPN表达和食管鳞癌乏氧微环境（HIF-1α、VEGF）相关。OPN高表达患者ORR及OS较差,应用CMN增敏可改善ORR和生存。OPN对局部晚期食管鳞癌患者同步放化疗增敏疗效和预后有预测价值。体外研究发现,食管癌TE-1细胞和KYSE150细胞中,常氧下OPN高表达可导致食管鳞癌细胞PI3K/AKT通路磷酸化增强,诱导HIF-1α、VEGF蛋白表达明显升高,导致放疗抵抗。在乏氧状态下OPN诱导HIF-1 α高表达作用得到加强。PI3K抑制剂LY294002可以改善OPN高表达导致的食管鳞癌细胞放疗抵抗。体内研究证实,裸鼠食管癌模型中,OPN和乏氧微环境因子HIF-1α、VEGF、p-AKT、CD34的表达趋势一致。OPN高表达可以促进荷瘤鼠食管鳞癌的放疗抵抗。
康莉[8]（2020）在《食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究》文中研究说明食管鳞癌是原发于食管上皮组织的恶性肿瘤。长久以来,我国食管癌的发病率和死亡率位列世界首位。改善食管鳞癌发病率高和治愈率低的现状,需要全面而深入地探究食管鳞癌发生发展的调控机制。研究表明,SOX2异常表达促进多种肿瘤发生发展。在食管鳞癌中SOX2呈现蛋白水平的高表达和基因水平的异常扩增,但在SOX2高表达的肿瘤样本中,其基因水平的扩增只占少部分,提示我们导致肿瘤中SOX2高表达的机制仍有待研究。因此,本论文主要致力于探究SOX2的蛋白翻译后修饰对其蛋白稳定性的调控,并为精准靶向SOX2高表达的肿瘤治疗提供有力的理论依据。在食管鳞癌细胞中,我们发现SOX2的高表达广泛地受到蛋白稳定性的调控。我们实验室前期工作发现在胚胎干细胞中AKT激酶对SOX2蛋白稳定性具有重要的促进作用。基于AKT激酶通路在肿瘤细胞中广泛激活,我们在多株食管癌细胞系中研究了AKT是否通过调控SOX2蛋白稳定性促进其在食管癌中的高表达。我们证明了AKT是促进SOX2在食管癌细胞中高表达的重要驱动因子,并阐明了AKT在食管癌细胞中促进SOX2蛋白稳定性的分子机制。我们发现AKT通过磷酸化SOX2的T116抑制SOX2的蛋白酶体降解,进一步研究发现AKT是通过抑制泛素连接酶UBR5介导的蛋白酶体降解来促进SOX2蛋白稳定性,并发现UBR5通过催化SOX2的K115泛素化促进其发生蛋白酶体通路介导的降解。此外,我们发现AKT抑制剂能够显着下调SOX2的蛋白水平,并抑制肿瘤细胞的生长和肿瘤干细胞的形成。综上,我们的研究揭示了AKT通过拮抗UBR5促进SOX2在食管癌高表达的新机制,并为通过靶向AKT治疗SOX2高表达的食管癌提供理论依据。在上述工作的基础上,为了深入探究SOX2高表达的分子机制,我们利用激酶抑制剂库在细胞水平上较系统地筛选调控SOX2蛋白水平的其它信号通路。我们发现GSK3β激酶抑制剂能显着下调食管癌细胞中SOX2水平,并且发现GSK3β激酶抑制剂通过下调SOX2蛋白稳定性下调SOX2蛋白水平。我们鉴定了GSK3β催化SOX2的磷酸化位点,发现GSK3β主要通过催化SOX2的251位丝氨酸的磷酸化来抑制SOX2蛋白酶体的降解。进一步的研究表明GSK3β主要通过抑制泛素连接酶复合体CRL4A与SOX2的相互作用,从而促进SOX2的蛋白稳定性。在生理状态下,此通路发挥着维持SOX2在食管基底层干细胞中高表达的重要作用。在病理样本中,GSK3β呈现异常高表达并与SOX2的蛋白水平存在正相关性。我们还通过小鼠荷瘤实验证明GSK3β的抑制剂能够有效的抑制SOX2高表达的食管鳞癌细胞的生长。综上,我们提出了GSK3β-SOX2通路是促进SOX2在生理和病理条件下高表达的新机制,此机制的阐释将有助于为食管鳞癌的精准治疗提供新的指导方案。
胡华芳[9]（2020）在《MicroRNA-182-5p对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响及分子机制》文中认为背景与目的食管癌主要包括食管鳞癌（Esophageal Squamous Cell Carcinoma,ESCC）和食管腺癌两种病理类型,其中ESCC是我国食管癌最主要的类型,约占95%[1]。全球癌症统计报告2018年有572034人数新诊断为食管癌、癌症相关死亡人数为508585[2]。由于肿瘤异质性较高[3,4],并且大多数病人初次诊断时已为晚期,因此食管癌的治疗效果并不理想。目前的治疗方法主要包括手术、放化疗[5],免疫治疗也正在开展临床试验,以期提高病人的5年生存率和生活质量。相关研究认为食管鳞癌的发生是饮食习惯、营养状态、吸烟、饮酒、牙龈卟啉单胞菌感染、基因的扩增或突变等环境因素与基因相互作用的结果[6-8]。越来越多研究结果的发布,让我们认识到食管鳞癌的发生发展并不仅限于这些因素。miRNA是一种在组织中广泛表达的小的非编码单链RNA,参与生物体内诸多过程,miRNA的异常表达与多种疾病的发生相关[9,10],在癌症中可以充当癌基因或抑癌基因的作用。微小RNA-182-5p（miR-182-5p）属于miRNA家族中的一员,已经证实在多种恶性肿瘤的发生发展中发挥着关键的调节作用,并且在不同的瘤种中miR-182-5p的表达水平及调节机制并不完全一致,可以作为恶性肿瘤潜在的治疗靶点以及诊断、预后的生物标志物。而miR-182-5p在食管鳞癌中的研究却鲜有报道,因此我们检测了 ESCC组织和细胞中的miR-182-5p表达水平,以相应的正常食管上皮组织和正常食管上皮细胞为对照,分析并比较了 miR-182-5p的表达水平,探讨了微小RNA-182-5p（miR-182-5p）对食管鳞癌（ESCC）细胞增殖和侵袭的影响,并阐释其可能的分子机制。资料与方法选取2013年6月至2018年5月在郑州大学第一附属医院手术切除的52例ESCC组织及相应的52例正常食管上皮组织,郑州大学第一附属医院食管癌防治重点实验室液氮中保存的ESCC细胞（Eca109、EC9706、TE1、KYSE70和KYSE450）和正常食管上皮细胞Het-1A。临床资料通过医院病案室查阅患者病历获得。采用逆转录定量聚合酶链反应（Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction,RT-qPCR）检测ESCC组织和细胞中 miR-182-5p 的表达。将miR-182-5p抑制剂、miR-182-5p mimic和阴性对照转染食管鳞癌Eca109和TE1细胞,RT-qPCR检测转染后ESCC细胞中miR-182-5p的表达水平,细胞计数试剂盒8检测转染后ESCC细胞的增殖情况,Transwell小室检测ESCC细胞的侵袭能力。采用双荧光素酶报告实验分析miR-182-5p与细胞黏附分子2（cell adhesion molecule 2,CADM2）直接的相互作用,RT-qPCR 检测 CADM2 在 ESCC 组织中的表达,并分析其与miR-182-5p表达的相关性,Western blot检测转染后CADM2、FAK、p-AKT和AKT蛋白的表达。使用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析。结果1.与正常组织相比,ESCC组织中miR-182-5p的表达水平显着高于正常组织,差异均具有统计学意义（P＜0.0001）。2.以ESCC组织中miR-182-5p表达水平的中位数为界值,根据中位数分组后进行生存分析,Log-rank检验分析结果显示miR-182-5p高表达的ESCC病人的5年生存率显着低于miR-182-5p低表达患者,差异具有统计学意义（P＜0.05）。3.相关性分析显示miR-182-5p的表达水平与ESCC病人的TNM分期和淋巴结转移均密切相关（P＜0.05）,与病人的性别、年龄、抽烟史、饮酒史和分化程度均无关（P＞0.05）。4.RT-qPCR分析5株ESCC细胞和1株正常食管上皮细胞中miR-182-5p的表达水平,结果显示5株ESCC细胞中miR-182-5p的表达水平均显着高于正常食管上皮细胞（P＜0.05）。尤其在Eca109和TE1细胞中miR-182-5p显着高表达。5.miR-182-5p抑制剂显着下调Eca109和TE1细胞中miR-182-5p的表达水平（P＜0.0001）,miR-182-5p的表达下调显着抑制Eca109和TE1细胞的增殖和侵袭能力（P＜0.05）,而miR-182-5p mimic显着上调Eca109和TE1细胞中miR-182-5p的表达水平（P＜0.0001）,miR-182-5p的表达上调显着促进细胞的增殖和侵袭能力（P＜0.05）。6.CADM2 mRNA是miR-182-5p的直接作用靶点,ESCC组织中miR-182-5p和CADM2 mRNA的表达水平呈负相关关系（r=-0.5004,P＜0.001）。7.CADM2 mRNA的表达与ESCC病人的性别、年龄、抽烟、饮酒和分化程度均无关（P＞0.05）,但与ESCC病人的TNM分期和淋巴结转移均密切相关（P＜0.05）。以ESCC组织中CADM2 mRNA表达水平的中位数为界值进行分组,结果发现CADM2 mRNA高表达的ESCC病人的生存率显着高于CADM2 mRNA低表达患者,差异具有统计学意义（P＜0.05）。8.下调miR-182-5p表达能显着促进CADM2蛋白的表达,但抑制FAK、p-AKT和AKT的表达水平,相反上调miR-182-5p表达能显着抑制CADM2蛋白的表达,但促进FAK、p-AKT和AKT的表达。结论1.与健康对照相比,miR-182-5p在ESCC组织和细胞中的表达水平均显着升高,能够促进ESCC细胞的增殖和侵袭。2.miR-182-5p可以作为ESCC患者临床分期、淋巴结转移和预后的候选分子标记物。3.ESCC组织中,CADM2 mRNA是miR-182-5p的直接作用靶点,表达水平与miR-182-5p 呈负相关,并通过 miRNA-182-5p/CADM2/FAK/AKT 信号途径调控 ESCC的发展。4.miR-182-5p参与ESCC的发生、发展过程,开发靶向miR-182-5p的药物可能为ESCC病人提供新的临床治疗方向。
谢波[10]（2020）在《HGF通过激活PI3K/AKT信号通路促进食管鳞癌发生和发展机制的研究》文中提出背景食管癌是全球第八大最常见的恶性肿瘤,死亡率在所有类型的肿瘤中排在第六位,且发生率因地域而异。食管癌主要分为鳞状细胞癌（Esophagus Squamous Cell Carcinoma,ESCC）和腺癌。中国是食管癌的高发地区,90%以上的食管癌是ESCC。由于食管癌早期症状不明显,大多数患者在确诊时都已经是中晚期,已经发生淋巴转移和组织浸润,这也是食管癌患者预后不佳的主要原因。尽管在食管癌综合治疗方面取得了一定的进展,但总体存活率仍然很低,五年存活率仅为15-34%。到目前为止,影响食管癌的发展及预后的因素仍然不清楚。因此,寻找食管癌发病和进展的关键分子,完善食管癌发生和发展的分子机理,为食管癌的诊断和治疗提供新的靶点和方向,寻找出食管癌诊断、治疗以及预后的的生物标志物仍然是迫切需要的,对于临床诊断、提供治疗策略具有重大意义。肝细胞生长因子/c-间叶-上皮转化受体酪氨酸激酶（Hepatocyte Growth Factor/c-mesenchymal-epithelial transition receptor tyrosine kinase,HGF/c-MET RTK）信号通路在正常组织中处于失活状态,而在多种类型的恶性肿瘤中则异常激活。相关研究证实抑制HGF/c-MET信号通路可以作为治疗多种癌症类型的有效策略,如非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）肝癌、胃癌、结直肠癌、卵巢癌、膀胱癌、头颈癌、子宫内膜癌等。但是HGF在食管鳞癌中的作用少见报道,我们在前期的工作中发现HGF作为一种多功能的细胞因子,在ESCC中与cyclin E协同高表达,且与ESCC的分化程度、TNM分期密切有关,影响着患者的预后。因此为了研究HGF对ESCC发生和发展的影响及其参与的具体分子机理,从而为临床诊断、治疗ESCC提供新的靶点。本研究主要通过分子信息学研究和体内外实验来探讨HGF对ESCC的影响及其分子机理。第一部分HGF在食管癌中的表达及意义目的:本部分研究主要分析ESCC中的基因表达图谱以及影响其发生和发展的信号通路方法:首先利用RNA-seq方法分析ESCC患者食管癌组织及癌旁组织中的基因表达差异,筛选与ESCC相关基因并分析HGF在食管癌中表达情况,KEGG信号通路分析预测了所筛选基因在与癌症相关信号通路中的富集情况,并利用Real-Time PCR对测序结果进行进一步的验证。进一步利用TCGA数据库分析食管癌中HGF与cyclin E的表达是否存在协同性以及HGF表达高低与患者肿瘤分期和预后的关系。最后利用Real-Time PCR、Western blotting和免疫组化等分子生物学手段分析HGF在ESCC组织及癌旁组织的表达情况。结果:我们发现29个基因在食管癌组织中呈高表达,4个基因在食管癌组织中呈低表达,其中HGF和cyclin E在食管癌组织中均呈高表达。通过KEGG信号通路分析发现PI3K/AKT信号通路在食管癌组织中是激活最明显的信号通路。Real-Time PCR进一步验证了通过RNA-seq分析出的差异表达基因,HGF、cyclin E基因在食管癌组织中均表达上调（p<0.05）。通过TCGA数据库分析发现与对应的癌旁组织相比,食管癌组织中HGF和cyclin E呈高表达并且存在协同性（p<0.01）。TCGA数据库分析结果发现:HGF低表达的食管癌患者的无进展生存期和总体生存时间显着优于对照组,食管癌组织中的HGF表达水平越高,肿瘤的病理分期越晚（p<0.05）。Real-Time PCR、Western blotting和免疫组化等分子生物学分析结果发现,与对应的癌旁组织相比,ESCC组织中的HGF无论是mRNA水平还是蛋白水平呈高表达（p<0.05）。结论:HGF广泛存在食管癌肿瘤细胞中,并且可能通过参与PI3K/AKT信号通路影响食管癌的发生发展,并随着肿瘤的进展HGF的表达也逐渐增加,与患者的无病生存期及总生存时间呈负相关。第二部分 HGF对食管鳞癌细胞生物学功能的影响目的:本部分研究主要探究HGF对ESCC细胞生物学功能的影响,从而为临床将HGF作为ESCC治疗靶点提供新的理论基础。方法:本部分从ESCC细胞水平探究HGF对细胞存活、增殖、侵袭、凋亡以及肿瘤形成的影响。首先,选取2个ESCC细胞系,Real-Time PCR分析HGF基因表达情况,将细胞系分为HGF低表达和高表达,并利用Real-Time PCR、Western blotting和免疫荧光分别从mRNA水平和蛋白水平分析了两个细胞系中HGF的表达和定位。Western blotting 方法检测了 EC9706 和 KYSE-2 中 E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达情况。然后在HGF高表达的细胞系中利用shRNA敲低HGF的表达,在HGF低表达的细胞系中利用cDNA过表达HGF。利用CCK-8试验检测HGF表达变化对ESCC细胞活性的影响;利用克隆形成试验检测HGF表达变化对ESCC细胞增殖的影响;流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期;Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞周期相关蛋白表达的影响;Annexin V试验检测两组细胞系细胞凋亡;利用Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞凋亡相关蛋白表达的影响;Real-Time PCR、Western blotting方法检测了过表达和敲低HGF后细胞系中E-cadherin、N-cadherin和vimentin的表达情况;Transwell试验检测过表达和敲低HGF后细胞系中ESCC细胞迁移和侵袭情况;小鼠皮下移植瘤模型探究过表达和敲低HGF后细胞系ESCC细胞肿瘤形成的情况;HE染色和Tunel试验观察小鼠肿瘤组织细胞的凋亡情况。分析HGF表达的改变对细胞存活、增殖、侵袭、凋亡以及肿瘤形成的影响。结果:Real-Time PCR和实验结果发现,HGF在KYSE-2细胞系中呈低表达,在EC9706细胞系中呈高表达（p<0.01）。Western blotting检测发现EC9706中HGF的蛋白表达水平显着高于KYSE-2（p<0.05）。鉴定HGF高表达与低表达细胞系后,我们利用免疫荧光对两个细胞系中HGF的表达定位进行了分析,结果发现在HGF高表达的EC9706中,HGF主要定位在核里;在HGF低表达的KYSE-2中,HGF主要定位在胞质中。Western blotting检测结果显示与HGF低表达的KYSE-2相比,HGF高表达的EC9706中E-cadherin表达较低,而N-cadherin和vimentin表达较高（p<0.05）,提示HGF高表达的ESCC细胞系更容易发生EMT。利用CCK-8试验检测HGF表达变化对ESCC细胞活性的影响,结果发现HGF的过表达能够显着提高细胞的活性（p<0.05）;与之相反,HGF的敲低能够显着抑制细胞的活性（p<0.05）。克隆形成试验检测结果发现,HGF的过表达能够显着促进细胞的增殖（p<0.01）;HGF的敲低能够显着抑制细胞的增殖（p<0.01）。流式细胞仪检测结果发现,HGF过表达后细胞处在S期的比例显着增多,G1期比例显着减少（p<0.01）;在EC9706中敲低HGF的表达,结果发现HGF的敲低细胞处在S期的比例显着减少,G1期比例显着增多（p<0.05）。Western blotting方法检测HGF表达变化对ESCC细胞周期相关蛋白表达的影响,结果发现HGF过表达能够显着促进KYSE-2中PCNA和Cyclin D1的表达（p<0.05）;HGF的敲低能够显着抑制EC9706中PCNA和Cyclin D1的表达（p<0.05）。利用Annexin V试验检测HGF表达变化对ESCC细胞凋亡的影响,结果发现HGF过表达后细胞凋亡的比例显着减少（p<0.05）;HGF的敲低细胞凋亡比例显着增多（p<0.05）。随后,我们利用Western blotting检测了 HGF表达变化对ESCC细胞凋亡相关蛋白表达的影响,结果发现HGF过表达能够显着抑制KYSE-2中Caspase-7和Caspase-9的表达（p<0.05）;HGF的敲低能够显着促进 EC9706 中 Caspase-7和Caspase-9 的表达（p<0.05）。利用 Real-Time PCR、Western blotting和免疫荧光等分子生物学手段检测HGF表达变化对ESCC细胞EMT相关蛋白表达的影响,结果发现与HGF的过表达后HGF主要聚集在KYSE-2细胞核内,并且能够抑制E-cadherin的表达,促进N-cadherin和vimentin的表达（p<0.05）;HGF的敲低后HGF主要分布在EC9706细胞胞质中,并且能够促进 E-cadherin 的表达,抑制 N-cadherin和vimentin 的表达（p<0.05）。Transwell试验检测两组细胞系中ESCC细胞侵袭情况结果发现,HGF的过表达能够显着促进细胞的侵袭（p<0.05）;HGF的敲低能够显着抑制细胞的侵袭（p<0.05）。我们通过小鼠皮下移植瘤模型探究HGF表达变化对ESCC细胞肿瘤形成的影响。结果发现HGF的过表达能够显着促进肿瘤的形成和生长（p<0.01）;HE染色和Tunel试验显示HGF的过表达能够显着促进肿瘤组织内细胞的增殖,抑制细胞的凋亡（p<0.01）。HGF的敲低能够显着抑制肿瘤的形成和生长（p<0.01）;HE染色和Tunel试验显示HGF的敲低能够显着抑制肿瘤组织内细胞的增殖,促进细胞的凋亡（p<0.01）。结论:本部分研究我们通过体外细胞实验和体内移植瘤模型证明HGF能够促进ESCC细胞的增殖、存活、侵袭,抑制细胞的凋亡,促进ESCC肿瘤的形成。第三部分HGF影响食管鳞癌细胞生物学性的分子机制目的:本部分研究主要探究HGF影响ESCC细胞生物学性的分子机制。方法:我们首先Western blotting和免疫组化方法检测了 ESCC组织、癌旁组织中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况;再用Western blotting方法检测了 ESCC细胞系中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。随后,我们在两个细胞系中改变HGF的表达,检测PI3K/AKT信号通路的激活情况;Western blotting方法检测了过表达或者敲低HGF的ESCC细胞系中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况;免疫组化方法检测小鼠皮下移植瘤中HGF及PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达情况。我们在HGF低表达的细胞系中过表达HGF,再利用PI3K抑制剂处理细胞,在HGF高表达的细胞系中敲低HGF的表达,再利用PI3K激动剂处理细胞。利用克隆形成试验检测HGF表达变化对ESCC细胞增殖的影响;Transwell试验检测两组细胞系中ESCC细胞迁移和侵袭情况;小鼠皮下移植瘤模型探究上述细胞系ESCC细胞肿瘤形成的情况。以此观察细胞增殖、侵袭以及肿瘤形成的能力。结果:Western blotting和免疫组化实验结果显示与对应的癌旁组织相比,ESCC组织中HGF呈高表达,PI3K/AKT信号通路中的AKT、mTOR的磷酸化水平显着增高（p<0.05）,且PI3K/AKT信号通路中上游负调控蛋白PTEN的表达显着降低（p<0.05）。Western blotting实验结果显示与KYSE-2细胞系相比,EC9706细胞系中AKT、mTOR的磷酸化水平显着增高,PTEN的表达显着降低（p<0.05）;此外,我们还发现HGF高表达的EC9706细胞系中cycin E的表达也会异常增高（p<0.05）。Western blotting实验结果显示HGF的过表达会显着促进AKT和mTOR的磷酸化水平,显着抑制PTEN的表达,同时会促进cyclin E的表达（p<0.05）;敲低HGF的表达,我们发现AKT和mTOR的磷酸化水平显着降低,PTEN的表达水平显着增高,同时会抑制cyclin E的表达（p<0.05）。小鼠皮下移植瘤免疫组化实验结果显示HGF过表达能够促进肿瘤中AKT的磷酸化,抑制PTEN的表达（p<0.05）;HGF的敲低能够抑制肿瘤中AKT的磷酸化水平,促进PTEN的表达（p<0.05）。克隆形成实验结果发现PI3K抑制剂则会显着抑制细胞克隆的形成（p<0.01）;而PI3K激动剂剂则会显着促进细胞克隆的形成（p<0.01）。Transwell试验结果发现,HGF过表达能够显着促进细胞的侵袭,而HGF过表达+PI3K抑制剂则会显着抑制细胞的侵袭（p<0.05）;HGF敲低能够显着抑制细胞的侵袭,而HGF敲低+PI3K激动剂剂则会显着促进细胞的侵袭（p<0.05）。小鼠皮下移植瘤模型实验结果显示HGF过表达能够显着促进细胞肿瘤的形成,而HGF过表达+PI3K抑制剂则会显着抑制细胞肿瘤的形成（p<0.01）。HGF敲低能够显着抑制细胞肿瘤的形成,而HGF敲低+PI3K激动剂剂则会显着促进细胞肿瘤的形成（p<0.01）。结论:通过本部分研究,我们证明了 HGF主要作用于PI3K/AKT信号通路的上游,抑制PTEN的表达、促进AKT和mTOR的磷酸化,激活PI3K/AKT信号通路,进而促进ESCC细胞的增殖、侵袭和肿瘤的形成。因此,HGF及其调控的PI3K/AKT信号通路可以作为临床ESCC治疗的潜在靶点。
二、食管癌中AKT和PTEN蛋白表达及其临床相关性研究（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、食管癌中AKT和PTEN蛋白表达及其临床相关性研究（论文提纲范文）
（1）食管癌变过程中PTEN、p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1的表达及其与临床病理参数的关系（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 病例资料 |
| 1.2 主要实验试剂和仪器 |
| 1.3 实验方法 |
| 1.4 结果判读 |
| 1.5 统计学分析 |
| 2 结果 |
| 2.1 PTEN、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1在四组样本中蛋白表达状况 |
| 2.2 PTEN、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1蛋白表达组间差异两两比较 |
| 2.3 PTEN、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1在鳞状细胞癌组中表达的相关性分析 |
| 2.4 ESCC中PTEN、p-mTOR、p-p70S6K、p-4EBP1蛋白表达与临床病理参数之间的关系 |
| 3 讨论 |
| 3.1 p-mTOR及p-4EBP1在食管鳞状细胞癌中高表达 |
| 3.2 p-p70S6K蛋白表达异常是食管癌变过程中的早期事件 |
| 3.3 抑癌基因PTEN在食管鳞状细胞癌中表达降低 |
| 3.4 p-mTOR、p-p70S6K、PTEN与食管鳞状细胞癌临床病理参数相关 |
| 3.5 mTOR及p70S6K相关抑制剂应用 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 mTOR在消化系统肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（2）健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 字符缩略表 |
| 第一部分 文献综述 |
| 综述一 MicroRNA在胃癌中的研究进展 |
| 1 microRNA简介 |
| 2 microRNA与胃癌 |
| 3 microRNA与幽门螺旋杆菌 |
| 4 小结 |
| 参考文献 |
| 综述二 胃癌前病变的西医研究进展及mir-21和PTEN的作用机制 |
| 1 胃癌前状态与胃癌前病变 |
| 2 现代医学对胃癌前病变病因的认识 |
| 3 胃癌前病变的诊断 |
| 4 胃癌前病变的治疗 |
| 5 胃癌前病变动物模型的研究 |
| 6 miR-21、PTEN及PI3K/AKT信号通路 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 综述三 中医对胃癌前病变的研究进展 |
| 1 中医对胃癌前病变概念的认识 |
| 2 中医对胃癌前病变病因病机的认识 |
| 3 现代中医治疗胃癌前病变的研究进展 |
| 4 中医药治疗胃癌前病变的机制研究 |
| 5 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 实验部分 |
| 前言 |
| 第一部分 材料与方法 |
| 1 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 3 统计学分析 |
| 第二部分 结果 |
| 1 大鼠一般情况 |
| 2 大鼠胃黏膜情况 |
| 3 免疫组化法检测胃组织PTEN蛋白表达 |
| 4 RT-PCR检测胃组织miR-21及PTEN mRNA的表达 |
| 第三部分 讨论 |
| 1 健脾清化化瘀汤方药探讨 |
| 2 阳性对照药的选择依据 |
| 3 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠一般行为学及体质量的影响 |
| 4 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠胃黏膜的影响 |
| 5 健脾清化化瘀汤对CAG伴异型增生大鼠miR-21及其靶基因PTEN的影响 |
| 6 对胃癌前病变大鼠模型制备的思考 |
| 7 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 创新点 |
| 致谢 |
| 附录 |
| 个人简历 |
（3）LEF1-ID3-HRAS信号轴促进食管鳞癌增殖、转移及上皮-间质转化的机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 缩略词表 |
| 第一部分 LEF1在食管鳞癌中的功能及机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 第二部分 ID3在食管鳞癌中的功能及机制研究 |
| 一、引言 |
| 二、材料与方法 |
| 三、结果 |
| 四、讨论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 |
| LEF1在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| ID蛋白在肿瘤中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 在读期间发表论文和参加科研工作情况 |
| 致谢 |
（4）基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一章 PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及PTEN在肠癌组织中的含量 |
| 1. 免疫组化法检测临床标本中PTEN、PI3K、mTOR、Akt蛋白的含量 |
| 1.1 临床标本采集 |
| 1.2 免疫组化试剂 |
| 1.3 免疫组化仪器设备 |
| 1.4 免疫组化试验方法 |
| 1.5 免疫组化结果判读 |
| 2. q-PCR检测临床标本中PTEN、PI3K、mTOR、Akt mRNA的含量 |
| 2.1 材料与分组 |
| 2.2 实验仪器及材料 |
| 2.3 实验方法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 免疫组化法检测pTEN及PI3K/AKT/mTORt通路蛋白在肿瘤及癌旁组织表达量 |
| 4.2 q-PCR检测PTEN及PI3K/AKT/mTORt通路相关蛋白在肿瘤及癌旁组织中表达量 |
| 5. 本章小结 |
| 第二章 固正消癌方对PI3K/AKT/mTOR通路蛋白及PTEN基因的影响 |
| 1. 实验准备 |
| 2. 实验方法 |
| 2.1 裸鼠皮下大肠癌模型建立 |
| 2.2 分组 |
| 2.3 给药 |
| 2.4 实验观察项目 |
| 2.5 瘤体采集 |
| 2.6. Western Blot法 |
| 2.7. 免疫组化法 |
| 3. 统计分析 |
| 4. 实验结果 |
| 4.1 固本消癌方对裸鼠肠癌皮下种植瘤的影响 |
| 4.2 固本消癌方对荷瘤鼠模型下PI3K-AKT-mTOR通路相关蛋白及PTEN的影响 |
| 5. 本章小结 |
| 第三章 讨论 |
| 第四章 总结 |
| 1. 全文结论 |
| 2. 不足与展望 |
| 2.1 不足 |
| 2.2 展望 |
| 参考文献 |
| 第五章 综述 PI3K/AKT/mTOR通路及PTEN与肠癌的相关性 |
| 参考文献 |
| 附录 中英对照表 |
| 攻读硕士学位期间取得的学术成果 |
| 致谢 |
（5）MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| ABSTRACT |
| 英文缩写 |
| 引言 |
| 第一部分 miR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及临床意义 |
| 前言 |
| 材料与方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第二部分 miR-301a-3p通过调控PI3K/AKT通路影响食管鳞癌细胞增殖 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 第三部分 miR-301a-3p在食管鳞癌细胞中的作用靶基因的筛选及验证 |
| 前言 |
| 材料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 小结 |
| 参考文献 |
| 结论 |
| 综述 miR-301a在良恶性疾病中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（6）MTDH在食管鳞癌组织及血清中的表达及其临床预后相关性的实验研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 中英文缩略词表 |
| 前言 |
| 第1章 材料与方法 |
| 1.1 一般资料 |
| 1.2 诊断标准 |
| 1.2.1 食管鳞状细胞癌确诊标准 |
| 1.2.2 食管鳞癌位置分类标准(见表 1) |
| 1.2.3 食管癌TNM分期标准(见表 2) |
| 1.2.4 食管鳞癌的组织学分级(见表 3) |
| 1.2.5 食管鳞癌的病理TNM分期(pTNM)预后分组(见表 4) |
| 1.3 纳入标准 |
| 1.4 排除标准 |
| 1.5 实验试剂耗材及相关仪器 |
| 1.5.1 实验主要试剂和耗材(见表 5) |
| 1.5.2 实验主要仪器(见表 6) |
| 1.6 实验方法 |
| 1.6.1 资料的统计与收集 |
| 1.6.2 实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time PCR, QRT-PCR) |
| 1.6.3 免疫组化(Immunohistochemistry,IHC) |
| 1.6.4 酶联免疫吸附实验(Enzyme Linked Immunosorbent Assay, ELISA) |
| 1.6.5 生物信息学分析 |
| 1.7 统计学分析及处理 |
| 1.8 技术路线图 |
| 第2章 研究结果 |
| 2.1 基于公共数据库探索 MTDH 在食管癌组织和食管正常黏膜组织中的表达水平、临床意义及相关机制 |
| 2.1.1 聚类分析筛选食管鳞癌样本的差异表达基因 |
| 2.1.2 MTDH 在不同肿瘤组织中的表达 |
| 2.1.3 食管癌中 MTDH 的表达差异水平 |
| 2.1.4 MTDH与食管癌患者临床病理资料的关系 |
| 2.1.5 基于公共数据库对 MTDH 预后生存分析结果 |
| 2.1.6 食管鳞癌差异基因的富集分析结果 |
| 2.1.7 蛋白互作分析结果 |
| 2.1.8 MTDH 与富集通路和蛋白互作网络中基因的相关性分析结果 |
| 2.1.9 MTDH与MicroRNA相关性分析结果 |
| 2.2 MTDH在食管鳞癌组织中的表达情况 |
| 2.2.1 食管鳞癌组织中MTDH在 m RNA水平上的表达情况 |
| 2.2.2 食管鳞癌组织中MTDH在蛋白水平上的表达情况 |
| 2.2.2.1 免疫组化的结果 |
| 2.2.2.2 MTDH在食管鳞癌的表达情况与临床病理特征的关系 |
| 2.2.2.3 食管鳞癌组织中MTDH表达与患者生存之间的关系 |
| 2.2.2.4 影响食管鳞癌患者术后生存时间的COX回归分析 |
| 2.3 MTDH在食管鳞癌患者及正常人血清中的表达情况 |
| 2.3.1 食管鳞癌组和健康体检组的一般资料 |
| 2.3.2 食管鳞癌组和健康体检组中血清MTDH和 SCC水平的比较 |
| 2.3.3 食管鳞癌患者血清MTDH和 SCC表达与临床病理特征的关系 |
| 2.3.4 食管鳞癌患者死亡组和存活组的血清MTDH、SCC水平的比较 |
| 2.3.5 食管鳞癌患者血清 MTDH、SCC 的诊断价值分析结果 |
| 第3章 讨论 |
| 第4章 结论 |
| 参考文献 |
| 附录Ⅰ知情同意书 |
| 综述 RNA结合蛋白MTDH在消化系肿瘤的研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 在学期间主要研究成果 |
（7）骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 符号说明 |
| 第一部分: OPN对局部晚期食管鳞癌患者放疗疗效和预后预测价值分析 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第二部分: OPN通过PI3K/AKT诱导HIF-1α高表达促进食管癌放疗抵抗的体外研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 第三部分: OPN诱导HIF-1α高表达促进食管癌放疗抵抗的体内研究 |
| 前言 |
| 资料和方法 |
| 结果 |
| 讨论 |
| 结论 |
| 附图表 |
| 附件Ⅰ |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 攻读博士学位期间发表的论文目录 |
| 学位论文评阅及答辩情况 |
| 外文论文1 |
| 外文论文2 |
（8）食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 第一章 文献综述 |
| 第一节 转录因子SOX2的研究进展 |
| 1.1.1 SOX家族成员简介 |
| 1.1.2 SOX2功能的研究进展 |
| 1.1.2.1 SOX2在胚胎发育中的作用 |
| 1.1.2.2 SOX2在成体干细胞中的作用 |
| 1.1.2.3 SOX2与肿瘤的发生发展 |
| 1.1.3 SOX2蛋白的翻译后修饰 |
| 第二节 食管癌的研究进展 |
| 1.2.1 食管组织结构 |
| 1.2.2 食管癌的分型 |
| 1.2.3 SOX2在食管鳞癌中的作用 |
| 第三节 磷酸化修饰与肿瘤的研究进展 |
| 1.3.1 磷酸化修饰简介 |
| 1.3.2 磷酸激酶在肿瘤治疗中的作用 |
| 1.3.3 磷酸激酶AKT的研究进展 |
| 1.3.3.1 磷酸激酶AKT简介 |
| 1.3.3.2 AKT与肿瘤的发生发展 |
| 1.3.4 磷酸激酶GSK3β的研究进展 |
| 1.3.4.1 磷酸激酶GSK3β简介 |
| 1.3.4.2 GSK3β与肿瘤的发生发展 |
| 第四节 课题研究的意义 |
| 第二章 实验材料与方法 |
| 第一节 实验材料 |
| 2.1.1 实验器材 |
| 2.1.2 实验试剂与耗材 |
| 2.1.3 试剂配方 |
| 2.1.4 表达质粒 |
| 2.1.5 引物序列 |
| 2.1.6 抗体信息 |
| 2.1.7 抑制剂信息 |
| 2.1.8 细胞系 |
| 2.1.9 小鼠类型 |
| 第二节 实验方法 |
| 2.2.1 RNA抽取和c DNA获取 |
| 2.2.2 分子克隆 |
| 2.2.3 细胞培养 |
| 2.2.4 细胞转染 |
| 2.2.5 稳定表达细胞系的建立 |
| 2.2.6 细胞增殖检测 |
| 2.2.7 免疫共沉淀 |
| 2.2.8 Western blot |
| 2.2.9 免疫染色 |
| 2.2.10 组织HE染色 |
| 2.2.11 免疫组化染色 |
| 2.2.12 体外纯化蛋白 |
| 2.2.13 peptide-pulldown |
| 2.2.14 体外磷酸化反应 |
| 2.2.15 小鼠异种移植模型 |
| 2.2.16 提取基因组DNA |
| 第三章 AKT驱动食管鳞癌中SOX2 蛋白高表达并促进肿瘤干细胞形成的分子机制研究 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.2.1 食管鳞癌中SOX2 的蛋白水平不完全依赖SOX2 的基因扩增 |
| 3.2.2 食管鳞癌中AKT正控SOX2 的蛋白水平 |
| 3.2.3 食管鳞癌中SET7对SOX2 蛋白没有显着调控 |
| 3.2.4 AKT促进SOX2 的蛋白稳定性 |
| 3.2.5 食管鳞癌中SOX2对AKT不存在反馈调节机制 |
| 3.2.6 AKT通过磷酸化SOX2-T116 促进SOX2 蛋白稳定性 |
| 3.2.7 筛选介导AKT促进SOX2 稳定的泛素连接酶 |
| 3.2.8 UBR5 促进SOX2 的泛素化降解 |
| 3.2.9 AKT通过抑制UBR5与SOX2 的互作促进SOX2 的稳定性 |
| 3.2.10 UBR5 催化SOX2的K115 的泛素化 |
| 3.2.11 UBR5 通过调控SOX2 影响细胞增殖和肿瘤干细胞形成 |
| 3.2.12 AKT抑制剂显着遏制肿瘤干细胞的形成能力 |
| 3.2.13 AKT通过调控SOX2 蛋白影响肿瘤干细胞的形成 |
| 3.3 总结与讨论 |
| 3.3.1 AKT-SOX2 调控通路的广谱性 |
| 3.3.2 多种泛素连接酶调控SOX2的蛋白稳定性 |
| 3.3.3 AKT抑制剂对食管鳞癌发生发展的影响 |
| 第四章 GSK3β促进食管基底层干细胞和食管癌中SOX2 蛋白稳定性的分子机制研究 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.2.1 筛选调控SOX2蛋白的磷酸激酶 |
| 4.2.2 抑制GSK3β的活性促进SOX2 的泛素化降解 |
| 4.2.3 GSK3β促进SOX2 蛋白稳定性 |
| 4.2.4 GSK3β对 SOX2 的调控依赖于其激酶活性 |
| 4.2.5 GSK3β对 SOX2 的调控不依赖于AKT |
| 4.2.6 质谱检测GSK3β磷酸化SOX2 的位点 |
| 4.2.7 GSK3β磷酸化SOX2的S251 位点 |
| 4.2.8 GSK3β通过磷酸化SOX2-S251 促进其稳定性 |
| 4.2.9 筛选介导GSK3β促进SOX2 稳定的泛素连接酶 |
| 4.2.10 食管鳞癌中CRL4A复合体调控SOX2 蛋白稳定性 |
| 4.2.11 抑制GSK3β活性促进CUL4A与 SOX2 的相互作用 |
| 4.2.12 激活态的GSK3β和 SOX2 在食管基底层存在共定位 |
| 4.2.13 小鼠食管基底层存在Gsk3β对 Sox2 的调控作用 |
| 4.2.14 食管鳞癌中GSK3β和 SOX2 蛋白异常高表达并呈正相关 |
| 4.2.15 食管鳞癌中GSK3β转录水平异常激活 |
| 4.2.16 GSK3β通过调控SOX2 影响细胞增殖 |
| 4.2.17 GSK3β抑制剂影响小鼠荷瘤生长 |
| 4.3 总结与讨论 |
| 4.3.1 CRL4A复合体介导GSK3β调控SOX2 蛋白稳定性的机制探究 |
| 4.3.2 GSK3β-SOX2 通路的异常对食管鳞癌发生发展的影响 |
| 4.3.3 AKT-GSK3β通路对SOX2 蛋白稳定性的影响 |
| 4.3.4 GSK3β抑制剂对食管鳞癌的作用 |
| 附录 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 科研成果 |
（9）MicroRNA-182-5p对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响及分子机制（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 主要中英文缩略词表 |
| 引言 |
| 1.材料与方法 |
| 2.结果 |
| 3.讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 MicroRNA在食管癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历及论文发表情况 |
| 致谢 |
（10）HGF通过激活PI3K/AKT信号通路促进食管鳞癌发生和发展机制的研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 前言 |
| 第一部分 HGF在食管癌中的表达及意义 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第二部分 HGF对食管鳞癌细胞生物学功能的影响 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 第三部分 HGF影响食管鳞癌细胞生物学性的分子机制 |
| 引言 |
| 1. 材料与方法 |
| 2. 结果 |
| 3. 讨论 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 综述: 消化道恶性肿瘤治疗新靶点HGF/c-MET的研究进展 |
| 参考文献 |
| 英文缩写词表 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
四、食管癌中AKT和PTEN蛋白表达及其临床相关性研究（论文参考文献）
- [1]食管癌变过程中PTEN、p-mTOR、p-p70S6K及p-4EBP1的表达及其与临床病理参数的关系[D]. 刘小红. 山西医科大学, 2021(01)
- [2]健脾清化化瘀汤对HP相关PLGC大鼠胃黏膜miR-21及其靶基因PTEN表达的影响[D]. 李一桐. 北京中医药大学, 2021(08)
- [3]LEF1-ID3-HRAS信号轴促进食管鳞癌增殖、转移及上皮-间质转化的机制研究[D]. 王新宇. 中国人民解放军海军军医大学, 2021(01)
- [4]基于PI3K/AKT/mTOR通路探讨固正消癌方调节PTEN治疗大肠癌的作用机制[D]. 陈雪. 南京中医药大学, 2021(01)
- [5]MiR-301a-3p在食管鳞癌组织和细胞中的表达及调节细胞增殖的功能和作用机制[D]. 张难. 河北医科大学, 2021
- [6]MTDH在食管鳞癌组织及血清中的表达及其临床预后相关性的实验研究[D]. 王兵. 甘肃中医药大学, 2021(01)
- [7]骨桥蛋白通过PI3K/AKT通路上调HIF-1α表达促进食管癌放疗抵抗[D]. 李晓琳. 山东大学, 2020(04)
- [8]食管鳞癌中AKT和GSK3β驱动SOX2蛋白高表达的分子机制研究[D]. 康莉. 华东师范大学, 2020(02)
- [9]MicroRNA-182-5p对食管鳞癌细胞增殖和侵袭的影响及分子机制[D]. 胡华芳. 郑州大学, 2020(02)
- [10]HGF通过激活PI3K/AKT信号通路促进食管鳞癌发生和发展机制的研究[D]. 谢波. 苏州大学, 2020(06)