农杆菌介导的β-葡萄糖醛酸酶基因向巴戟天的转化

一、农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究（论文文献综述）

王亚榕^[1]（2020）在《党参果聚糖合成关键酶基因Cp1-SST启动子功能分析及多糖合成调控相关转录因子筛选》文中认为目的:潞党参产于上党盆地,为山西道地药材,具有补中益气、健脾益肺的功效。课题组前期从党参中克隆得到蔗糖:蔗糖1-果糖基转移酶（sucrose:sucrose 1-fructosyltransferase,Cp1-SST）,该基因可响应干旱胁迫且在果聚糖合成代谢中发挥重要作用。目前党参基因相关的研究已经起步,但是从转录调控方向研究党参果聚糖的生物合成途径尚不明确。本文从Cp1-SST的亚细胞定位出发,探究Cp1-SST基因对干旱胁迫响应及相关糖代谢的机制,克隆Cp1-SST基因的启动子并对其序列进行功能分析以及冷胁迫处理,分析其对下游基因Cp1-SST的启动作用,同时对党参转录组数据库进行党参多糖合成相关转录因子的筛选,再结合Cp1-SST基因启动子元件分析的结果筛选转录因子,为阐明党参果聚糖合成调控的分子机制提供依据,并为探讨党参道地性形成机制奠定理论基础。方法:1.通过无缝克隆技术将Cp1-SST基因克隆至pHBT-GFP-NOS载体上,获得1-SST-GFP植物瞬时表达融合载体。利用PEG-Ca2+介导法转化拟南芥原生质体,利用荧光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位。2.采用CTAB区室法对党参基因组DNA进行提取。以党参基因组DNA为模板,利用Tail-PCR技术克隆Cp1-SST基因启动子（p1-SST）序列,并利用在线分析软件PLACE和PlantCARE对启动子中的顺式作用元件进行综合分析。克隆p1-SST全长,并构建重组载体pCAMBIA1381-p1-SST,转化农杆菌GV3101,通过菌液真空灌注法侵染烟草叶片,共培养后,进行GUS化学组织染色,观察烟草叶片的染色反应情况。3.课题组前期对党参转录组进行测序,通过数据分析筛选出相对表达量差异大的基因。采集党参拉蔓期、花铃期、盛花期、采收期这四个不同生长时期的党参根部,及党参盛花期的根、茎、叶、花、果不同的发育部位,进行RNA的提取,并反转录成cDNA,作为转录因子筛选的模板。通过荧光定量PCR分析,筛选出多糖合成相关的转录因子。结果:1.构建pHBT-1-SST-GFP重组质粒,表达1-SST-GFP融合蛋白,通过荧光共聚焦显微镜观察蛋白亚细胞定位。结果显示,Cp1-SST定位于叶绿体中。2.以党参基因组DNA为模板,利用Tail-PCR技术克隆得到Cp1-SST基因启动子序列长747 bp。利用在线分析软件PLACE和PlantCARE进行综合分析,Cp1-SST基因启动子序列中除启动子保守序列TATA-box、CAAT-box、增强子外,还包括MYB结合位点、脱水响应元件、低温响应元件等多种元件。构建重组载体pCAMBIA1381-p1-SST并转化农杆菌GV3101,真空灌注侵染烟草叶片,化学组织染色结果显示,35S::GUS（阳性对照）的烟草叶片能检测到GUS染色反应;::GUS（阴性对照）的烟草叶片未能检测到GUS染色反应;p1-SST::GUS的烟草叶片也能检查到GUS染色反应。3.对党参转录组测序后的各基因数据分析进行初步筛选,以党参不同发育时期根及同一生长时期不同组织为材料进行荧光定量PCR分析,筛选出多糖合成相关的基因。结果显示,经过荧光定量PCR筛选后,其中Unigene13082All、CL1353.contig1All、Unigene12984All、CL906.Contig2All、CL2094.Contig2All其相对表达量显着性最高。结论:1.Cp1-SST亚细胞定位于叶绿体中。结合课题组前期研究结果,推测Cp1-SST基因在根中表达,之后可能转移至蔗糖合成主要场所——叶绿体中发挥作用,为进一步合成果聚糖做准备。本文为Cp1-SST发挥功能的作用机制提供方向,也为系统地研究党参植物形态建成、生长发育甚至逆境耐性等机制奠定基础。2.利用Tail-PCR技术克隆Cp1-SST基因启动子序列长747 bp,PLACE和PlantCARE综合分析,p1-SST具备多个启动子保守序列,还有多种顺式作用元件,结构完整。构建表达载体pCAMBIA1381-p1-SST,侵染烟草进行瞬时表达分析,p1-SST::GUS的烟草叶片检查到GUS染色反应,说明p1-SST能启动下游GUS基因在烟草中表达,同时也说明p1-SST具备启动子活性,可启动下游基因Cp1-SST的表达。3.经过荧光定量PCR分析筛选后,基因Unigene12984All、CL906.Contig2All、CL2094.Contig2All可能与党参多糖的合成呈负相关;而基因CL1353.contig1All与多糖的合成相关。根据上述基因在党参转录组数据注释,可能与p1-SST存在互作关系。

宋琦^[2]（2015）在《活性氧通过抗氧化系统提高黄芩药材质量》文中研究指明药用植物黄等Scutellaria baicalensis Georgi喜光、耐旱、耐寒,适应环境能力强,分布范围广,药材具有明显的道地性。黄芩素是黄芩中活性最强,是道地黄芩最主要的化学成分指标。研究和实践证明干旱和强光照等逆境是促进黄芩质量形成的主要因素。植物在环境胁迫下可产生大量的活性氧,诱导次生代谢产物合成,提高药材的质量。黄芩鲜根是活的生命体,根也是药用部位,本研究以黄芩鲜根为研究对象,探讨了 H202和活性氧载体Na2S204对黄芩药材质量的影响及机制。一、H2O2对黄芩药材质量的影响及机制1、0.002μmol/L、0.2μmol/L 和 20μmol/L H2O2 处理黄芩鲜根后,超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性略有下降。第3-5天高中剂量H2O2处理的黄芩根过氧化氢酶（CAT）活性下降了 71.4～85.7%。SOD、POD和CAT活性降低,使H2O2大量积累。2、H2O2可显着增强苯丙氨酸转氨酶（PAL）的活性和基因表达,特别是第5天PAL活性提高了 2.7倍,从而促进黄酮类成分的合成。H202也改变了黄芩素7-O-葡萄糖醛酸基转移酶（UBGAT）及β-葡萄糖苷酸酶（GUS）的活性变化,促进苷类物质向苷元转化。不同浓度的H202在不同时期显着增加或降低UBGAT和GUS的基因表达,其中第5天GUS活性提高了 3倍。3、0.002μmol/L和0.2μmol/L的H2O2处理组黄酮苷都有一定程度的升高,在第3天时黄芩苷的含量从6.28%升到6.80%,汉黄芩苷的含量从3.35%升到4.29%。20μmol/L H2O2处理组不同的是黄酮苷含量下降,而苷元类成分含量显着升高,特别是在第7天时,黄芩苷的含量从原来的6.82%降到6.15%,汉黄芩苷的含量从3.43%降到3.40%,但黄芩素的含量从0.19%升高到0.57%,汉黄芩素的含量从0.1 1%升高到0.30%。二、Na2S2O4对黄芩药材质量的影响及机制1、Na2S2O4 为O2-的载体。0.004μmol/L、0.4μmol/L 和 40μmol/L Na2S204处理黄芩鲜根后SOD酶活性略有下降,第3天到第9天CAT酶、POD酶活性显着降低,特别是第3天到第5天CAT酶活性降低了 80%-85%。SOD、POD和CAT活性降低,使H2O2大量积累。2、Na2S2O4处理组对PAL活性几乎无影响,但0.004μmol/L和0.4μmol/L Na2S2O4使PAL基因表达略有增加,40μmol/L Na2S2O4显着促进了 PAL基因表达,第3天PAL基因表达增强了 4.3倍,从而促进黄酮类成分的合成。Na2S2O4 处理组能够改变UBGAT和GUS的活性,促进苷类物质向苷元转化,但迟于H2O2处理组,因此Na2S2O4可能通过H2O2发挥作用。不同浓度的Na2S2O4在第3天显着增加或降低UBGAT和GUS的基因表达,但未显现剂量关系。3、Na2S2O4对PPO酶活性的影响迟于对抗氧化酶和PAL基因表达的影响。在处理第5天,0.004μmol/L和0.4μmol/L Na2S2O4处理组使PPO酶活性提高了 60～80%,促进多余的黄酮消除;40μmol/L Na2S2O4处理组PPO酶活性降低了 60%,促进黄酮的积累。4、0.004μmol/L和0.4μmol/L Na2S2O4处理组黄酮苷都有一定程度的升高,在第3天时变化最为显着,黄芩苷的含量从6.28%升到6.84%,汉黄芩苷的含量从3.35%升到4.12%,增加幅度高于苷元。40μmol/L Na2S2O4处理组黄酮苷含量下降,而苷元类成分含量显着升高,特别是在第3天,黄芩苷的含量从6.28%降到5.21%,汉黄芩苷的含量从3.35%降到2.83%,黄芩素的含量从0.28%升高到1.96%,汉黄芩素的含量从0.14%升高到1.24%,分别达到7倍以上。H2O2和Na2S2O4通过降低黄芩体内的抗氧化酶活性,使具有信使作用的H2O2大量积累,增强PAL的活性和摧因表达,调节GUS和UBGAT基因的表达和活性,加强了黄酮的合成和转化。最后,通过PPO调节黄酮的含量,维持氧化平衡。在活性氧的作用下,次生代谢产物含量显着升高,特别是活性较强的黄芩素等苷元类成分大幅度提高,提高了黄芩药材的质量。

邓少东^[3]（2013）在《巴戟天低聚糖益脑作用机制研究》文中进行了进一步梳理目的:本设计以巴戟天中低聚糖类成分为研究对象,结合导师组前期研究基础开展巴戟天药材中低聚糖类成分的质控研究,及其低聚糖部位提取、纯化工艺研究,进一步完善巴戟天药材的质控体系。采用动物体内及体外等实验方法,考察巴戟天低聚糖部位及其主要有效成分巴戟甲素的在体肠吸收机制、对肝脏中CYP3A4酶代谢的影响,以期为巴戟天低聚糖类成分的口服制剂研究和开发提供科学依据,并为其药代动力学和药效学的进一步研究奠定基础。采用拟阿尔海茨默（AD）动物模型,探讨巴戟天低聚糖部位及其主要有效成分巴戟甲素的抗AD药效及作用机制研究,为其抗AD新药研究与开发提供研究基础。方法:1巴戟天低聚糖有效部位质控研究采用亲水作用色谱-蒸发光散射检测法建立巴戟天中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素等5种低聚糖的含量测定方法。采用正交试验法优选巴戟天低聚糖的提取工艺,以巴戟天低聚糖类提取物的出膏率、低聚糖含量以及其主要的活性成分巴戟甲素、耐斯糖为考察指标,进行多指标综合评价分析,优选出最佳提取工艺采用活性炭与D-900离子交换树脂柱层析结合溶剂法对巴戟天低聚糖提取物进行纯化,以HPLC-UV-ELSD、UV、LC-MS等方法检测蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素、低聚糖等指标的含量及纯度。2巴戟天低聚糖的药代动力学研究采用大鼠体肠单向灌流法研究巴戟天低聚糖部位及其主要有效成分巴戟甲素在大鼠肠道中的吸收转运机制,考察蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖和巴戟甲素等5种低聚糖类成分的大鼠肠吸收特点,确定各成分的最佳吸收部位,并考察了 P-gp对巴戟天低聚糖类成分吸收的影响。利用β-D-呋喃果糖苷酶对巴戟甲素进行水解,确定巴戟甲素是否β-D-呋喃果糖苷酶的底物,同时确定巴戟甲素的酶水解产物,并初步研究其酶促反应动力学。以肝脏CYP3A4酶的探针底物氨苯砜,考察不同剂量巴戟天低聚糖提取物及其主要活性成份巴戟甲素对大鼠肝脏CYP3A4活性的影响,以预测其联合应用CYP3A4亚型酶代谢的药物时发生药物相互作用的可能性。3巴戟天低聚糖对AD模型大鼠的影响采用D-半乳糖联合Aβ 25-35制备拟阿尔海茨默大鼠模型,连续给予巴戟天提取物（BT）、巴戟天低聚糖部位（BD）、巴戟甲素（BJ）28 d后,采用Morris水迷宫进行空间学习记忆能力检测,考察给药前后对AD模型大鼠的体重和脏器系数等的影响;采用试剂盒酶-标仪法测定AD大鼠脑海马区及皮质区中超氧化歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽还原酶（GSH-Px）等氧化指标,以及乙酰胆碱（Ach）、乙酰胆碱酯酶（TchE）、Na+/K+-ATPase、谷氨酸（Glu）、γ-氨基丁酸（GABA）、NO、NOS等指标的含量;采用HPLC-ECD法检测AD大鼠脑海马区及皮质区中多巴胺（DA）、去甲肾上腺素（NE）、肾上腺素（E）、5-羟色胺（5-HT）等单胺类神经递质水平,及其相关代谢产物5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、高香草酸（HVA）、3,4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、左旋多巴（L-DOPA）的含量;采用免疫蛋白印迹法（Westernblot）考察BJ、BD、BT对AD模型大鼠海马区中APP、Tau、Caspase-3、SYP蛋白表达的影响。结果:1巴戟天低聚糖有效部位质控研究巴戟天中蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素等5种低聚糖分别在2.128～21.28 μ g（r= 0.9993）,1.864～18.64 μ g（r=0.9996）,1.92～19.2 μ g（r=0.9998）,1.912～19.12 μ g（r=0.9995）,2.368～23.68 u g（r=0.9994）线性关系良好,其回收率在92.81%～102.8%（n=6）之间。不同产地巴戟天药材含量测定结果显示,蔗糖、蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素的含量分别在 1.25%～6.07%、0.57%～6.06%、1.61%～6.82%、2.41%～7.71%、3.84%～10.10%之间。巴戟天低聚糖的提取工艺研究中各因素对出膏率、低聚糖、巴戟甲素及耐斯糖提取率的影响程度依次为:溶剂中乙醇体积分数>提取时间>液固比>提取次数。各因素对实验结果均无显着性影响。从工业生产提高生产效率的角度出发,优选出的最佳工艺条件为A2B1C2D2,即用15倍量的40%乙醇,提取2次,每次1 h。巴戟天低聚糖部位纯化后各指标成分含量均有显着提高,纯化工艺重现性良好。2巴戟天低聚糖的药代动力学研究巴戟甲素在大鼠体肠单向灌流研究结果表明巴戟甲素为全肠道吸收的药物,各肠段存在吸收差异,其吸收速率按十二指肠、空肠、回肠和结肠的顺序依次下降。十二指肠、空肠、回肠和结肠的药物累积吸收量随灌流液药物浓度的增加而近似线性地增加,但吸收速率常数基本不变,表明巴戟甲素在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收以被动扩散方式为主,其吸收动力学符合一级过程。P-gp抑制剂对巴戟甲素肠吸收的影响考察结果表明P-gp对巴戟甲素有肠道外排作用,可减少其肠吸收,说明巴戟甲素可能是P-gp的底物。巴戟甲素酶水解研究确定了巴戟甲素为β-D-呋喃果糖苷酶的底物,其水解后得到的单一产物为β-D-呋喃果糖。初步得到该酶促反应的Michaelis-Menten方程为:rp=0.9565Cs/（12.8761+Cs）,其中Km=12.8761mg·mL-1,Vm=0.9565mg·mL-1·h-1。巴戟天提取物中5种低聚糖成分在大鼠全肠段的吸收速率（Ka）均无显着差异（P>0.05）,其药物累积吸收量随灌流液药物浓度的增加而近似线性地增加,说明药物不存在自身浓度抑制现象,提示巴戟天提取物中5种低聚糖成分的在体肠吸收机制均以被动扩散为主,其吸收动力学符合一级过程。提取物中各成分的吸收速率依次为:巴戟甲素≥蔗糖>蔗果三糖>耐斯糖>1F-果呋喃糖基耐斯糖。对不同肠段中各成分的吸收进行比较,总体方差分析结果显示各成分的吸收具有差异性（P<0.05）。P-gp抑制剂对巴戟天提取物肠吸收的影响考察结果显示盐酸维拉帕米可显着增加蔗糖与巴戟甲素的吸收量,这种促吸收效果是通过抑制P-gp的外排引起的,由此提示蔗糖与巴戟甲素可能是P-gp的底物。3巴戟天低聚糖对AD模型大鼠的影响灌胃给药28 d后,水迷宫实验结果显示AD模型组定位航行潜伏期明显长于空白组,而各给药组明显得到改善。空间探索实验结果显示各给药组在原平台象限游泳距离与总距离之比均有所上升而穿越原平台的次数也显着增加。脏器系数测量结果显示,模型组脑、脾、睾丸等脏器系数比正常对照组都降低,而给予BJ、BD、BT治疗后,BD、BT对各脏器系数均有增加的作用,BJ对脑、肝、睾丸等脏器系数有增加的作用。BJ与BD可以提高AD模型大鼠海马组织及皮质层中SOD、Na+/K+-ATP、GABA,降低MDA、TChE的活性,从而达到保护神经系统的作用。采用大鼠双侧海马区注射A β 25-35并联合长期腹腔注射D-半乳糖可致大鼠脑海马及皮质层的神经递质含量明显降低,而分别给予BJ、BD、BT治疗后,均可显着提高大鼠脑海马及皮质层中NE、DA、5-HT的含量,从而达到增强学习记忆能力的效果。同时还不同程度的提高DA/HVA、NE/E、5-HT/5-HIAA的比值,说明BJ、BD、BT可抑制相关的代谢路径。采用大鼠双侧海马区注射A β 25-35并联合长期腹腔注射D-半乳糖可致大鼠脑海马中APP、Tau、Caspase-3蛋白表达水平上升,SYP蛋白表达水平明显降低,而分别给予BJ、BD、BT治疗后,各蛋白表达水平异常的情况均有所缓解,说明巴戟天低聚糖类成分改善AD大鼠学习记忆障碍的作用机制,与上调SYP、降低APP、Tau、Caspase-3的表达有关。结论:1巴戟天低聚糖有效部位质控研究建立的巴戟天低聚糖有效成分含量测定方法简单、准确,具有良好的重复性,为有效评价巴戟天药材的质量提供了分析方法。根据中国药典规定并结合本研究结果,在此对巴戟天药材中低聚糖的含量限度提出初步的建议:按巴戟天药材干燥品计算,耐斯糖的含量不得少于2%,巴戟甲素的含量不得少于4%,蔗果三糖、耐斯糖、1F-果呋喃糖基耐斯糖、巴戟甲素的总含量不得少于14%。优选出的巴戟天低聚糖提取工艺各指标性成分含量较高,工艺稳定、合理、可行,为工业化生产提供参考。巴戟天低聚糖部位纯化工艺的重现性良好,所制得的巴戟天低聚糖部位纯度高,已知成分含量大于50%,可用于开发国家规定的五类新药。2巴戟天低聚糖的药代动力学研究巴戟甲素在整个肠段吸收良好,属于高渗透性药物,在十二指肠、空肠、回肠和结肠的吸收机制以被动扩散方式为主。本研究将为巴戟甲素设计成口服缓控释制剂提供了生物学依据。β-D-呋喃果糖苷酶与巴戟甲素亲和力较强,葡萄糖对巴戟甲素的酶解具有一定的促进作用,提示机体内的葡萄糖对巴戟甲素的代谢也可能有一定的促进作用从而降低巴戟甲素的生物利用度。本研究将为巴戟甲素的药物代谢动力学研究及其新药的开发提供理论参考。巴戟天低聚糖在全肠段吸收中,其吸收速率依次为二糖>三糖>四糖>五糖,推测可能与各成分的分子大小有关。在本实验条件中,各成分在不同肠段中的Papp均大于0.072 cm·h-1,说明各低聚糖成分在整个肠段中吸收良好,属于高渗透性药物,主要与各成分均具有较强的亲水性从而易于在肠道中吸收扩散进入体内有关。3巴戟天低聚糖对AD模型大鼠的影响实验采用大鼠双侧海马区注射Aβ 25-35并联合长期腹腔注射D-半乳糖,诱发拟AD动物模型。从行为学、氧化应激、胆碱能系统、能量代谢、氨基酸、神经递质和蛋白表达水平等方面,观察了巴戟天低聚糖对AD模型大鼠的影响,实验结果显示巴戟天低聚糖可以改善AD大鼠学习记忆障碍,其作用机制与以下三方面有关:（1）提高SOD、Na+/K+-ATP、GABA,降低MDA、TChE的活性;（2）提高神经递质水平;（3）上调SYP,降低APP、Tau、Caspase-3等蛋白的表达水平。

朱丹丹^[4]（2012）在《外源抗菌肽对鱼腥草基因组功能影响的mRNA差异分析》文中研究表明目的：通过mRNA差异显示RT-PCR技术分析转基因鱼腥草和非转基因鱼腥草在转录组水平上的差异,探讨外源基因转化对鱼腥草基因组功能的影响,为转基因鱼腥草非预期效应的分析及进一步的安全性评价提供信息和依据,为转基因中药的安全性评价提供参考。方法：1.采用四种方法提取非转基因鱼腥草叶片总RNA,所用试剂分别为RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue、SDS（十二烷基硫酸钠）Ⅰ、SDS Ⅱ和CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）,在匀浆液抽提时分别采用6种试剂组合：氯仿、醋酸钾+氯仿、氯化钠+氯仿、PCI（苯酚/氯仿/异戊醇）、醋酸钾+PCI、氯化钠+PCI,并通过紫外分光光度计和琼脂糖凝胶电泳考察所得RNA的纯度和完整性；对CTAB法提取所得RNA进行18S RNA的RT-PCR,反转录时分别使用PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒。2.用CTAB法结合PCI抽提得到非转基因鱼腥草叶片总RNA,分别使用PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒对总RNA进行反转录,获得的cDNA用3个锚定引物和26个随机引物的78个引物组合进行PCR,产物分别用琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,聚丙烯酰胺凝胶用银染显色。3.选取生长条件、生长状态、生长阶段一致的转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株进行mRNA差异显示RT-PCR。结果：1.鱼腥草总RNA的提取方法中,RNAiso for Polysaccharide-rich Plant Tissue法结合PCI+氯化钠抽提、SDSⅡ法和CTAB法结合PCI抽提所得RNA的纯度和完整性均好,其中CTAB法所得RNA的产量最高。CTAB法中6种抽提试剂组合提取得到的鱼腥草总RNA,分别用PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录后,扩增18S RNA的产物经琼脂糖凝胶电泳均显现清晰条带。2.非转基因鱼腥草叶片总RNA分别用PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录,所得cDNA的差异显示PCR结果有所不同,即同样的引物组合显现的条带有不同；mRNA差异显示RT-PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳结果较琼脂糖凝胶电泳的条带清晰且分明。3.对转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株进行mRNA差异显示RT-PCR的结果表明,用PrimeS cript Reverse Transcriptase反转录的结果中共有44个差异条带,而用Quantscript cDNA第一链合成试剂盒反转录的结果中共有142个差异条带。结论：1.经过鱼腥草叶片总RNA提取方法的优化及18S rRNA的RT-PCR,确定CTAB法结合PCI抽提为最合适的RNA提取方法,该法所得总RNA纯度和完整性最好、产量最高,可作为有效模板反转录为cDNA,能够用于进一步的DDRT-PCR分析；RT-PCR结果也表明,反转录方法PrimeScript Reverse Transcriptase和Quantscript cDNA第一链合成试剂盒均能进行有效的反转录。2.通过RNA提取、反转录、PCR及结果显示的方法选择,建立了鱼腥草叶片的mRNA差异显示RT-PCR体系。两种反转录方法的结果表明,反转录方法是影响mRNA差异显示RT-PCR结果的重要因素,两种方法的结果有一定差异,在分析差异条带时可互相补充；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物,银染后可获得良好的结果,且操作简便快速,清晰度和灵敏度均高于琼脂糖凝胶电泳。3.通过mRNA差异显示RT-PCR结果的分析,发现转基因鱼腥草植株和非转基因鱼腥草植株之间存在mRNA的差异,由此可知外源抗菌肽对鱼腥草的基因组功能产生了影响,这种影响可能会导致蛋白的表达及代谢产物的生成发生改变,研究结果可为转基因鱼腥草非预期效应的分析及深入的安全性评价提供一定的信息和依据。

杨丽娜,刘捷,庄智敏,章镇,周蓓蓓,陶建敏^[5]（2009）在《根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究》文中研究表明以‘美人指’葡萄离体叶片及叶柄为农杆菌介导转化Barnase基因的受体,对农杆菌侵染时间、共培养时间、预培养时间、卡那霉素选择压以及头孢霉素浓度等因素进行了研究。结果表明:最佳的农杆菌介导‘美人指’葡萄遗传转化体系为农杆菌侵染4 min,共培养3 d,预培养3 d,卡那霉素选择压3.0 mg.L-1,头孢霉素质量浓度250 mg.L-1。采用此体系对‘美人指’葡萄进行转化,共获得了12株抗性苗,农杆菌感染后的不定芽再生率为1.78%。利用GUS组织化学染色、PCR扩增的方法进行检测,结果表明,其中只有2株GUS染色呈阳性,阳性率为16.67%;有3株通过了PCR检测,初步证实Barnase基因已经整合进入‘美人指’葡萄基因组中。

丁霞^[6]（2006）在《胡杨再生体系的建立及rolB-pttGA20ox基因的遗传转化研究》文中研究表明本研究以胡杨当年生枝条的带芽茎段为外植体,首先建立了它的离体快繁及植株再生体系,并就植物生长调节剂等因素对胡杨叶片再生不定芽的影响进行了详细的研究;然后利用NPTⅡ筛选基因对影响根癌农杆菌介导胡杨遗传转化的条件进行了深入探索,通过优化转化条件,建立了胡杨遗传转化系统;最后在此基础上,进行rolB-pttGA20ox双价基因的转化,并由PCR、PCR-Southern杂交分子检测,验证rolB-pttGA20ox基因的插入情况。研究结果摘要如下:1.胡杨组培再生体系的建立消毒的最佳方法为:夏季采集的材料: 70%的酒精浸泡30sec后,以0.1%氯化汞分别灭菌7min、8min;初春水培枝条:试剂同上,茎尖灭菌0.5min,茎段灭菌1.0min。最适宜的启动培养基为MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L,MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.2mg/L+糖20 g/L为增殖培养的最佳配方,生根培养的最适培养基为1/2MS+IBA1.0mg/L+糖25g/L+琼脂6g/L+AC 0.2 g/L,生根率达到81%。移栽炼苗以蛭石:珍珠岩（2:1）或者沙子:土壤（1:1）作为最佳基质。2.在组培中黄化现象产生的规律以及避免的方法在一个继代周期内,随着时间的推移,试管苗的黄化率越来越高,整体呈现线性上升的趋势;经生理生化指标研究发现,当继代时间超过20d后,叶绿素含量尤其以叶绿素a的降幅较大,建议可以接种20d为一个继代周期;ABA为IAA、ZR的拮抗物,它的消长过程大体上与生长过程是相反的;采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法对蛋白质进行分析,发现黄化试管苗电泳谱带均出现缺失等异常现象。这说明黄化苗在基因表达调控上出现差异,其内部机制可能已发生变化。研究影响胡杨黄化率的培养条件因子发现:培养基的pH值在6.0～7.0之间、昼夜变温处理、不同波段的光质中以蓝光对降低胡杨黄化率有较好效果。3.胡杨遗传转化体系的建立胡杨叶片再生的最适培养基是MS+BA0.5mg/L+NAA0.1～0.2mg/L+腺嘌呤40mg/L+水解乳蛋白500mg/L +白砂糖25g/L+琼脂6.0g/L,再生频率达100%;叶片培养的最佳取材位置是自茎尖展叶始第1～3片叶;叶片正面向上或正面向下接种培养,对其

贺红,张桂芳,徐鸿华^[7]（2003）在《农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究》文中研究指明【目的】建立一套农杆菌转化巴戟天的有效方法,为巴戟天新品种选育、引入外源目的基因奠定基础。【方法】以巴戟天带节茎为材料,工程农杆菌菌株为EHA101,Ti质粒上插入了β-葡糖苷酸酶（GUS）、新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因。【结果】将巴戟天带节茎进行遗传转化,头孢霉素用作抑菌剂,浓度为300mg·L-1。外植体与农杆菌共培养时间以3d最好。卡那霉素作为选择试剂,浓度为50mg·L-1 。CUS基因瞬时表达检测,70.5％的外植体呈阳性反应;GUS基因稳定表达检测,抗性植株中GUS反应呈阳性所占比例为22.2％。【结论】农杆菌介导GUS基因转化巴戟天的研究可为建立有效的中药遗传转化系统奠定方法学的基础。

二、农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究（论文开题报告）

（1）论文研究背景及目的

此处内容要求：

首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。

写法范例：

本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。

（2）本文研究方法

调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。

观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。

实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。

文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。

实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。

定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。

定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。

跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。

功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。

模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。

三、农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究（论文提纲范文）

（1）党参果聚糖合成关键酶基因Cp1-SST启动子功能分析及多糖合成调控相关转录因子筛选（论文提纲范文）

（2）活性氧通过抗氧化系统提高黄芩药材质量（论文提纲范文）

（3）巴戟天低聚糖益脑作用机制研究（论文提纲范文）

（4）外源抗菌肽对鱼腥草基因组功能影响的mRNA差异分析（论文提纲范文）

（5）根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究（论文提纲范文）

（6）胡杨再生体系的建立及rolB-pttGA20ox基因的遗传转化研究（论文提纲范文）

（7）农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究（论文提纲范文）

四、农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究（论文参考文献）

• [1]党参果聚糖合成关键酶基因Cp1-SST启动子功能分析及多糖合成调控相关转录因子筛选[D]. 王亚榕. 山西医科大学, 2020(11)
• [2]活性氧通过抗氧化系统提高黄芩药材质量[D]. 宋琦. 黑龙江中医药大学, 2015(01)
• [3]巴戟天低聚糖益脑作用机制研究[D]. 邓少东. 广州中医药大学, 2013(05)
• [4]外源抗菌肽对鱼腥草基因组功能影响的mRNA差异分析[D]. 朱丹丹. 广州中医药大学, 2012(10)
• [5]根癌农杆菌介导Barnase基因转化‘美人指’葡萄的研究[J]. 杨丽娜,刘捷,庄智敏,章镇,周蓓蓓,陶建敏. 南京农业大学学报, 2009(01)
• [6]胡杨再生体系的建立及rolB-pttGA20ox基因的遗传转化研究[D]. 丁霞. 北京林业大学, 2006(01)
• [7]农杆菌介导β-葡糖苷酸酶基因转化巴戟天的研究[J]. 贺红,张桂芳,徐鸿华. 广州中医药大学学报, 2003(04)

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