一、FTY720对小鼠外周血淋巴细胞及T细胞亚群的影响（论文文献综述）
高嫦娥[1]（2021）在《PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究》文中研究说明研究背景与目的靶向T细胞抑制性检测点肿瘤免疫治疗是当今生物医学研究的最热点。研究表明,利用单抗药物直接作用于PD-1可以有效地阻断抑制性免疫检测点,激活T细胞,增强T细胞的功能,达到治疗肿瘤的目的。在机体的免疫系统中,肠道由于接触抗原的表面积最大并且免疫细胞数量较多,因而被认为是体内最大的免疫器官[1],发生于结直肠的恶性肿瘤与免疫逃逸有关。本研究利用CRISPR/Cas9技术对T细胞PD-1基因进行靶向敲除,采用小鼠结肠癌模型进行PD-1基因敲除的T细胞的体内抗肿瘤作用及其可能机制研究,采用非人灵长类动物食蟹猴作为实验动物,高度模拟PD-1基因敲除T细胞在体内的安全性评价,以期建立利用CRISPR/Cas9技术靶向T细胞PD-1基因进行肿瘤细胞免疫治疗的策略,进而为临床研究的实施奠定坚实的实验基础。第一章:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究第一部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用[方法]在GENEBANK数据库中查找获得小鼠PD-1基因序列,设计靶向小鼠PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的CRISPR/Cas9-sgRNA表达载体。分离获得小鼠外周血PBMC,富集细胞数量为1×107,加入敲除PD-1基因的PX458敲除载体5μg,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术和T7E1酶切验证PD-1基因的敲除。体外培养结直肠癌细胞株CT-26,分为:阴性对照组:CT-26细胞组、PD-1基因敲除T细胞组,实验组:CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除的T细胞及PD-1单抗共培养组。绘制各组细胞生长曲线,细胞杀伤检测试剂盒检测PD-1基因敲除的T细胞的杀伤能力,通过流式细胞术检测T淋巴细胞亚群比例的变化及体外分泌细胞因子的水平变化。[结果]成功获得了靶向小鼠PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向小鼠PD-1基因sgRNA/Cas9表达载体,建立小鼠PD-1基因敲除T细胞,对其体外特性进行检测,结果显示:流式细胞仪检测PD-1基因敲除T细胞CD3、CD4、CD8比例无明显变化;PD-1基因敲除T细胞与结直肠癌细胞株CT-26在不同效靶比作用下体外抑制肿瘤效应结果显示:各组细胞生长曲线示:与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与未经PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,72小时细胞活率明显下降,与其他两组相比,CT-26与PD-1基因敲除T细胞共培养组,CT-26与PD-1基因敲除T细胞及PD-1单抗共培养组,与肿瘤细胞共培养后:IFN-γ、TNF-α、IL-2的水平增加。[结论]建立了稳定的体外定向敲除T细胞抑制性免疫检测点PD-1的技术,获得了小鼠同种异体PD-1基因敲除T细胞,体外实验显示,可抑制肿瘤细胞的生长,为体内抗肿瘤的研究奠定了基础。第二部分:小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制[方法]培养结直肠癌细胞株CT-26,制备小鼠结直肠癌移植瘤模型;实验分组分别为模型对照组（经尾静脉注射PBS）、阴性对照组（经尾静脉注射未经基因敲除的T细胞）、PD-1基因敲除T细胞组（经尾静脉注射PD-1基因敲除的T细胞）、PD-1单抗组（经尾静脉注射PD-1单抗）,观察结直肠癌移植瘤模型中各组小鼠体重,活动度,生存期等,绘制小鼠生存率曲线;处死各组中小鼠,分别取肝,肺和肠等组织进行病理学分析;分离MLNs、脾脏淋巴细胞,采用流式细胞仪检测MLNs、脾脏CD4+,CD8+T细胞,Treg细胞比例,ELISA法检测MLNs、血清中肿瘤免疫相关细胞因子的分泌水平变化。[结果]与模型对照组相比较,同种异体PD-1基因敲除T细胞可抑制结直肠癌荷瘤小鼠原位移植瘤的生长及向肝脏和肺部的转移,延长了小鼠的存活时间。PD-1基因敲除T细胞回输结直肠荷瘤小鼠,ELISA结果显示,与同模型对照组、阴性对照组相比较,PD-1基因敲除T细胞回输组MLNs和血清中IFN-y,TNF-α和IL-12的水平增加,IL-6无明显变化,IL-17水平减少。在结直肠癌小鼠PD-1基因敲除T细胞回输后,PD-1敲除组小鼠的CD44+CD62L-记忆T细胞比例明显提升,CD4+FoxP3+调节性T细胞比例降低。[结论]同种异体PD-1基因敲除T细胞在结直肠癌中显示出体内抑制肿瘤转移的作用,且可能通过依赖CD8+T细胞在结直肠癌中发挥抗肿瘤作用。第二章:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价第一部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性[方法]在GENEBANK数据库中搜索食蟹猴PD-1基因序列,设计靶向食蟹猴PD-1基因的sgRNA,构建靶向PD-1基因的PX458敲除载体,经扩增、酶切鉴定及测序验证,获得正确的sgRNA表达载体;分离培养食蟹猴PBMC,采用Lonza-4D电转仪进行电转染,48h后检测转染效率,采用PCR技术及T7E1酶切鉴定PD-1基因的敲除。在细胞因子刺激下诱导食蟹猴T细胞增殖,定期观察细胞形态变化及集落形成并计数,绘制食蟹猴PD-1基因敲除T细胞生长曲线,FACS检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞周期、凋亡,CCK-8法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞增殖,以及食蟹猴PD-1基因敲除T细胞表面特征分子的表达,通过ELISA法检测食蟹猴PD-1基因敲除T细胞分泌的IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2水平。[结果]成功获得了靶向食蟹猴PD-1基因敲除的sgRNA,构建靶向食蟹猴PD-1基因的敲除重组表达载体sgRNA/Cas9,成功培养了食蟹猴PD-1基因敲除的T细胞,细胞生长周期为28天,生长曲线呈S形,符合Logistic生长曲线。CCK-8法检测结果显示,与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞增殖未受到抑制,生长曲线基本与未经敲除PD-1基因的T细胞相同;流式细胞仪检测T细胞表型无改变,具有杀伤性作用的CD8+T细胞所占比例有所升高;细胞周期及凋亡检测结果显示:与未经敲除PD-1基因的T细胞相比较,PD-1基因敲除的T细胞G0/G1期,S期,G2/M期比例两者无统计学差异,早期凋亡、死亡细胞比例两者无统计学差异。ELISA法对细胞因子IFN-γ、TNFα、IL-10、IL-6、IL-2进行检测,结果显示:PD-1基因敲除的T细胞释放细胞因子与相同培养条件下,未进行PD-1敲除的T细胞释放细胞因子量统计学无差异。[结论]抑制性检查点基因PD-1的破坏导致PD-1表达的降低,但在体外培养期间不影响PD-1基因敲除T细胞的活力、PD-1基因敲除T细胞特征标志物的表达、PD-1基因敲除T细胞凋亡和PD-1基因敲除T细胞周期,且扩增的PD-1基因敲除T细胞也不影响具有细胞因子表达的能力,为其体内安全性评价奠定基础。第二部分:食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性评价[方法]多次富集PD-1基因敲除T细胞后,经静脉回输入食蟹猴体内,参照人细胞因子诱导的淋巴细胞回输有效剂量（2×107/kg）,溶解于100ml 0.9%氯化钠注射液中,对照组经静脉注射100ml/（kg·次）0.9%氯化钠注射液,每3d上午同一时间给药1次,共给药3次,分别在回输后4h,24h,48h,1w,2w,3w,4w直到100天抽取外周血,流式细胞仪检测CD3,PD-1的表达,观察各组食蟹猴体重,活动度等一般情况,监测血常规、血生化,ELISA法检测各组食蟹猴Th1:IL-2、IL-12、IFN-γ;Th2:IL-4、IL-10;炎症细胞因子:TNF-α、IL-1β、IL-6等细胞因子水平的变化,并分别取肝、肺、骨髓、脾脏、胸腺、甲状腺、垂体、肾上腺、睾丸等组织进行病理学分析,观察其毒性反应。[结果]将PD-1基因敲除的T细胞回输到食蟹猴体内,PD-1基因敲除的T细胞未显示出对其体重、活动度等一般情况的影响,血液学检查指标:白细胞数、单核细胞数与对照组相比,均未出现明显变化;生化学检查指标:总蛋白、白蛋白、球蛋白、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素、谷草转移酶、谷丙转移酶、尿素氮、肌酐等与对照组相比,均未出现明显变化;组织病理学分析显示没有与输注的PD-1基因敲除T细胞相关的损伤;流式细胞术监测外周血中PD-1基因敲除的T细胞的体内持久性为两个月。[结论]我们的研究结果证明了食蟹猴用于评估PD-1基因敲除T细胞免疫治疗安全性的效用,并为基于T细胞的过继免疫治疗提供了新的策略。
王荣慧[2]（2021）在《早发性卵巢功能不全患者外周血T淋巴细胞亚群及PD-1的相关性》文中研究说明目的:通过研究早发性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency,POI）患者雌激素水平与外周血淋巴细胞亚群及程序性死亡受体-1（Programmed cell death-1,PD-1）表达的相关性,探讨POI患者免疫功能变化,为POI的临床诊疗及及健康管理提供依据。方法:选取2019年12月至2021年1月就诊于山西省妇幼保健院妇科门诊,28～40岁范围内患者作为研究对象。其中POI组25例为研究组,体检正常女性25例为健康组。健康组入选标准为月经周期规律、甲状腺功能未见异常、性激素水平正常,无高雄的临床表现及多囊卵巢综合征、无自身免疫性疾病及复发性流产史;研究组入选标准,自然月经周期状态下,停经6月或3个周期以上,激素检查至少两次FSH大于25,检测时间间隔大于4周。研究对象排除标准:无肝肾疾病,无免疫系统或内分泌系统疾病,无恶性肿瘤,五年内未接受放化疗的癌症患者,无妇科器质性病变,未行卵巢相关手术者,近3个月内未使用激素类药物,2周内无急性感染史。比较健康组与研究组雌激素（E2）水平与外周血中CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞及CD4+、CD8+T淋巴细胞表面PD-1的表达量,研究E2与T淋巴细胞表面PD-1的表达有无相关性。结果:1、POI患者体内性激素水平与正常女性相比均有明显差异,AMH水平明显降低,而FSH/LH比值明显高于正常女性健康组,差异有统计学意义（P<0.05）。2、与健康组比较,研究组CD4+T细胞百分比降低,CD8+T细胞百分比升高,差异有统计学意义（P<0.05）。CD4+/CD8+组间比较无统计学差异。T细胞表面共刺激分子PD-1百分比均降低,差异有统计学意义（P<0.05）。3、POI患者血清E2水平与CD4+T细胞百分比的相关性分析,二者呈正相关关系,差异均有统计学意义（r=0.530,P<0.05）。CD8+T细胞百分比与E2水平的相关性分析,差异无统计学意义（r=﹣0.131,P=0.363）。外周血T细胞亚群表面PD-1表达量与血清E2水平呈正相关关系,差异有统计学意义（r=0.415,P<0.05;r=0.437,P<0.05）,E2与血清AMH水平呈正相关关系（r=0.589,P<0.05）,与血清TSH水平无相关性（r=﹣0.265,P=0.063）。4、年龄与CD4+T细胞百分比呈负相关关系（r=﹣0.330,P<0.05）,与CD8+T细胞百分比呈正相关关系（r=0.295,P<0.05）。与T细胞表面PD-1百分比无相关关系（r=﹣0.268,P=0.060;r=﹣0.188,P=0.191）。年龄与血清AMH水平的相关性,呈负相关关系（r=﹣0.398,P<0.05）。年龄与血清TSH水平具有正相关关系（r=0.350,P=0.013）。5、POI患者血清TSH水平与CD4+T细胞百分比及外周血T细胞亚群CD4+T细胞与CD8+T细胞表面PD-1表达量呈负相关关系,差异有统计学差异（r=﹣0.400,P<0.05;r=﹣0.340,P<0.05;r=﹣0.352,P<0.05）,与CD8+T细胞百分比呈正相关关系,差异有统计学差异（r=0.467,P<0.05）。血清AMH水平与TSH水平呈负相关关系（r=﹣0.484,P<0.05）。6、POI患者血清AMH水平与CD4+T细胞百分比及外周血T细胞亚群CD4+T细胞与CD8+T细胞表面PD-1表达量呈正相关关系,差异有统计学差异（r=0.504,P<0.05;r=0.415,P<0.05;r=0.649,P<0.05）。与CD8+T细胞百分比呈负相关关系,差异有统计学差异（r=﹣0.430,P<0.05）。结论:1、POI患者体内E2、P、AMH水平降低,FSH、LH及FSH/LH高于正常女性,差异有统计学意义（P<0.05）。2、POI患者存在细胞免疫紊乱,CD4+T细胞亚群百分比下降,CD8+T细胞亚群百分比升高,T淋巴细胞表面共刺激分子PD-1的表达水平也低于正常女性。3、血清E2水平与CD4+T细胞百分比、T细胞表面PD-1表达量及血清AMH水平均正相关关系。说明POI患者体内CD4+T细胞百分比、CD4+T细胞与CD8+T细胞表面PD-1表达量下降与E2水平降低有关。4、POI患者血清TSH水平与CD4+T细胞百分比、CD8+T细胞百分比具有相关关系,甲状腺功能与免疫系统及及激素水平相互影响。
李会敏[3]（2021）在《髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展》文中进行了进一步梳理研究背景和目的:原发性膜性肾病（primary membranous nephropathy,PMN）是一种 Th2 免疫反应导致的以肾小球病变为主要病理改变的自身免疫性疾病,是引起成人肾病综合征的常见病因。大多数PMN病例（约85%）是由磷脂酶A2受体（phospholipase A2 receptor,PLA2R）抗体介导的,而其余的与包含7A的血栓蛋白1型结构域（thrombospondin type-1 domain-containing 7A,THSD7A）或不明机制相关。Th17细胞通过介导基本炎症级联作用在肾脏自身免疫中发挥关键作用,能促进自身抗体的形成,这是大多数肾脏自身免疫性疾病的关键,增强组织炎症,并对肾实质细胞有直接影响,然而Th17细胞是否参与PMN的发生发展目前尚不清楚。髓系抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells,MDSC）是一群免疫抑制细胞,研究发现狼疮肾炎患者中MDSC可促进Th17分化和疾病进展,但在PMN中MDSC的变化及与Th2和Th17细胞的相互作用至今尚无研究。本研究旨在揭示PMN中MDSC与Th2和Th17免疫反应的关系,为PMN的诊断和治疗提供新的思路。研究方法:（1）PMN患者肾脏组织石蜡和冰冻切片染色,光镜下观察肾组织病理改变;IF检测肾小球基底膜免疫复合物沉积情况;多色免疫组化（multiplex immunohistochemistry,IHC）检测IL-4、CD3和CD11b抗体在肾组织定位和表达强度;应用酶联免疫吸附测定法（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测PMN患者和HC血浆中抗PLA2R抗体的含量及对疾病诊断的灵敏度和特异性。（2）应用FCM和ELISA方法分别检测了 HC和PMN患者中CD4+IL-4+（Th2）和 CD4+IFN-γ+（Th1）细胞比例及相关细胞因子 IL-4、IL-6、IL-10、IL-13和IFN-γ的水平,并分析Th2细胞比例与疾病活动度的相关性及Th1/Th2比例变化;同时检测了 HC和PMN患者中调节性T细胞（regulatory T cells,Treg）的比例变化。（3）采用流式细胞术（flow cytometry,FCM）测定健康对照组（healthy control,HC）和PMN患者外周血中MDSC及其亚群的比例与数目;并分析了 PMN患者的MDSC 比例和数量与疾病活动度和外周血Th2细胞比例的相关性。（4）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,加入CFSE标记;同时流式分选纯化各自相应的MDSC细胞,将MDSC和初始CD4+T应用CD3和CD28抗体共刺激培养3天,流式检测比较HC和PMN患者的MDSC的抑制功能。（5）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th2细胞的极化体系,分别加入MDSC和（或）Arg-1和iNOS抑制剂及IL-6和IL-10因子,通过FCM方法比较CD4+IL-4+（Th2）细胞的变化。（6）免疫荧光染色法（immunofluorescence,IF）检测PMN患者肾组织中IL-17+细胞和CD11b+细胞的共定位;FCM和ELISA分别检测HC和PMN患者中Th17细胞比例及相关细胞因子IL-17A水平,并分别分析了两者与疾病活动度的相关性;（7）磁珠分选HC和PMN患者的初始CD4+T细胞,体外建立诱导分化为Th17细胞的极化体系,加入MDSC和（或）Arg-1抑制剂,通过FCM和ELISA方法比较CD4+IL-17A+（Th17）细胞和培养上清中IL-17A的变化;（8）ELISA检测HC和PMN患者血浆中Arg-1的含量变化,分析PMN患者中Arg-1含量与疾病活动度和MDSC数量的相关性;流式分选PMN患者的MDSC并加入IL-6或IL-10因子共同培养,利用实时荧光定量核酸扩增技术（real-time Quantitative PCR,qRT-PCR）检测 IL-6 和 IL-10 对 MDSC 中 Arg-1 mRNA表达的影响。（9）应用重组人Ⅳ型胶原蛋白α3链的非胶原（NC）结构域（Non-collagenous（NC）domains of the α3 chain of recombinant human type Ⅳ collagen,rh-α3（IV）NC1）蛋白免疫DBA/1小鼠,构建PMN小鼠模型,并给予吉西他滨（gemcitabine,GEM）去除MDSC,检测小鼠外周血、脾脏和淋巴结中MDSC、Th2、Th17、Th1和Treg细胞的变化;ELISA法检测小鼠尿白蛋白、尿肌酐及血清尿素氮的水平;qRT-PCR检测小鼠脾脏、淋巴结和肾脏组织Th2和Th17相应细胞因子IL-13和IL-17A及相关转录因子GATA3、RORγt和RORα的mRNA表达情况;IF染色检测肾组织内IgG沉积;光镜下观察模型小鼠肾脏病理改变;电镜下观察模型小鼠肾脏的超微结构变化。研究结果:（1）PMN患者外周血Th2细胞及相关因子增加并与疾病活动度正相关;（2）PMN患者外周血中MDSC及其亚群数量显着增加,抑制功能增强,但与疾病活动度正相关;（3）体外实验证实MDSC抑制Th2细胞分化,IL-6和IL-10增强MDSC抑制能力。（4）PMN患者外周血Th17细胞及其相关因子增加并与疾病活动度正相关;（5）PMN患者外周血中MDSC、Arg-1、IL-17三者存在相关性;（6）体外实验证实人MDSC通过产生Arg-1促进Th17细胞分化,并且PMN来源的MDSC有更强的促Th17分化作用且可被Arg-1抑制剂（nor-NOHA）终止;（7）PMN患者血浆中Arg-1含量增加,IL-6和IL-10可以促进MDSC分泌 Arg-1。（8）应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型;PMN小鼠外周血中MDSC、Th17和Th2细胞比例随着免疫时间延长增加;而Th1和Treg细胞比例随着免疫时间延长呈下降趋势;（9）去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤;（10）去除MDSC降低Th17和Th2细胞比例及相关转录因子的表达;但增加Th1和Treg细胞比例。结论:MDSC在PMN中显着增加,MDSC可能主要通过增强Th17反应促进PMN疾病进展。Th17的分化依赖于MDSC分泌的Arg-1。PMN小鼠模型证实去除MDSC可能主要通过减弱Th17免疫反应减轻小鼠肾脏损伤。
张行[4]（2021）在《基于蛋白质组学的梅花鹿鹿皮胶真伪鉴别及其组方工艺、免疫调节活性的研究》文中认为鹿皮胶源自满族宫廷,是由梅花鹿（Cervus nippon）或马鹿（Cervus elaphus）的皮使用多种特殊加工工艺制备而成的。古代书籍中就曾记载鹿皮胶无毒,且具有很好的补气血的功效。迄今为止,大量研究表明鹿皮胶具有补血、壮阳、提高机体免疫力以及抗疲劳的功效。本研究通过序列级胰蛋白酶进行样品的酶解,使用四极杆飞行时间高分辨质谱（QTOF）IDA模式,结合搜库鉴定,筛选得出1条梅花鹿鹿皮胶特有肽段,可区分梅花鹿鹿皮胶与鹿属其他种动物和常见的猪马牛羊的皮蒸制而成的明胶,鉴定序列为FSLADAINTEFK,特征离子m/z 678.3457。并对筛选得到的梅花鹿鹿皮胶多肽T1与已研究发现的鹿皮胶特征多肽T2进行合成,使用三重四极杆质谱仪的MRM模式进行验证,T1的特征分子离子对选择m/z 678.7→235.1,T2的特征分子离子对选择m/z725.0→274.1进行检测。结果表明,T1为梅花鹿鹿皮胶特异性的肽段,可区分梅花鹿与相近的鹿种和猪马牛羊的皮蒸制的胶,且当掺入不同比例的梅花鹿鹿皮胶时杂皮胶无干扰,峰面积与掺入量成正比,说明该方法专属性较强。T2为鹿皮胶特有,在本次鹿属动物样品中均可以检测到,在猪马牛羊等物种中无信号,说明现有的T2肽段为鹿皮胶特征肽段。建立了稳定、灵敏及专属性高的梅花鹿鹿皮胶鉴定真伪和质量控制方法。对含鹿皮胶的组方“参芪鹿胶”工艺参数进行了正交实验,通过筛选得出的最优参数为:8倍量水,煎煮3次,煎煮时间1 h。并对筛选所得到的最优工艺进行了三次平行验证实验,结果中的各项指标均保持较高水平。对参芪鹿胶组方中君药人参的标志性成分进行研究,使用高效液相进行人参皂苷Rg1、Rb1的含量测定,并对建立的专属的检测方法进行了方法学考察,考察其方法的稳定性、重复性等内容。证明了参芪鹿胶提取物中人参皂苷Rg1、Rb1的成分含量检测方法合理可行。对鹿皮胶以及含鹿皮胶组方参芪鹿胶的提取物的免疫调节作用进行了研究。使用发育正常的小鼠作为研究的对象,计算给药后的免疫器官指数,使用ELISA法检测各组小鼠血清细胞因子（白介素-2、白介素-4、干扰素-γ、肿瘤坏死因子-α）含量的变化,对于各组小鼠T淋巴细胞亚群（CD4+、CD8+）分布的变化使用了流式细胞术进行检测。结果表明鹿皮胶与参芪鹿胶提取物不同剂量均能够使得正常小鼠的胸腺指数以及脾脏指数得到明显的升高（P<0.05或P<0.01）;鹿皮胶高剂量组以及参芪鹿胶提取物中、高剂量组促进了正常小鼠血清细胞因子（IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α）的分泌,并且具有浓度依赖性（P<0.01）;鹿皮胶及参芪鹿胶提取物高剂量组可升高正常小鼠外周血淋巴细胞亚群CD4+比例（P<0.01）,鹿皮胶及参芪鹿胶提取物各剂量组可升高小鼠外周血CD4+/CD8+值（P<0.05或P<0.01）;鹿皮胶以及参芪鹿胶提取物对正常小鼠脾脏组织形态均未产生明显异常病理刺激或损伤。鹿皮胶及参芪鹿胶提取物不同剂量均对小鼠免疫的功能有一定的免疫调节作用,安全无毒有效,有较强的开发利用价值。
孙琳[5]（2021）在《1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究》文中研究表明研究目的:1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus,T1DM）是一种由遗传因素和环境因素共同诱导,细胞免疫及体液免疫共同介导胰岛β细胞损伤的自身免疫性疾病,在儿童和青少年中更为常见。近年来,流行病学研究表明,我国T1DM发病率明显增加,而患者进行性的胰岛功能下降导致其需要终身应用胰岛素治疗,鉴于其逐年增长的发病率和随之出现的多系统并发症,T1DM已成为重大的公共卫生挑战。目前,T1DM的发病机制尚未完全明确,T细胞相关的研究一直是1型糖尿病的研究热点,而近年来除了CD4+T细胞,越来越多的研究表明CD8+T细胞在1型糖尿病的发病进程中有着重要作用。淋巴细胞活化信号分子家族（signaling lymphocyte activated molecular family,SLAMF）被报道在多种免疫异常疾病中表达异常,并显着影响包括CD8+T细胞在内的免疫细胞分化及功能。然而对T1DM免疫细胞表面SLAMF分子的表达情况未被报道,且对于T1DM中SLAMF分子如何通过影响CD8+T细胞功能仍不明确。为探讨这一问题,本课题通过对T1DM患者及非肥胖的糖尿病小鼠模型（non-obese diabetic,NOD）免疫细胞分化情况及SLAMF分子表达情况进行分析,并进行mRNA测序及相关的体外细胞实验,以期探讨T1DM免疫系统异常分化及SLAMF分子表达对T1DM免疫微环境下CD8+T细胞功能和命运的影响。研究方法:（1）对T1DM患者及健康对照组（health control,HC）的一般临床资料进行统计,利用流式细胞分析法对外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell,PBMC）中T细胞及其亚群、NK细胞及其亚群、B细胞等免疫细胞比例进行分析,并检测T细胞、B细胞和NK细胞表面SLAM分子家族的表达情况;（2）利用流式细胞分析法对T1DM患者外周血中T细胞SLAMF4分子表达及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌情况进行检测,分析SLAMF4分子与细胞活化状态和细胞因子分泌能力之间的相关性;分析SLAMF4分子表达与1型糖尿病一般临床资料的相关性;（3）对自发性1型糖尿病小鼠模型NOD小鼠进行体重、随机血糖监测及小鼠尾静脉采血,对小鼠胰腺组织留取病理,进行苏木精-伊红（hematoxylin-eosi,HE）染色,观察其组织细胞形态、炎细胞浸润情况;用流式细胞分析法检测小鼠外周血免疫细胞分化及外周血、胰腺引流淋巴结CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（4）采用流式细胞分选技术得到纯化的T1DM患者的SLAMF4+CD8+T细胞和SLAMF4-CD8+T细胞,并进行mRNA转录组测序,分析差异表达基因的分布及临床意义;（5）应用免疫磁珠分选技术分选脐带血细胞中CD8+T细胞,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体刺激下进行培养,检测作用不同时间CD8+T细胞表面SLAMF4分子表达情况;（6）采用磁珠分选联合流式细胞分选技术正常健康人SLAMF4阳性CD8 T细胞和SLAMF4阴性CD 8 T细胞分别进行分选,在体外给予抗CD3/CD28单克隆抗体的刺激下进行体外扩增,用CFSE标记细胞,检测细胞增殖情况,并于Day6检测两种细胞的凋亡情况。研究结果:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞比例与HCs比较存在异常,表现为CD4+T细胞和B细胞比例增多,Treg细胞的比例降低,总NK细胞及其CD56dim亚群的NK细胞比例减低,CD56bright亚群的NK细胞比例升高。与HCs相比,T1DM患者外周血PBMC中SLAMF4阳性的总T细胞百分比降低,且SLAMF4阳性的CD8+T细胞明显降低;SLAMF3分子表达在B淋巴细胞比例有所降低,SLAMF5在NK细胞表面表达升高,差异均有统计学意义。（2）T1DM患者T细胞表面SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关,且与SLAMF4阴性CD8+T细胞相比,SLAMF4阳性CD8+T细胞具备更强的分泌促炎因子IFN-γ和TNF-a的能力;在与T1DM相关的一般临床指标的分析中,发现SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比与糖化血红蛋白水平及T1DM病程呈负相关。（3）与同周龄的Balb/c小鼠相比,NOD小鼠CD4+T细胞及CD4+CD25+的调节性T细胞百分比明显降低,随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下降,且明显低于对照Balb/c小鼠。（4）mRNA转录组测序结果表明,1型糖尿病中SLAMF4作用后的CD8+T细胞表现出多个信号通路的异常改变,包括T细胞受体信号相关的信号通路、细胞因子分泌及细胞凋亡通路,差异表达的基因中也有多个与凋亡相关的基因,说明SLAFM4在1型糖尿病中调控CD8+T细胞的活性与命运。（5）通过体外培养人脐带血CD8+T淋巴细胞发现,一定程度的抗原刺激可促进SLAMF4在脐带血na?ve CD8+T细胞表面上调表达,随着免疫活化的时间延长,SLAMF4阳性CD8+T细胞百分比逐渐下调。（6）通过SLAMF4阳性CD8+T细胞和SLAMF4阴性CD8+T细胞经CFSE标记后体外培养,发现SLAMF4阴性CD8+T细胞对抗CD3/CD28单克隆抗体的TCR刺激更敏感、更易扩增,增殖能力强,而SLAMF4阳性CD8+T细胞更容易凋亡。研究结论:（1）T1DM患者外周血PBMC中免疫细胞分化比例与HCs相比存在异常,且外周血T细胞及B细胞表面多种SLAM分子表达水平发生变化,结合课题组前期结果,这在T1DM及T2DM之间存在一定共性和不同之处。（2）与HCs相比,T1DM患者SLAMF4阳性CD8 T细胞百分比显着下降,且SLAMF4分子表达与细胞活化的状态及促炎性细胞因子IFN-γ和TNF-a的分泌有关。在T1DM患者中,SLAMF4+CD8+T细胞百分比与患者的糖化血红蛋白水平和1型糖尿病病程呈负相关。（3）在动物模型中我们发现NOD小鼠也存在外周血T细胞异常分化状态。且随着NOD小鼠1型糖尿病的发生发展,SLAMF4阳性CD8+T百分比逐渐下降,明显低于对照Balb/c小鼠。（4）SLAMF4分子表达与1型糖尿病患者CD8+T细胞功能调控及凋亡显着相关,SLAMF4阳性的CD8+T细胞增殖能力较差且更容易凋亡,故体内持续抗原刺激会导致表达SLAMF4的CD8+T细胞的百分比降低,使其发挥类似调定点作用。综上所述,本课题首次分析了T1DM疾病模型中的SLAMF分子家族的表达谱,为SLAMF分子与T1DM免疫细胞的调控提供了实验证据,证实了在1型糖尿病免疫微环境中SLAMF4表达对CD8+T细胞的功能影响和命运的调控及SLAMF4阳性CD8+T细胞比例变化的具体机制,提示SLAMF4分子可能为T1DM的早期诊断,临床分期或免疫干预提供新靶点。
湛梦茹[6]（2021）在《激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究》文中提出背景与目的:慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B,CHB）是由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）引起的一种慢性传染性疾病,全球疾病负担重,其中大部分慢性乙肝病毒携带者均在5岁之前被感染。目前没有能够彻底清除HBV的治疗方法。免疫治疗能够实现CHB患者的功能性治愈,是具有前景的乙肝治疗策略之一。慢性HBV感染时免疫系统往往是免疫耐受或衰竭状态。免疫检查点是表达在免疫细胞表面对免疫反应起活化或抑制作用的分子,通过对他们的调节能够打破这种耐受状态。共刺激分子OX40/OX40L、4-1BB是肿瘤坏死因子（受体）超家族（tumor necrosis factor（receptor）superfamily,TNF（R）SF）的成员,在免疫反应的活化尤其是T细胞的活化中起到了重要作用。而程序性死亡受体-1（programmed cell death 1,PD-1）是免疫球蛋白受体CD28亚家族的成员,作为抑制性的信号分子与免疫系统的耐受或衰竭有关。然而目前为止,这些免疫检查点能否作为免疫调节的靶点治疗CHB尚不能明确。相对于婴幼儿,成人对HBV可以产生更强的更有效的免疫反应从而清除病毒,其中发挥年龄依赖性作用的免疫分子尚不清楚。本研究立足于慢性乙型肝炎感染的背景下,通过对OX40/OX40L、PD-1、4-1BB在CHB患者中的表达特点的研究,从而明确其临床意义,及其与年龄的关系。接着我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40,研究其对HBV复制的影响及相关机制,以期为以OX40为靶点治疗CHB的策略提供更多的理论依据。材料与方法:本研究首先收集人的样本用以检测免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。外周血样本来自我们从2018年9月到2019年6月在吉林大学白求恩第一医院纳入的64名慢性乙肝患者和另外招募的37名健康志愿者。其中慢性乙肝患者包括52名未进行抗病毒治疗的患者和12名应用恩替卡韦（entecavir,ETV）抗病毒治疗的患者,健康志愿者包括24名成人和13名儿童。从外周血中分离出血浆和外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）。肝脏组织病理标本来自18名进行肝脏穿刺的患者和6名进行肝脏血管瘤手术的成人患者。其中18名慢性乙肝患者包括9名慢性乙型肝炎发作的患者和9名慢性乙型病毒感染未发作的患者。在收集的人的样本中我们先后检测了OX40/OX40L、PD-1、4-1BB的表达情况。为了研究OX40/OX40L在人群中的表达特点,我们应用流式细胞术检测PBMCs中膜形式的OX40和OX40L（membrane-bound OX40,m OX40;membrane-bound OX40L,m OX40L）的表达;应用酶联免疫吸附试验检测血浆中可溶性形式的OX40和OX40L（soluble OX40,s OX40;soluble OX40L,s OX40L）水平;应用免疫组化的方法对肝组织中OX40和OX40L的表达量进行检测。之后为了研究PD-1和4-1BB在CHB患者中表达特点,我们应用前期检测OX40/OX40L的人群样本外加从我院病理科另申请到的6名儿童的肝组织样本,对PD-1和4-1BB在CHB患者中的表达情况进行了检测。我们应用磁珠分选的方法将PBMCs中的CD4+和CD8+T细胞分选出来,应用q RT-PCR的方法检测了各个T细胞亚群PD-1和4-1BB mRNA的水平;应用酶联免疫吸附试验法检测血浆中可溶性的PD-1和4-1BB（soluble PD-1,s PD-1;soluble 4-1BB,s4-1BB）的水平;应用免疫组化的方法检测了肝组织中关于PD-1和4-1BB的表达情况。最后我们将以上检测结果与CHB患者的疾病特点及临床指标进行相关性分析从而探究他们在慢性乙肝感染中的临床意义,及与年龄的关系。基于前期临床样本的结果,我们应用尾静脉注射腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）的方法构建了rAAV/1.3HBV小鼠模型,首次将OX40激动性的单抗应用于该模型以观察其产生的作用。为了明确激活免疫检查点OX40对HBV复制的作用,我们应用全自动电化学发光分析仪检测血清内乙肝表面抗原（hepatitis B surface antigen,HBs Ag）和乙肝e抗原（hepatitis B e antigen,HBe Ag）的水平,用q RT-PCR法检测HBV DNA定量,用免疫组化法检测小鼠肝组织内HBs Ag和乙肝核心抗原（hepatitis B core antigen,HBc Ag）的表达水平。为了明确激活OX40靶点对HBV复制的作用的同时产生的肝脏炎症变化,我们应用微孔板法检测小鼠血清中ALT、AST的水平,应用HE染色的方法观察小鼠肝脏炎症病理变化。为了观察这个过程中伴随的免疫变化,我们分离了小鼠肝脏内浸润的淋巴细胞,应用流式细胞术对其中T细胞亚群的比例进行了检测,同时我们应用流式微球检测法（cytometric bead array,CBA）对该过程中小鼠血清中Th1、Th2、Th17相关的细胞因子进行了评估。期间我们还对小鼠脾脏的长度和重量进行了评估与检测。为了探究上述过程的机制,我们在rAAV8/1.3HBV小鼠模型的基础上将CD4+和CD8+T细胞进行分别剔除,构建了CD4+和CD8+T细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型,连同安慰剂组小鼠同时给予OX40激动剂。应用上述检测方法分别对模型中病毒学变化和血清转氨酶变化进行了检测。同时为了进一步从mRNA水平研究激活OX40靶点对HBV复制的作用过程中基因表达的变化,我们分离了小鼠肝内的淋巴细胞对其进行mRNA转录组测序（mRNA sequencing,mRNA-seq）。测序所得的差异表达的mRNAs（differentially expressed mRNAs,DEmRNAs）分别纳入火山图和聚类热图,并分别应用Go功能富集及KEGG、Reactome通路富集的方法对这些DEmRNAs所富集的功能和通路进行初步探索。研究结果:关于OX40/OX40L在人的样本中的表达结果显示在外周血PBMCs中表达OX40+T细胞的百分比在CHB患者中是减少的,其中在高病毒载量组和肝炎发作组中这种减少的趋势尤其明显,且OX40+T细胞的百分比与血清病毒学指标呈负相关。而OX40L+B细胞和单核细胞的百分比在CHB患者的PBMCs中是增多的,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作的组中也比较明显,且他们主要与肝脏炎症指标呈正相关。同时我们还发现慢性乙肝患者外周血中s OX40/OX40L表达明显升高,同样的这种增多的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组比较明显,且s OX40/OX40L的水平与病毒复制及肝脏炎症指标均呈正相关。另外ETV治疗前后血浆中s OX40水平没有明显变化。同时我们发现肝组织中OX40/OX40L的表达趋势与血浆中s OX40/OX40L表达趋势相似,即在CHB患者中是表达升高的,且在肝炎发作的患者中升高的趋势更明显。最后我们发现在健康人外周血中总T细胞中OX40+细胞的百分比,CD4+T细胞中的OX40+细胞的百分比,CD14+单核细胞中OX40L+细胞的百分比及血浆中s OX40的水平与年龄呈正相关,具有年龄依赖性。其次关于PD-1和4-1BB在人群中表达的相关研究结果显示在CHB患者中无论是PBMCs中CD4+T细胞还是CD8+T细胞中PD-1 mRNA的水平与健康组相比均是升高的,这与CHB患者肝脏组织中PD-1的表达趋势是一致的。在CHB患者血浆中s PD-1也是升高的,且这种升高的趋势在高病毒载量组和肝炎发作组也比较明显,ETV治疗前后s PD-1水平没有明显变化。另外血浆中s PD-1的水平不仅与HBV的病毒学指标呈正相关还与肝脏炎症指标呈正相关。4-1BB在CHB患者中的表达特点大致与PD-1相似,简单来讲血浆中的s4-1BB的水平在CHB患者中也是异常升高的,且在高病毒载量组和肝炎发作组升高趋势比较明显,ETV治疗前后s4-1BB水平没有明显变化。血浆中s4-1BB水平主要与血清病毒学指标呈正相关。肝组织中4-1BB的表达趋势与血浆中s4-1BB的趋势相似,即与健康对照组相比,CHB患者的肝脏组织中4-1BB的表达水平更高。而在总PBMCs、CD4+T细胞以及CD8+T细胞中4-1BB mRNA的水平在CHB患者中均有升高的趋势但无统计学差异。最后我们观察到在健康人群中无论是PD-1还是4-1BB的表达在不同年龄组均无明显差异。通过对上述免疫检查点的表达特点及临床意义的分析,我们选择将OX40靶点激动剂应用于已经构建成功的rAAV8/1.3HBV小鼠模型中。我们发现小鼠血清中HBs Ag和肝内HBV DNA水平均有所下降,且血清中HBs Ag的水平在第8天达到最低值。同时我们观察到小鼠肝组织内HBs Ag和HBc Ag表达与安慰剂组相比也有减少的趋势。但激活OX40靶点似乎对血清HBV DNA及HBe Ag水平没有影响。在HBV小鼠模型中激活OX40靶点HBV被抑制的同时还伴随着肝脏炎症的产生,表现为血清中ALT和AST不同程度的升高,肝脏组织内炎症细胞的浸润。除此之外,小鼠肝脏内T细胞亚群比例及血清中免疫细胞因子也发生了变化,表现为CD8+T细胞比例的升高及Th1、Th2及Th17相关的细胞因子升高,且相关细胞因子的水平均表现为先升高再下降的趋势,与病毒清除的过程一致。另外我们发现使用OX40激动剂能够引起小鼠脾脏的增大。同时我们还发现在该模型中应用OX40激动剂的效应呈剂量依赖性,主要表现在血清HBs Ag、肝内HBV DNA的下降水平,CD8+T细胞比例升高的水平以及脾脏增大的程度上。在应用OX40激动剂抑制HBV过程相关机制的探索中,我们发现CD4+/CD8+T细胞缺陷和免疫正常的rAAV8/1.3HBV小鼠同时给予OX40激动剂后,在给药第8天和第12天CD4+T和CD8+T细胞缺陷的小鼠血清中HBs Ag水平与免疫正常组HBV小鼠相比均是升高的,其中以CD8+T细胞缺陷的小鼠升高趋势更明显。与免疫正常组的小鼠相比,CD4+T细胞缺陷小鼠肝内HBV DNA水平没有明显变化,而CD8+T细胞缺陷小鼠则有轻度升高趋势。对于小鼠血清ALT水平,免疫正常的和CD4+T细胞缺陷的HBV小鼠给予OX40激动剂后转氨酶均有所升高,而CD8+T细胞缺陷的HBV小鼠则没有明显升高。关于应用OX40激动剂和安慰剂的HBV小鼠肝内淋巴细胞基于mRNA水平的转录组学测序结果显示,经过OX40激动剂处理后小鼠肝内淋巴细胞表达上调的mRNAs有3008个,下调的有2269个,并可聚类成簇。经Go功能富集分析后,我们发现在生物进程方面这些DEmRNAs主要富集到了白细胞的分化,染色质及组蛋白的修饰调节等过程;在细胞成分方面他们主要富集到了核内的染色质、异染色质及中心体等细胞组成成分上;而在分子功能方面他们主要富集在转录、翻译及小分子GTP酶的结合、Ras GPT酶结合等功能上。经KEGG通路富集分析我们发现这些GEmRNAs主要富集在HBV、人类嗜T淋巴细胞白血病病毒（human T-cell leukemia virus,HTLV）、EB病毒感染相关通路、丝裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK）、趋化因子及NF-kapa B等信号通路。而经Reactome分析这些GEmRNAs主要富集在中性粒细胞脱颗粒,细胞因子,白细胞介素,转录调控等相关信号通路。研究结论:免疫检查点OX40/OX40L、PD-1及4-1BB在人的样本中的表达特点向我们提示这几个免疫检查点可能均与慢性HBV感染相关。但其中只有OX40的表达与HBV病毒学指标呈负相关,考虑其与病毒清除密切相关,且只有OX40/OX40L表达呈年龄依赖性。因此我们将OX40激动剂首次应用于rAAV8/1.3HBV小鼠模型,发现激活OX40靶点对HBV复制具有抑制作用,是一个具有前景的治疗CHB的免疫检查点,但激活OX40靶点不能完全清除HBV因此未来可能还需要联合其它治疗方式。对于激活OX40靶点抑制HBV复制的机制显示该过程相对依赖CD4+T细胞似乎更依赖于CD8+T细胞,CD4+T细胞的重要性不可否认,但未来对于HBV的免疫治疗我们也许应该将更多的关注点放在CD8+T细胞上。
吕童[7]（2021）在《致死型约氏疟原虫初次感染和再次感染小鼠中CD8+T细胞分化亚群的组织定位和生物学特征分析》文中进行了进一步梳理目的:疟疾是危害人类健康的全球公共卫生问题,其致病机制复杂难以建立长效免疫保护。T细胞介导的细胞免疫在抗疟免疫应答中发挥举足轻重的作用。与疟原虫肝阶段相比,CD8+T细胞在疟原虫红内期发挥免疫病理和免疫保护的作用。经过我们前期研究发现,致死型约氏疟原虫（Plasmodium yoelii 17XL,P.y17XL）感染累及肝脏,大量疟原虫来源的疟色素累积可造成肝组织受损。然而,P.y17XL感染后存活的小鼠,其淋巴结、脾脏和肝脏有大量CD8+T细胞募集。肝脏T细胞介导的细胞免疫应答在青蒿琥酯治愈鼠抵抗P.y17XL再感染中发挥重要的免疫保护作用。目前,疟原虫红内期CD8+T细胞在初次免疫应答和免疫记忆阶段的迁移和组织定位尚未得到充分认识,CD8+记忆T细胞的其形成机制和功能发挥尚待深入开展。为此,本研究通过建立P.y17XL初次感染和再次感染小鼠模型,分析了P.y17XL感染后CD8+效应T细胞、记忆T细胞和耗竭T细胞亚群特点;检测淋巴结、脾脏和肝脏中趋化因子表达差异,结合CD8+T细胞表达的趋化因子受体特点,阐述了趋化因子受体CXCR3和CXCR6在CD8+T细胞功能效应发挥和记忆细胞形成中的作用;采用FTY720阻断淋巴细胞迁移实验,验证了CD8+T细胞在疟原虫红内期感染中的组织趋化特征;利用淋巴结T细胞过继转移实验,明确了CD8+记忆T细胞体内增殖特点及作用途径。本项研究工作的开展,旨在为疟疾免疫防御提供新的作用靶点,为疟疾红内期疫苗的开发提供新的思路。实验方法:1.动物模型建立:1)初次感染模型:雌性BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠腹腔接种P.y 17XL（1×106/0.1m L/只,i.p.）。2)P.y 17XL抵抗鼠模型:C57BL/6小鼠初次感染存活小鼠,在初次感染后d30腹腔再次感染P.y 17XL感染红细胞（1×106/0.1m L/只,i.p.）。3)FTY720给药:正常健康雌性C57BL/6小鼠随机分为两组,均腹腔感染P.y 17XL感染红细胞（1×106/0.1m L/只,i.p.）。从感染当天（d0）起,实验组连续5天灌胃给药FTY720（2μg/0.1m L/只,i.g.,d0～d5）,对照组给予等量无菌水。4)淋巴结CD8+T细胞过继转移实验:经磁珠阳性分选出P.y 17XL抵抗小鼠淋巴结中CD8+T细胞后,尾静脉注射给正常健康C57BL/6小鼠（2×106/0.1m L/只,i.v.）,随后过继转移小鼠腹腔注射P.y 17XL感染红细胞（1×106/0.1m L/只,i.p.）。5)C57BL/6背景CD45.2小鼠淋巴细胞过继转移实验:正常健康雌性CD45.1小鼠随机分为两组,实验组尾静脉过继转移P.y 17XL抵抗小鼠淋巴结细胞（5×106/0.1m L/只）,对照组过继转移同等剂量正常小鼠淋巴结细胞。随后,两组小鼠腹腔感染P.y 17XL感染红细胞（1×106/0.1m L/只,i.p.）。2.P.y 17XL感染d3起制备小鼠尾静脉薄血涂片,动态监测小鼠红细胞感染率、生存率。P.y 17XL感染d5取脾脏和肝脏组织制备石蜡切片,HE染色观察脾脏和肝脏组织病理学改变。3.常规方法制备淋巴结、脾脏和肝脏淋巴细胞悬液。流式细胞术检测CD8+T细胞亚群中枢记忆细胞(TCM,CD44+CD62L+)、效应T细胞(TEFF,CD44+CD62L-)、耗竭T细胞(TEX,PD-1+Tim-3+)的数量变化;胞内效应细胞因子IFN-γ和颗粒酶B（Granzyme B,GB）水平;表面趋化因子受体CXCR3、CXCR6和CX3CR1表达差异;记忆CD8+T细胞胞内TCF-1水平;以CD45.1+和CD45.2+示踪过继回输实验研究CD8+T细胞亚群应答特点。针对上述指标,进行脾脏、淋巴结和肝脏组内及组间差异分析。4.获取P.y 17XL初次感染和再感小鼠脾脏和肝脏组织,采用半定量G-Series芯片方法对P.y 17XL感染组织表达的趋化因子水平进行差异分析。实验结果:1.经腹腔感染P.y17XL感染红细胞（p RBC）后,在感染后第5至第8天BALB/c小鼠红细胞感染率持续上升且显着高于C57BL/6小鼠（P<0.0001）,d8达峰值（79.57±3.823%）。C57BL/6小鼠红细胞感染率在d14达峰值（48.19±3.192%）后逐渐下降,至d26镜下无肉眼可见p RBC。在P.y17XL感染后第9天BALB/c小鼠全部死亡,C57BL/6小鼠生存率为78.5%,两组小鼠生存率具有显着性差异（P<0.0001）。P.y17XL感染第5天BALB/c小鼠的肝脏和脾脏较C57BL/6小鼠组织肿胀程度更为明显。BALB/c小鼠脾脏组织结构紊乱,红髓和白髓边界不清,并伴随白髓数量减少,脾小梁结构模糊,疟原虫来源的疟色素出现大量沉积。相较而言,C57BL/6小鼠脾脏结构则较为清晰,红髓和白髓界限清晰分明,并且白髓数量丰富,疟色素沉积亦相对较少。两组小鼠肝脏组织均有少量炎性细胞浸润和疟色素沉积。由此表明,P.y17XL初次感染累及脾脏和肝脏,C57BL/6小鼠比BALB/c小鼠更具有抵抗P.y17XL初次感染的能力。2.为明确两种小鼠在P.y17XL初次感染中的应答差异,我们对脾脏、淋巴结和肝脏CD8+T细胞分化亚群进行了差异分析。流式实验结果显示,感染第5天后,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠脾脏、肝脏和淋巴结中CD8+T细胞占淋巴细胞百分含量及绝对值显着升高（均P<0.05）;脾脏和淋巴结CD8+TEFF细胞（CD44+CD62L-）和TCM细胞（CD44+CD62L+）百分含量和细胞绝对值显着性增加（均P<0.05）,肝脏TEFF百分含量显着升高（均P<0.01）。与C57BL/6小鼠相比,BALB/c小鼠脾脏和肝脏CD8+TEX细胞（PD-1+Tim-3+）百分含量显着升高（P<0.0001,P<0.01）,脾脏CD8+TEX细胞绝对数量亦明显增加（P<0.001）。由此表明,P.y17XL初次感染诱导C57BL/6小鼠CD8+T细胞增殖分化为TEFF和TCM细胞。相比,BALB/c小鼠脾脏和肝脏出现大量耗竭CD8+T细胞,这可能与原虫血症快速升高密切相关。3.进一步对BALB/c和C57BL/6小鼠CD8+T细胞分泌效应分子GB和IFN-γ水平进行差异分析。流式结果显示,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠脾脏和肝脏CD8+GB+T细胞（P<0.01,P<0.05）和CD8+IFN-γ+T细胞（P<0.05,P<0.05）绝对数显着性增多。通过分析平均荧光强度发现,C57BL/6和BALB/c小鼠组内肝脏CTL相较于脾脏CTL效应显着增强,分泌GB和IFN-γ水平显着性升高。由此表明CTL效应功能的发挥在肝脏比脾脏优势更为明显,提示肝脏是P.y17XL初次免疫应答的重要场所,肝脏CD8+T细胞在清除P.y17XL疟原虫感染中发挥重要作用。4.对CD8+T细胞三种趋化因子受体CXCR3、CXCR6及CX3CR1的表达水平进行差异分析。流式结果显示,与BALB/c小鼠相比,C57BL/6小鼠淋巴结CD8+CD44+CXCR3+T细胞（P<0.01,P<0.05）、CD8+CD44+CXCR6+T细胞（P<0.0001,P<0.01）和CD8+CD44+CX3CR1+T细胞（P<0.001,P<0.05）百分含量和绝对值均显着性升高;肝脏和脾脏CD8+CXCR3+T细胞、CD8+CXCR6+T细胞和CD8+CX3CR1+T细胞百分含量均显着性升高（均P<0.05）。由此提示,趋化因子受体在活化CD8+T细胞表面高表达可能介导CD8+T细胞在二级淋巴器官和非淋巴组织间的迁移和募集。5.为探究趋化因子受体在介导CD8+T细胞趋化及功能发挥中的作用,采用淋巴细胞迁移阻断剂FTY720对P.y17XL感染C57BL/6小鼠进行实验观察。结果显示,实验组（FTY720）小鼠红细胞感染率在给药后第4～7天持续上升且明显高于对照组小鼠。截止到感染后第10天,与对照组相比,实验组生存率下降至20%,生存率显着性下降（P<0.05）。FTY720给药后对CD8+T细胞检测分析发现,与对照组相比,实验组小鼠淋巴结中CD8+T细胞百分含量显着性降低（P<0.05）;肝脏和脾脏CD8+T细胞绝对数明显下调（均P<0.05）;脾脏、淋巴结和肝脏CD8+T细胞表面趋化因子受体CXCR3表达水平显着性下调（均P<0.05）。由此表明,CD8+T细胞通过CXCR3介导组织间移行,并对CTL抗疟免疫应答的功能发挥起关键作用。6.以P.y17XL初感小鼠为对照,P.y17XL初次感染存活的C57BL/6小鼠,在感染后d30,接受P.y17XL原虫再次攻击。利用C57BL/6再感染模型,我们对记忆CD8+T细胞亚群特点进行了分析。与对照组相比,实验组小鼠表现出对P.y17XL再次感染的完全抵抗,在实验观察期间镜下未见疟原虫感染红细胞,小鼠生存率达100%。流式结果显示,与初感小鼠相比,再感小鼠脾脏TCM细胞含量显着性增多（P<0.01）,CXCR3+CXCR6+T细胞亚群占脾脏和淋巴结TCM细胞比例显着性升高（P<0.01,P<0.05）。对CTL功能分析发现,与初感小鼠相比,再感小鼠脾脏和肝脏CD8+T细胞高水平表达IFN-γ（P<0.05,P<0.001）,而GB水平无显着性差异（结果未显示）。趋化因子芯片检测结果发现,与初感鼠相比,再感小鼠脾脏Eotaxin和肝脏MIP-2表达显着性升高。由此表明,再感染小鼠体内CD8+T细胞活化后分泌IFN-γ介导脾脏和肝脏炎症发挥抗P.y17XL再感染效应。7.为验证记忆CD8+T细胞体内作用方式及特点,采用过继转移方法,对P.y17XL抵抗鼠淋巴细胞进行分析。磁珠分选P.y17XL抵抗鼠淋巴结CD8+T细胞,静脉回输给正常C57BL/6小鼠,回输正常小鼠淋巴结CD8+T细胞作为对照,两组同时接受P.y17XL p RBCs腹腔感染。在感染后d5流式结果显示,与对照组相比,实验组小鼠脾脏和肝脏CD8+PD-1+TCF1+T细胞数量显着性增多（P<0.05,P<0.01）,CD8+GB+T细胞数量（P<0.05,P<0.05）和CD8+IFN-γ+T细胞数量（P<0.001,P<0.05）均显着性上调。由此提示,过继转移细胞中的CD8+记忆T细胞在受体小鼠体内增殖,进而介导抗P.y17XL感染的CTL免疫应答。为进一步示踪CD8+记忆T细胞体内趋化特点,我们利用CD45.1小鼠作为受体小鼠对P.y17XL抵抗的CD45.2小鼠淋巴细胞进行过继转移。结果显示,实验组淋巴结CD8+CD45.2+T细胞由2.92%（d3）提高至7.32%（d8）,而对照组CD8+CD45.2+T细胞仅由2.4%（d3）升至3.67%（d8）。由此表明,供体小鼠记忆CD8+T细胞在淋巴结内出现快速增殖。感染d3,实验组CD8+CD45.2+CD44+CD62L+TCM（35.9%）细胞量较对照组数量增多（8.82%）,感染d8,实验组CD8+CD45.2+CD44+CD62L-TEFF细胞含量（73.9%）较对照组明显增多（13.4%）。由此表明,供体小鼠记忆CD8+T细胞在体内快速增殖分化为效应记忆亚群发挥CTL效应。结论:1.CD8+T细胞分泌毒性颗粒GB和免疫调节因子IFN-γ介导抗P.y17XL感染的初次细胞免疫应答。2.CXCR3介导CD8+T细胞从淋巴结向脾脏和肝脏趋化发挥CTL效应功能。3.记忆CD8+T细胞活化后分泌IFN-γ介导脾脏和肝脏抗P.y17XL再感染的免疫记忆效应。4.记忆CD8+T细胞的趋化作用为抗疟免疫提供重要保护。
韩露[8]（2020）在《CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究》文中指出食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma,ESCC）是世界上最常见的恶性肿瘤之一,虽然近几年手术和新辅助放化疗在临床治疗上已经取得很大进展,但ESCC患者的5年生存率仍然很低。基于肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocytes,TILs）的免疫治疗是治疗肿瘤的有效方法之一,可能因为CD8+TIL含有不同的细胞亚群,从而导致患者的临床疗效差异较大。因此,深入探究CD8+T淋巴细胞有助于我们发现和肿瘤诊断、治疗、预后更相关的T淋巴细胞亚群。组织定居记忆（tissue-resident memory,TRM）T细胞是最近几年发现的新的淋巴细胞亚群。TRM细胞可产生效应细胞因子,对病原体感染的细胞能直接产生细胞毒性,从而参与抗肿瘤免疫反应。CD103+CD8+TRM细胞在人肿瘤组织中已有报道,但这些研究仅限于用免疫组化的方法回顾性分析TRM细胞的浸润比例和患者生存预后的关系,对其在人肿瘤组织中的特性及功能还未做进一步研究。CD103+CD8+TRM细胞在人ESCC肿瘤组织中是否存在及其在抗肿瘤免疫反应中的免疫学特性及功能至今未有研究报道。为了探索CD103+CD8+TRM细胞在ESCC中的存在情况,我们首先对TCGA数据Ⅰ-Ⅳ期ESCC的转录组测序（RNA-sequencing,RNA-Seq）结果进行分析。研究发现在ESCC肿瘤组织中,CD8A基因表达与TRM细胞标记基因-整合素αE亚单位（ITGAE,又名CD103）基因表达呈正相关性（r=0.4786）,CD8A高表达的肿瘤组织样本富集较高的ITGAE基因（P<0.001）,并且在CD8A高达的肿瘤组织样本中,TRM细胞相关基因RUNX3、CD69、CXCR6明显高于CD8A低表达的肿瘤组织样本（P<0.01、P<0.0001、P<0.0001）;进一步分析 CD9、RUNX3、CXC6与ITGAE基因的关系,发现CD69、RUNX3、CXCR6与ITGAE基因的表达也具有显着正相关性（r=0.3189、r=0.2478、r=0.5142）,并且 CD69、RUNX3、CXCR6在ITGAE基因高表达的肿瘤组织样本中表达明显高于ITGAE基因低表达的肿瘤组织样本（P<0.01、P<0.05、P<0.0001）;此外,ITGAE与PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3、TIGIT等免疫检查点分子及颗粒酶B、干扰素-γ杀伤性分子对应的基因之间显着正相关（r=0.4631、r=0.4108、r=0.3869、r=0.4394、r=0.4788、r=0.5054、r=0.3682）;与ITGAE低表达的肿瘤组织相比,ITGAE高表达的肿瘤组织样本也高表达PD-1、TIM-3、CTLA-4、LAG-3和TIGIT等免疫检查点基因（P<0.0001、P<0.0001、P<0.001、P<0.001、P<0.001）,并高表达颗粒酶B和干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）（P<0.0001、P<0.001）等杀伤性分子基因。以上结果表明食管鳞癌在基因水平可能存在CD103+CD8+TRM细胞,并且可能是肿瘤免疫反应中的主要效应细胞。ESCC中表达较高的CD103+CD8+TRM细胞相关基因,接下来通过流式细胞术（flow cytometry,FCM）验证新鲜初治ESCC手术标本中CD103+CD8+TRM细胞的存在情况。结果显示ESCC肿瘤组织中存在CD103+CD8+TRM细胞,为（60.47±3.99）%;并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（48.51±4.74）%、（29.09 ± 4.61）%、（39.73±5.03）%;同时也高表达CD69及低表达CD62L、CCR7,依次为（57.66±7.65）%、（2.42±0.89）%、（4.42±1.20）%,表明 CD103+CD8+T细胞有可能是一群肿瘤特异性T细胞,并具有组织定居T细胞的表型特征。为了了解化疗药物对肿瘤组织样本中CD103+CD8+TRM细胞的影响,我们进一步用FCM方法分析新辅助化疗后的ESCC患者中CD103+CD8+TRM细胞的浸润情况,结果发现新辅助化疗后ESCC肿瘤组织中CD103+CD8+T细胞的浸润比例为（65.11±6.20）%,并且高表达PD-1、TIM-3免疫检查点,PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+表达依次为（52.40±6.31）%、（42.15±6.09）%、（52.43±5.80）%;并且,新辅助化疗后肿瘤组织中CD103+CD8+TRM细胞的比例,及 CD103+CD8+TRM 细胞上 PD-1+、TIM-3+、PD-1+TIM-3+的表达比例与初治患者相比无统计学差异（P>0.05）,推测CD103+CD8+TRM细胞可能不受化疗药物的影响。回顾性分析2012年9月到2013年5月初治的76例ESCC癌旁组织和癌组织蜡块标本中CD103和CD8 T细胞的浸润情况,并收集患者的临床病理信息。结果显示,癌组织和癌旁组织均有CD8+和CD103+细胞浸润,但组织多色免疫荧光显示癌组织中大多数CD103+细胞共表达CD8+,显示CD103+CD8+T细胞表型,而在癌旁组织中大多数CD103+细胞不共表达CD8+,表明癌组织中CD103+细胞是T细胞来源。另外,Kaplan-Meier生存分析和Log-Rank检验结果发现CD103+和CD8+T细胞的高表达与ESCC患者较好的临床预后有关。以上结果表明CD103+CD8+TRM细胞和ESCC好的临床预后关系密切。我们进一步研究观察到,在ESCC新鲜组织标本中,与CD103-CD8+T细胞相比,CD103+CD8+T细胞Ki67增殖能力强,为（8.29±1.10）%,可分泌IFN-γ、IL-2 并且表达 CD107a,为（6.55±2.08）%、（4.24 ± 1.52）%、（11.71±1.94）%。另外,由于CD103+CD8+T细胞高表达PD-1,为了探究PD-1阻断对CD103+CD8+T细胞的影响,用anti-PD-1抗体和CD103+CD8+T细胞共孵育,发现CD103+T细胞在anti-PD-1抗体阻断后IFN-γ和 IL-2分泌能力增强,依次为（11.00±3.15）%、（5.71±1.64）%。为了更充分研究 anti-PD-1 药物对 CD103+CD8+T细胞的影响,我们运用化学致癌剂4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQO）饮水法建立小鼠原发食管癌模型,检测anti-PD-1抗体治疗原位食管癌小鼠后,小鼠体内CD103+CD8+T细胞的变化情况。结果显示食管癌小鼠经anti-PD-1抗体治疗后,食管组织肿瘤灶数目明显较少,对照组和anti-PD-1抗体治疗组肿瘤数目分别为4.14±0.59,2.28±0.35,有统计学差异（P<0.05）;免疫组化结果显示食管肿瘤组织浸润的CD103+淋巴细胞（H-Score评分）在对照组和治疗组分别为0.08±0.01,0.14±0.01,两组之间有统计学差异（P<0.05）,由此推测anti-PD-1抗体对小鼠的治疗作用有可能和CD103+T细胞的浸润增加有关。以上几部分研究对CD103+CD8+TRM细胞的存在及特性有了初步认识,最后以4-NQO诱导的食管癌小鼠为研究对象,FCM分选脾脏CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞,利用新一代RNA-seq技术,初步探索CD103-CD8+T细胞和CD103+CD8+T细胞的转录组差异表达基因。结果显示CD103+CD8+T细胞相对于CD103-CD8+T细胞差异表达基因的功能富集主要集中在细胞毒功能、细胞免疫反应、细胞粘附功能及相关的信号通路。这与以往的研究相吻合,表明CD103+CD8+T细胞可能参与了食管癌肿瘤组织中的免疫反应。综上所述,ESCC中存在CD103+CD8+TRM细胞,并且与患者的预后密切相关,是一群可能不受化疗药物影响,在肿瘤环境中容易被活化,容易产生应答的肿瘤反应性T细胞。并且,靶向PD-1后,CD103+CD8+TRM细胞功能有所增强,为食管癌免疫治疗的联合治疗提供有效的理论基础。
杨倩婷[9]（2020）在《组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究》文中研究表明在抗结核免疫中T细胞起着不可或缺的作用,其中主要为CD4+和CD8+T细胞的调控作用。然而目前大部分相关研究来源于外周血免疫细胞的研究,在感染组织局部免疫调控的情况尚不清楚。近年来研究发现一群存在于组织局部的免疫细胞-组织驻留记忆性T细胞（Resident memory T cells,TRM）,该细胞被认为是抗外来病原体感染的第一道防线,与机体的保护免疫有关。在结核研究中发现,结核菌感染的小鼠肺组织驻留T细胞起保护作用。另外,在结核疫苗研究发现疫苗免疫小鼠能诱导TRM细胞产生并且疫苗诱导的保护性免疫与TRM细胞有关。这些结果提示TRM细胞在结核免疫中起保护作用。然而,目前在结核中有关TRM细胞的研究主要是在小鼠中进行,在结核病人中TRM细胞的表达和作用如何,目前尚没有相关的研究。为此,本研究收集结核病人不同类型的组织,利用全基因组测序、质谱流式、细胞流式等技术系统描绘结核病人组织中TRM细胞的蛋白和基因表达图谱,系统的揭示该细胞在结核病中的表达特征。进一步通过体外实验明确结核病人组织TRM细胞对巨噬细胞的影响及其机制。本研究结果揭示了结核病人组织TRM细胞的表达、表型和功能,为我们目前对结核感染局部免疫环境提供了新的认识。研究方法1.利用流式细胞技术检测结核病人不同类型组织中TRM细胞的表达水平。2.利用质谱流式技术检测结核病人不同类型组织中28个蛋白分子的表达。3.利用基因测序技术检测TRM细胞全基因图谱。4.体外利用结核菌感染TRM细胞,利用谱流式技术检测18个细胞因子/趋化因子表达。5.流式细胞仪分离结核病人TRM细胞后,与感染了结核菌的巨噬细胞共培养,观察TRM细胞对巨噬细胞的杀菌能力、细胞因子和极化的影响。结果1.结核病人不同组织有不同水平的TRM细胞表达,并且表现为效应性T细胞。2.结核病人TRM细胞表达高水平的活化、趋化和凋亡标记物。3.结核病人TRM细胞表达高表达多种活化、趋化和细胞因子的基因。4.结核病人TRM细胞产生多种结核抗原特异性的细胞因子,并且表现为多功能T细胞的表型。5.结核病人TRM细胞能增强巨噬细胞杀伤结核菌的能力,并且增加IFNγ和TNFα的表达、诱导巨噬细胞向M1分化。结论1.TRM细胞在结核病人不同组织中表达,并且为效应性、活化性、细胞毒的表型。2.结核病人TRM细胞具有独特的基因表达谱。3.结核病人TRM细胞表现为结核抗原特异性多功能T细胞的表型。4.结核病人TRM细胞可能通过诱导高水平细胞因子表达及诱导巨噬细胞向M1分化从而增强巨噬细胞杀菌能力。
闵绍坤[10]（2020）在《常用免疫抑制剂对藏酋猴免疫系统抑制作用的研究》文中认为背景:藏酋猴（Macaca thibetana）是我国特有的猕猴属动物,已作为大动物模型在医学研究中得到广泛应用,而FTY720、CsA、MMF和CVF等免疫抑制剂已在临床和实验研究广泛应用,但对藏酋猴免疫系统抑制作用的研究鲜有报道。目的:本研究采用FTY720、CsA、MMF和CVF等免疫抑制剂构建藏酋猴免疫抑制模型,研究它们对藏酋猴免疫系统的抑制作用及FTY720在藏酋猴体内的药物代谢规律,建立免疫抑制评价的方法,并验证联合给药的有效性。材料及方法:以成年雄性藏酋猴为造模动物,给药后采用以下技术对相关指标进行检测:（1）全自动血液细胞分析仪及生化分析仪检测血液学及血液生化指标;（2）流式细胞术检测T、B淋巴细胞和巨噬细胞;（3）高效液相色谱法检测血药浓度。完成单药研究后,根据研究结果筛选有效的免疫抑制剂,模拟器官移植联合给药方案。我们建立术前诱导治疗和术后维持治疗的联合给药方案,并对相关免疫指标进行检测。结果:（1）FTY720的药效学和药代动力学研究。连续三天给予藏酋猴不同剂量的FTY720后,藏酋猴淋巴细胞明显下降（P<0.01）,特别是CD3+CD4+T淋巴细胞含量减少90%以上,但肝肾功能指标和巨噬细胞无明显变化（P>0.05）。单次给予藏酋猴0.1 mg/（kg.d）的FTY720,最大血药浓度是0.43±0.064 ng/ml,达峰时间为12±3 h,消除半衰期为36±12 h。（2）CsA、MMF和CVF的药效学研究。在连续三天给予藏酋猴不同剂量的CsA后,血液学指标和血液生化指标均无明显变化（P>0.05）;单次给予50 mg/（kg.d）的MMF后,藏酋猴淋巴细胞最多减少30%左右,而WBC和NEU无明显变化（P>0.05）;单次给予藏酋猴0.05 mg/（kg.d）的CVF后,藏酋猴的C3和CH50均明显减少（P<0.01）。（3）联合给药的药效研究。联合给药后,淋巴细胞含量明显下降,T淋巴细胞几乎完全被清除,补体成分C3和CH50均明显降低。结论:FTY720、MMF和CVF对藏酋猴免疫系统具有抑制作用,研究结果表明FTY720、MMF、CVF免疫抑制剂及其形成的联合治疗适宜构建藏酋猴免疫抑制模型。该研究可为构建免疫抑制模型和免疫评价提供参考,可为药物的机制探索和新药研发提供平台,有助于藏酋猴在器官移植、人类疾病研究等医学中的应用。
二、FTY720对小鼠外周血淋巴细胞及T细胞亚群的影响（论文开题报告）
（1）论文研究背景及目的
此处内容要求：
首先简单简介论文所研究问题的基本概念和背景，再而简单明了地指出论文所要研究解决的具体问题，并提出你的论文准备的观点或解决方法。
写法范例：
本文主要提出一款精简64位RISC处理器存储管理单元结构并详细分析其设计过程。在该MMU结构中,TLB采用叁个分离的TLB,TLB采用基于内容查找的相联存储器并行查找,支持粗粒度为64KB和细粒度为4KB两种页面大小,采用多级分层页表结构映射地址空间,并详细论述了四级页表转换过程,TLB结构组织等。该MMU结构将作为该处理器存储系统实现的一个重要组成部分。
（2）本文研究方法
调查法：该方法是有目的、有系统的搜集有关研究对象的具体信息。
观察法：用自己的感官和辅助工具直接观察研究对象从而得到有关信息。
实验法：通过主支变革、控制研究对象来发现与确认事物间的因果关系。
文献研究法：通过调查文献来获得资料，从而全面的、正确的了解掌握研究方法。
实证研究法：依据现有的科学理论和实践的需要提出设计。
定性分析法：对研究对象进行“质”的方面的研究，这个方法需要计算的数据较少。
定量分析法：通过具体的数字，使人们对研究对象的认识进一步精确化。
跨学科研究法：运用多学科的理论、方法和成果从整体上对某一课题进行研究。
功能分析法：这是社会科学用来分析社会现象的一种方法，从某一功能出发研究多个方面的影响。
模拟法：通过创设一个与原型相似的模型来间接研究原型某种特性的一种形容方法。
三、FTY720对小鼠外周血淋巴细胞及T细胞亚群的影响（论文提纲范文）
（1）PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究（论文提纲范文）
| 缩略词表 |
| 中文摘要 |
| 英文摘要 |
| 研究背景及立题依据 |
| 一、转移性结直肠癌的治疗现状及研究进展 |
| 二、靶向PD-1肿瘤细胞免疫治疗的机制及发展现状 |
| 三、大肠癌发生与肿瘤免疫治疗的关系研究进展 |
| 四、本研究的目的及意义 |
| 参考文献 |
| 第一章、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其机制研究 |
| 第一部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞的建立及其体外抑制肿瘤的作用 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 靶向PD1基因sgRNA的设计构建及鉴定 |
| 2. PCR扩增和T7E1酶切鉴定 |
| 3. PD-1基因敲除T细胞亚群比例检测 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞体外抑制肿瘤细胞生长 |
| 5. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外抗肿瘤效应 |
| 6. PD-1基因敲除T细胞与CT-26细胞株共培养的体外细胞因子分泌 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、小鼠PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及可能机制 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 结直肠癌小鼠模型中CD8~+细胞中PD-1表达显着升高 |
| 2. 小鼠结直肠癌移植瘤模型的建立 |
| 3. 小鼠CT-26结直肠癌移植瘤模型体内抗肿瘤效应 |
| 4. 小鼠CT-26结直肠癌模型体内抗肿瘤效应可能机制 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二章、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 第一部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的建立及其生物学特性 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴外周血T细胞的培养 |
| 2. 食蟹猴PD-1敲除T细胞载体的构建及敲除效率的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞增殖的影响 |
| 4. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞亚群的影响 |
| 5. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞周期的影响 |
| 6. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞死亡殖的影响 |
| 7. 食蟹猴PD-1基因敲除对T细胞细胞因子分泌的影响 |
| 8. 混合淋巴细胞反应 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 第二部分、食蟹猴PD-1基因敲除T细胞的体内安全性评价 |
| 材料与方法 |
| 1. 实验材料 |
| 2. 实验方法 |
| 本部分结果 |
| 1. 食蟹猴一般情况 |
| 2. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内持续时间的检测 |
| 3. 食蟹猴PD-1基因敲除T细胞体内安全性的评价 |
| 4. PD-1基因敲除T细胞回输对食蟹猴各组织器官的影响 |
| 本部分讨论 |
| 本部分结论 |
| 参考文献 |
| 全文总结 |
| 综述 PDH/PD-L1信号通路及其相关抗肿痛免疫疗法在结直肠癌中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间获得的学术成果 |
| 致谢 |
（2）早发性卵巢功能不全患者外周血T淋巴细胞亚群及PD-1的相关性（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 常用缩写词中英文对照表 |
| 前言 |
| 1 材料与方法 |
| 1.1 研究对象 |
| 1.2 临床资料收集 |
| 1.3 样本采集 |
| 1.4 主要试剂 |
| 1.5 主要仪器 |
| 1.6 实验步骤 |
| 1.7 统计学方法 |
| 2 结果 |
| 2.1 一般资料分析 |
| 2.2 研究人群激素水平 |
| 2.3 外周血T淋巴细胞亚群检测 |
| 2.4 血清E_2水平与外周血T淋巴细胞百分比及PD-1相关性 |
| 3 讨论 |
| 3.1 POI患者激素水平的变化 |
| 3.2 POI患者外周血T淋巴细胞亚群变化 |
| 3.3 E2 与外周血T淋巴细胞数量变化及PD-1 表达的相关性 |
| 3.4 年龄、TSH、AMH与外周血T淋巴细胞百分比及PD-1相关性研究 |
| 4 结论 |
| 参考文献 |
| 综述 早发性卵巢功能不全治疗研究进展 |
| 参考文献 |
| 致谢 |
| 个人简介 |
（3）髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| Abstract |
| 英文缩略词 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 原发性膜性肾病 |
| 1.1.1 原发性膜性肾病的发病机制 |
| 1.1.2 原发性膜性肾病的研究进展 |
| 1.1.3 治疗上的新进展 |
| 1.2 原发性膜性肾病与免疫细胞间的关系 |
| 1.2.1 原发性膜性肾病与Th2细胞 |
| 1.2.2 原发性膜性肾病与B淋巴细胞 |
| 1.2.3 原发性膜性肾病与Th17细胞 |
| 1.2.4 原发性膜性肾病与自然杀伤细胞(natural killer, NK) |
| 1.2.5 原发性膜性肾病与Treg |
| 1.3 MDSC |
| 1.3.1 MDSC的生物分类和功能特征 |
| 1.3.2 MDSC在自身免疫性疾病中的作用 |
| 1.3.3 MDSC在肿瘤中的作用 |
| 1.3.4 MDSC在免疫相关性肾病中的研究进展 |
| 1.3.5 MDSC与其他免疫细胞相互作用 |
| 1.4 Th17与自身免疫性疾病 |
| 1.4.1 Th17细胞的分化和表达调控 |
| 1.4.2 Th17细胞功能 |
| 1.4.3 Th17细胞在自身免疫性疾病中的促炎作用 |
| 1.4.4 Th17细胞在肾脏炎症和肾脏自身免疫性疾病中的作用 |
| 第2章 原发性膜性肾病患者中MDSC通过促进Th17细胞极化促进疾病进展 |
| 2.1 引言 |
| 2.2 实验材料 |
| 2.2.1 材料和试剂 |
| 2.2.2 仪器 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 2.3.2 密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC) |
| 2.3.3 磁珠分选初始CD4~+ T细胞 |
| 2.3.4 流式分选MDSC |
| 2.3.5 MDSC抑制功能实验 |
| 2.3.6 Th17极化实验 |
| 2.3.7 Th2极化实验 |
| 2.3.8 培养MDSC |
| 2.3.9 细胞外染色 |
| 2.3.10 细胞内IFN-γ/IL-4/IL-17A染色 |
| 2.3.11 Treg染色 |
| 2.3.12 酶联免疫吸附法检测血浆中抗磷脂酶A2受体抗体(PLA2R)IgG |
| 2.3.13 人Th1/Th2/Th17 细胞因子检测 |
| 2.3.14 血浆Arg-1 和IL- 13 检测 |
| 2.3.15 荧光定量PCR |
| 2.3.16 组织染色 |
| 2.3.17 多色免疫组化(Multiplex immunohistochemistry,IHC) |
| 2.3.18 统计分析 |
| 2.4 结果 |
| 2.4.1 PMN患者病变肾组织的特征性病理改变 |
| 2.4.2 PMN患者血浆中抗PLA2R抗体含量与尿蛋白定量正相关 |
| 2.4.3 CD3~+ T细胞与CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.4 PMN患者Th2反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.5 PMN患者外周血Th1细胞比例下调 |
| 2.4.6 PMN患者外周血Treg细胞比例下调 |
| 2.4.7 PMN患者外周血MDSC及亚群数量显着增加并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.8 PMN患者的MDSC具有更强的抑制自体初始CD4+ T细胞增殖的功能 |
| 2.4.9 PMN患者Th2比例增加与MDSC增加正相关 |
| 2.4.10 体外IL -6 和IL-10 增强MDSC抑制Th2分化的能力 |
| 2.4.11 IL-17~+ 细胞和CD11b~+ 细胞在PMN患者病变肾组织中沉积 |
| 2.4.12 PMN患者Th17反应增强并与疾病活动度正相关 |
| 2.4.13 PMN患者Th17反应与MDSC正相关 |
| 2.4.14 MDSC以Arg-1 依赖的方式促进Th17细胞分化 |
| 2.4.15 PMN 患者血浆 Arg-1 含量增加并与疾病活动度相关 |
| 2.4.16 IL-6 和IL-10 促进MDSC分泌Arg-1 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 小结 |
| 第3章 去除MDSC缓解PMN模型小鼠的肾脏损伤 |
| 3.1 引言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 实验材料和试剂 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 膜性肾病小鼠模型的构建及GEM治疗 |
| 3.3.2 PBMC的分离 |
| 3.3.3 背部和腋窝淋巴结细胞分离 |
| 3.3.4 脾脏单细胞悬液制备 |
| 3.3.5 流式检测MDSC |
| 3.3.6 Treg细胞内染色 |
| 3.3.7 Th1/2/17 细胞内染色 |
| 3.3.8 荧光定量PCR |
| 3.3.9 小鼠尿白蛋白/尿肌酐比率的测定 |
| 3.3.10 小鼠血清尿素氮测定 |
| 3.3.11 肾组织病理染色 |
| 3.3.12 肾脏透射电镜制备 |
| 3.3.13 统计分析 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 应用rh-α3NC1成功构建小鼠PMN模型 |
| 3.4.2 PMN小鼠MDSC及其亚群比例增加 |
| 3.4.3 GEM可有效去除小鼠外周血中MDSC |
| 3.4.4 去除MDSC减轻PMN模型小鼠的肾组织损伤 |
| 3.4.5 去除MDSC减弱PMN小鼠Th17免疫反应 |
| 3.4.6 去除MDSC减弱PMN小鼠Th2免疫反应 |
| 3.4.7 去除MDSC增强PMN小鼠Th1免疫反应 |
| 3.4.8 去除MDSC增加PMN小鼠Treg比例 |
| 3.5 实验讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 结论 |
| 创新点 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在学期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（4）基于蛋白质组学的梅花鹿鹿皮胶真伪鉴别及其组方工艺、免疫调节活性的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 鹿皮胶的研究现状 |
| 1.1.1 鹿皮胶主要成分研究 |
| 1.1.2 鹿皮胶药理作用研究 |
| 1.2 蛋白质组学技术 |
| 1.2.1 蛋白质组学概述 |
| 1.2.2 蛋白质组学研究方法概述 |
| 1.2.3 在胶类真伪鉴别中的应用 |
| 1.3 免疫概述 |
| 1.4 课题研究意义 |
| 第2章 梅花鹿鹿皮胶中特征肽段的筛选及鹿皮胶活性研究 |
| 2.1 鹿皮胶的制备及特征肽段的筛查 |
| 2.1.1 实验材料 |
| 2.1.2 实验仪器 |
| 2.1.3 实验试剂 |
| 2.1.4 实验方法 |
| 2.1.5 实验结果 |
| 2.2 特征肽段的合成及验证 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 实验仪器 |
| 2.2.3 实验试剂 |
| 2.2.4 实验方法 |
| 2.2.5 实验结果 |
| 2.3 鹿皮胶免疫调节作用研究 |
| 2.3.1 实验材料 |
| 2.3.2 实验仪器 |
| 2.3.3 实验试剂 |
| 2.3.4 实验方法 |
| 2.3.5 实验结果与分析 |
| 2.4 本章小结 |
| 第3章 参芪鹿胶组方提取工艺及标志性成分研究 |
| 3.1 实验材料与仪器设备 |
| 3.1.1 实验材料 |
| 3.1.2 实验仪器 |
| 3.1.3 实验试剂 |
| 3.2 参芪鹿胶组方日用量 |
| 3.3 参芪鹿胶组方提取工艺条件优化 |
| 3.3.1 实验方法 |
| 3.3.2 实验结果 |
| 3.3.3 提取工艺验证 |
| 3.4 标志性成分方法学考察 |
| 3.4.1 专属性考察 |
| 3.4.2 线性关系考察 |
| 3.4.3 稳定性试验 |
| 3.4.4 精密度试验 |
| 3.4.5 重复性试验 |
| 3.4.6 准确度试验 |
| 3.5 本章小结 |
| 第4章 参芪鹿胶提取物免疫调节作用研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.2 实验仪器 |
| 4.3 实验试剂 |
| 4.4 实验方法 |
| 4.4.1 动物分组及剂量设计 |
| 4.4.2 脾脏指数及胸腺指数 |
| 4.4.3 ELISA法检测小鼠血清细胞因子含量的影响 |
| 4.4.4 流式细胞术检测小鼠外周血T细胞亚群分布 |
| 4.4.5 流式细胞术检测小鼠脾T淋巴细胞亚群分布 |
| 4.4.6 脾脏组织病理学检查 |
| 4.4.7 统计方法 |
| 4.5 实验结果与分析 |
| 4.5.1 脾脏指数及胸腺指数 |
| 4.5.2 参芪鹿胶提取物对小鼠血清细胞因子含量的影响 |
| 4.5.3 参芪鹿胶提取物对小鼠外周血T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.4 参芪鹿胶提取物对小鼠脾T淋巴细胞亚群的影响 |
| 4.5.5 参芪鹿胶提取物对小鼠脾脏组织表现影响 |
| 4.6 本章小结 |
| 第5章 结论 |
| 5.1 鹿皮胶的特征肽段筛选及免疫调节作用研究 |
| 5.2 参芪鹿胶组方提取工艺及标志性成分研究 |
| 5.3 参芪鹿胶提取物免疫调节作用研究 |
| 5.4 讨论 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 作者简介 |
| 攻读硕士学位期间研究成果 |
（5）1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词对照表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 研究背景及意义 |
| 1.2 课题的假设与提出 |
| 第2章 文献综述 |
| 2.1 1型糖尿病免疫系统异常概述 |
| 2.1.1 适应性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.2 先天性免疫系统与1型糖尿病 |
| 2.1.3 免疫治疗在1型糖尿病中的应用 |
| 2.2 SLAM分子家族在免疫系统异常疾病中的表达 |
| 2.2.1 SLAM分子家族概述 |
| 2.2.2 SLAM分子家族在多种疾病中异常表达 |
| 2.3 SLAMF4(CD244)研究现状综述 |
| 2.3.1 SLAMF4(CD244)的结构与功能 |
| 2.3.2 SLAMF4(CD244)的异常表达与疾病 |
| 2.3.3 SLAMF4(CD244)的应用前景与展望 |
| 第3章 T1DM患者免疫系统变化及SLAM分子家族表达 |
| 3.1 前言 |
| 3.2 实验材料 |
| 3.2.1 人外周血来源 |
| 3.2.2 材料和试剂 |
| 3.2.3 仪器 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 3.3.2 生化的测定 |
| 3.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 3.3.4 细胞外标志物染色 |
| 3.3.5 细胞内Foxp3 染色 |
| 3.3.6 统计分析 |
| 3.4 结果 |
| 3.4.1 T1DM患者及HCs基线指标及生化检测结果 |
| 3.4.2 T1DM患者及HCs外周血PBMC中T细胞表达 |
| 3.4.3 T1DM患者及HCs外周血PBMC中B细胞表达 |
| 3.4.4 T1DM患者及HCs外周血PBMC中NK细胞表达 |
| 3.4.5 T1DM患者及HCs外周血PBMC中髓系细胞表达 |
| 3.4.6 各免疫细胞表面SLAM分子家族表达 |
| 3.5 讨论 |
| 3.6 小结 |
| 第4章 T1DM患者T细胞表面SLAMF4 分子表达 |
| 4.1 前言 |
| 4.2 实验材料 |
| 4.2.1 人外周血来源 |
| 4.2.2 材料和试剂 |
| 4.2.3 仪器 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 研究对象入组及排除标准 |
| 4.3.2 生化及一般临床资料的测定 |
| 4.3.3 密度梯度离心法分离PBMC |
| 4.3.4 细胞外标志物染色 |
| 4.3.5 细胞内IFN-γ/TNF-a染色 |
| 4.3.6 统计分析 |
| 4.4 结果 |
| 4.4.1 T1DM患者及HCs外周血T细胞SLAMF4分子表达 |
| 4.4.2 T1DM患者及HCs外周血T细胞亚群SLAMF4分子表达 |
| 4.4.3 SLAMF4分子表达与细胞活化的状态有关 |
| 4.4.4 T1DM患者外周血SLAMF4分子表达与一般临床资料相关性 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 小结 |
| 第5章 NOD小鼠免疫细胞分化及SLAMF4分子表达 |
| 5.1 前言 |
| 5.2 实验材料和动物 |
| 5.2.1 材料和试剂 |
| 5.2.2 实验仪器 |
| 5.2.3 实验动物 |
| 5.2.4 垫料与饲料 |
| 5.3 实验方法 |
| 5.3.1 NOD小鼠体重及一般情况 |
| 5.3.2 NOD小鼠血糖的测量 |
| 5.3.3 检测小鼠外周血免疫细胞分化及血清分离 |
| 5.3.4 胰腺淋巴结单细胞悬液制备 |
| 5.3.5 小鼠尾静脉采血及血清分离 |
| 5.3.6 密度梯度离心法分离小鼠外周血单个核细胞 |
| 5.3.7 细胞外标志物染色 |
| 5.3.8 苏木精-伊红(hematoxylin and eosin stain,HE)染色 |
| 5.3.9 统计分析 |
| 5.4 结果 |
| 5.4.1 NOD小鼠1型糖尿病发病情况 |
| 5.4.2 NOD小鼠外周血T细胞亚群分布异常 |
| 5.4.3 NOD小鼠T细胞表面SLAMF4分子异常表达 |
| 5.5 讨论 |
| 5.6 小结 |
| 第6章 SLAMF4调控CD8~+T细胞的增殖与凋亡 |
| 6.1 前言 |
| 6.2 实验材料 |
| 6.2.1 人脐带血来源 |
| 6.2.2 正常人外周血来源 |
| 6.2.3 T1DM患者外周血来源 |
| 6.2.4 材料与试剂 |
| 6.2.5 仪器 |
| 6.3 实验方法 |
| 6.3.1 密度梯度离心法分离脐带血单个核细胞 |
| 6.3.2 磁珠分选脐带血CD8~+T细胞 |
| 6.3.3 体外培养脐带血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.4 流式分选T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞转录组测序 |
| 6.3.5 磁珠分选正常人外周血来源的CD8~+T细胞 |
| 6.3.6 流式分选正常人SLAMF4~+CD8+T细胞及SLAMF4~-CD8+T细胞 |
| 6.3.7 细胞凋亡检测 |
| 6.3.8 细胞增殖检测 |
| 6.3.9 统计分析 |
| 6.4 结果 |
| 6.4.1 体外培养脐带血来源CD8~+T细胞SLAMF4表达情况 |
| 6.4.2 T1DM患者SLAMF4~+及SLAMF4~-CD8+T细胞的RNA测序 |
| 6.4.3 SLAMF4与CD8+T细胞凋亡 |
| 6.4.4 SLAMF4与CD8+T细胞增殖 |
| 6.5 讨论 |
| 6.6 小结 |
| 第7章 T1DM免疫损伤机理及SLAMF分子异常表达的思考 |
| 第8章 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及在读期间所取得的科研成果 |
| 致谢 |
（6）激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究（论文提纲范文）
| 中文摘要 |
| abstract |
| 中英文缩略词表 |
| 第1章 绪论 |
| 1.1 慢性HBV感染的自然史 |
| 1.2 慢性HBV感染的免疫应答 |
| 1.2.1 慢性HBV感染中固有免疫反应 |
| 1.2.2 慢性HBV感染中适应性免疫反应 |
| 1.3 慢性乙型肝炎免疫治疗进展 |
| 1.3.1 靶向固有免疫的治疗策略 |
| 1.3.2 靶向适应性免疫的治疗策略 |
| 1.3.3 其它免疫治疗策略 |
| 1.4 免疫检查点OX40/OX40L、PD-1、4-1BB研究现状 |
| 1.4.1 OX40/OX40L相关研究进展 |
| 1.4.2 PD-1 相关研究进展 |
| 1.4.3 4-1BB相关研究进展 |
| 第2章 OX40/OX40L及其可溶性分子在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.1.1 人的样本来源 |
| 2.1.2 主要试剂 |
| 2.1.3 主要仪器 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.2.1 外周血采集及血浆分离与保存 |
| 2.2.2 外周血单个核细胞提取 |
| 2.2.3 流式细胞术检测PBMCs中OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.4 免疫组化检测肝组织内OX40/OX40L的表达 |
| 2.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆中sOX40/OX40L水平 |
| 2.2.6 统计处理方法 |
| 2.3 实验结果 |
| 2.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 2.3.2 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的表达 |
| 2.3.3 慢性乙肝患者中OX40/OX40L及其可溶性分子的水平与临床的相关性研究 |
| 2.4 讨论 |
| 2.5 小结 |
| 第3章 PD-1、4-1BB分子及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达及临床意义 |
| 3.1 实验材料 |
| 3.1.1 人的样本来源 |
| 3.1.2 主要试剂 |
| 3.1.3 主要仪器 |
| 3.2 实验方法 |
| 3.2.1 复苏外周血单个核细胞和准备血浆 |
| 3.2.2 磁珠分选人外周血T细胞亚群 |
| 3.2.3 PBMCs中总RNA的提取 |
| 3.2.4 qRT-PCR检测PBMCs中PD-1和4-1BB mRNA水平 |
| 3.2.5 酶联免疫吸附试验检测血浆sPD-1和s4-1BB |
| 3.2.6 免疫组化检测肝脏内PD-1和4-1BB的表达 |
| 3.2.7 统计处理方法 |
| 3.3 实验结果 |
| 3.3.1 研究对象人口学资料及临床特征 |
| 3.3.2 慢性乙肝患者中PD-1及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.3.3 慢性乙肝患者中4-1BB及其可溶性形式在慢性乙肝患者中的表达与临床相关性研究 |
| 3.4 讨论 |
| 3.5 小结 |
| 第4章 rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建及在HBV小鼠模型中激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响的相关研究 |
| 4.1 实验材料 |
| 4.1.1 实验动物和r AAV8/1.3HBV病毒 |
| 4.1.2 主要试剂 |
| 4.1.3 主要仪器 |
| 4.2 实验方法 |
| 4.2.1 建立经尾静脉注射腺相关病毒的HBV模型 |
| 4.2.2 检测小鼠血清内HBsAg、HBe Ag水平 |
| 4.2.3 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 4.2.4 小鼠肝脏组织全基因组DNA提取 |
| 4.2.5 qRT-PCR法检测小鼠HBV DNA定量 |
| 4.2.6 流式细胞术检测小鼠肝内T细胞亚群比例 |
| 4.2.7 CBA法检测小鼠血清内细胞因子 |
| 4.2.8 检测小鼠血清ALT,AST水平 |
| 4.2.9 处理小鼠肝脏组织和制备切片 |
| 4.2.10 小鼠肝脏组织HE染色 |
| 4.2.11 免疫组化检测小鼠肝组织内HBsAg和HBcAg |
| 4.2.12 数据统计处理 |
| 4.3 实验结果 |
| 4.3.1 rAAV8/1.3 HBV小鼠模型的构建 |
| 4.3.2 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制同时伴随着肝脏炎症的产生 |
| 4.3.3 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制的同时伴随着T细胞亚群比例及免疫细胞因子的变化 |
| 4.3.4 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制具有药物剂量依赖性 |
| 4.4 讨论 |
| 4.5 小结 |
| 第5章 激活免疫检查点OX40抑制HBV复制相关机制的初步研究 |
| 5.1 实验材料 |
| 5.1.1 实验动物 |
| 5.1.2 主要试剂 |
| 5.1.3 主要仪器 |
| 5.2 实验方法 |
| 5.2.1 小鼠体内CD4~+和CD8~+T细胞的剔除 |
| 5.2.2 流式细胞术检测小鼠外周血的T细胞 |
| 5.2.3 小鼠血清HBsAg和肝脏组织内HBV DNA的检测 |
| 5.2.4 小鼠血清ALT水平检测 |
| 5.2.5 小鼠肝脏灌流分离肝内浸润淋巴细胞 |
| 5.2.6 小鼠肝脏内淋巴细胞mRNA的提取及文库构建测序 |
| 5.2.7 数据统计处理 |
| 5.3 实验结果 |
| 5.3.1 CD4~+T和CD8~+T 细胞缺陷的rAAV8/1.3HBV小鼠模型的构建 |
| 5.3.2 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程相对于CD4~+ T细胞似乎更依赖于CD8~+ T细胞的作用 |
| 5.3.3 激活OX40靶点抑制HBV复制的过程中基于mRNA测序的小鼠肝内浸润淋巴细胞的转录组学研究 |
| 5.4 讨论 |
| 5.5 小结 |
| 结论 |
| 参考文献 |
| 作者简介及科研成果 |
| 致谢 |
（7）致死型约氏疟原虫初次感染和再次感染小鼠中CD8+T细胞分化亚群的组织定位和生物学特征分析（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英语缩略语 |
| 1 前言 |
| 2 材料与方法 |
| 2.1 仪器设备 |
| 2.2 实验材料及主要试剂 |
| 2.2.1 实验材料 |
| 2.2.2 主要试剂 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 动物模型和实验分组 |
| 2.3.2 疟原虫冻存复苏及新鲜p RBC制备 |
| 2.3.3 红细胞感染率检测和生存期观察 |
| 2.3.4 HE染色 |
| 2.3.5 小鼠脾脏单细胞悬液制备 |
| 2.3.6 小鼠肝脏单个核细胞悬液制备 |
| 2.3.7 小鼠淋巴结细胞悬液制备 |
| 2.3.8 流式细胞术染色 |
| 2.3.9 CD8~+T细胞磁珠分选 |
| 2.3.10 流式结果分析 |
| 2.3.11 G-Series芯片半定量检测趋化因子表达 |
| 2.4 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 P.y17XL初次感染BALB/c和C57BL/6小鼠表型差异和组织病理学分析 |
| 3.2 P.y17XL初次感染BALB/c和C57BL/6小鼠CD8~+T细胞分化亚群的差异分析 |
| 3.3 P.y17XL初次感染BALB/c和C57BL/6小鼠CD8~+T细胞功能的差异分析 |
| 3.4 P.y17XL初次感染BALB/c和C57BL/6小鼠CD8~+T细胞表达趋化因子受体的差异分析 |
| 3.5 FTY720阻断P.y17XL感染C57BL/6 小鼠淋巴细胞趋化的效果观察 |
| 3.6 P.y17XL再次感染C57BL/6 小鼠CD8~+T细胞记忆亚群及功能分析 |
| 3.7 CD8~+记忆T细胞体内趋化方式及功能效应观察 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 本研究创新性的自我评价 |
| 参考文献 |
| 综述 CD8~+T细胞在疟疾发生发展中的生物学作用研究进展 |
| 参考文献 |
| 攻读学位期间取得的研究成果 |
| 致谢 |
| 个人简历 |
（8）CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| Abstract |
| 英文缩写一览表 |
| 前言 |
| 第一章 TCGA数据分析食管鳞癌(ESCC)CD8A和ITGAE(CD103)基因的表达 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 TCGA数据分析ITGAE(CD103)和CDBA基因在ESGG中的表达情况 |
| 3.2 ITGAE基因和免疫检查点及细胞毒性分子相关基因的关系 |
| 3.3 ITGAE基因和CD8A基因表达与临床病理特征的关系 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第二章 初治食管鳞癌新鲜标本CD103~+CD8~+TRM细胞的浸润比例 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 初治ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 CD103~+ TRM细胞在ESGC新鲜标本中的浸润比例 |
| 3.3 CD103~+CD8~+TRM细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.4 癌组织CD103~-T细胞及CD103~+T细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.5 癌旁组织和癌组织CD103~+T细胞其他的表型特征 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第三章 新辅助化疗后食管鳞癌CD103~+CD8~+TRM细胞的浸润比例 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 新辅助化疗ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 新辅助化疗后ESCC新鲜标本CD103~+TRM细胞的浸润比例 |
| 3.3 CD103~+CD8~+TRM细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.4 新辅助化疗后ESCC癌组织CD103~-T细胞和CD103~+T细胞PD-1和TIM3的表达 |
| 3.5 CD103~+CD8~+TRM细胞浸润比例和PD-1分子表达在新辅助化疗后和初治患者癌组织中的差异 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第四章 CD103~+CD8~+TRM细胞与食管鳞癌患者的生存预后分析 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 ESCC患者的临床病理特征 |
| 3.2 CD8~+和CD103~+在ESCC组织蜡块中的表达 |
| 3.3 Cox比例风险回归模型 |
| 3.4 CD8~+和CD103~+的表达和ESCC患者的生存率分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第五章 CD103~+CD8~+TRM细胞的免疫学功能及靶向PD-1的干预研究 |
| 1 前言 |
| 2 实验 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 2.3 统计学分析 |
| 3 结果 |
| 3.1 新鲜ESCC标本CD103~+TRM细胞Ki67的表达 |
| 3.2 新鲜癌组织CD103~+TRM细胞IFN-γ、CD107a和IL-2的分泌 |
| 3.3 anti-PD-1抗体阻断对CD103~+TRM细胞IFN-γ、CD107a和IL-2分泌的影响 |
| 3.4 4-NQO成功诱导食管癌小鼠 |
| 3.5 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管肿瘤灶数目变化情况 |
| 3.6 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管组织淋巴细胞浸润情况 |
| 3.7 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠食管淋巴细胞IFN-γ分泌情况 |
| 3.8 anti-PD-1抗体治疗后,小鼠脾脏淋巴细胞数量及IFN-γ分泌情况 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 第六章 转录组测序分析CD103~+CD8~+T细胞和CD103~-CD8~+T细胞的差异表达基因 |
| 1 前言 |
| 2 实验材料和方法 |
| 2.1 实验材料 |
| 2.2 实验方法 |
| 3 结果 |
| 3.1 分选得到纯度高的脾脏淋巴细胞 |
| 3.2 样品检测结果 |
| 3.3 差异表达基因的筛选 |
| 3.4 差异表达基因聚类分析 |
| 3.5 GO富集分析 |
| 3.6 差异表达基因KEGG富集分析 |
| 4 讨论 |
| 5 结论 |
| 全文结论 |
| 参考文献 |
| 综述 CD103~+ CD8~+组织定居记忆T细胞在肿瘤免疫中的研究进展 |
| 参考文献 |
| 个人简历、在学期间发表的学术论文与研究成果 |
| 致谢 |
（9）组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| ABSTRACT |
| 前言 |
| 第一章 结核病人不同组织TRM细胞的表达水平 |
| 引言 |
| 1.1 材料与方法 |
| 1.2 实验结果 |
| 1.3 小结 |
| 第二章 结核病人不同组织中TRM细胞的表型 |
| 引言 |
| 2.1 材料与方法 |
| 2.2 实验结果 |
| 2.3 小结 |
| 第三章 结核病人不同组织中TRM细胞的基因表达 |
| 引言 |
| 3.1 材料与方法 |
| 3.2 实验结果 |
| 3.3 小结 |
| 第四章 结核病人TRM细胞分泌细胞因子的能力 |
| 引言 |
| 4.1 材料与方法 |
| 4.2 实验结果 |
| 4.3 小结 |
| 第五章 结核病人TRM细胞对巨噬细胞功能的影响及其机制 |
| 引言 |
| 5.1 材料与方法 |
| 5.2 实验结果 |
| 5.3 小结 |
| 讨论 |
| 参考文献 |
| 综述 |
| 参考文献 |
| 附录一:英文缩略词表 |
| 附录二:在读研究生期间科研情况 |
| 致谢 |
（10）常用免疫抑制剂对藏酋猴免疫系统抑制作用的研究（论文提纲范文）
| 摘要 |
| abstract |
| 第一章 绪论 |
| 1.1 研究工作的背景与意义 |
| 1.1.1 研究背景及进展 |
| 1.1.1.1 藏酋猴的研究进展 |
| 1.1.1.2 免疫抑制剂的研究进展 |
| 1.1.2 研究意义 |
| 1.2 研究内容 |
| 1.3 本文的主要贡献与创新 |
| 1.4 本论文的结构安排 |
| 第二章 FTY720 对藏酋猴免疫抑制作用的研究 |
| 2.1 选题思路与实验设计 |
| 2.1.1 选题思路 |
| 2.1.2 实验设计 |
| 2.2 实验材料及仪器设备 |
| 2.2.1 实验动物 |
| 2.2.2 药品与试剂 |
| 2.2.3 实验仪器设备 |
| 2.3 实验方法 |
| 2.3.1 构建免疫抑制模型 |
| 2.3.1.1 选取实验动物及实验分组 |
| 2.3.1.2 给药方式及给药后管理 |
| 2.3.1.3 血样采集 |
| 2.3.2 FTY720 药效研究 |
| 2.3.2.1 血液学和血液生化检测 |
| 2.3.2.2 流式细胞检测 |
| 2.3.2.3 外周血中FTY720 血药浓度检测 |
| 2.3.3 FTY720 药代动力学研究 |
| 2.3.3.1 给药并采集血样 |
| 2.3.3.2 HPLC法测定FTY720 血药浓度 |
| 2.3.4 试验数据统计 |
| 2.4 实验结果 |
| 2.4.1 血液学结果 |
| 2.4.2 血液生化结果 |
| 2.4.3 流式细胞检测结果 |
| 2.4.4 外周血中FTY720 血药浓度检测结果 |
| 2.4.5 FTY720 药代动力学研究结果 |
| 2.4.6 藏酋猴与狒狒和食蟹猴对FTY720 的敏感性比较 |
| 2.5 讨论 |
| 2.6 本章小结 |
| 第三章 常用免疫抑制剂对藏酋猴抑制作用的初级研究 |
| 3.1 选题思路与实验设计 |
| 3.1.1 选题思路 |
| 3.1.2 实验设计 |
| 3.2 实验材料及仪器设备 |
| 3.2.1 实验动物 |
| 3.2.2 药品与试剂 |
| 3.2.3 实验仪器设备 |
| 3.3 实验方法 |
| 3.3.1 CsA对藏酋猴免疫抑制作用的研究 |
| 3.3.1.1 构建免疫抑制模型 |
| 3.3.1.2 免疫指标检测 |
| 3.3.2 MMF对藏酋猴免疫抑制作用的研究 |
| 3.3.2.1 构建免疫抑制模型 |
| 3.3.2.2 免疫指标检测 |
| 3.3.3 CVF对藏酋猴免疫抑制作用的研究 |
| 3.3.3.1 构建免疫抑制模型 |
| 3.3.3.1 免疫指标检测 |
| 3.3.4 试验数据统计 |
| 3.4 实验结果 |
| 3.4.1 CsA对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.4.2 MMF对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.4.3 CVF对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.5 讨论 |
| 3.5.1 CsA对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.5.2 MMF对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.5.3 CVF对藏酋猴免疫抑制作用 |
| 3.6 本章小结 |
| 第四章 构建联合给药免疫抑制模型 |
| 4.1 选题思路与实验设计 |
| 4.1.1 选题思路 |
| 4.1.2 实验设计 |
| 4.2 实验材料及仪器设备 |
| 4.3 实验方法 |
| 4.3.1 构建免疫抑制模型 |
| 4.3.2 免疫指标检测 |
| 4.3.3 数据统计 |
| 4.4 实验结果 |
| 4.4.1 血液学检测结果 |
| 4.4.2 流式细胞检测结果 |
| 4.4.3 补体成分检测结果 |
| 4.5 讨论 |
| 4.6 本章小结 |
| 第五章 全文总结与展望 |
| 5.1 全文总结 |
| 5.2 后续工作展望 |
| 致谢 |
| 参考文献 |
| 攻读硕士学位期间取得的成果 |
四、FTY720对小鼠外周血淋巴细胞及T细胞亚群的影响（论文参考文献）
- [1]PD-1基因敲除T细胞治疗结直肠癌的有效性及其体内安全性评价的临床前研究[D]. 高嫦娥. 昆明医科大学, 2021(01)
- [2]早发性卵巢功能不全患者外周血T淋巴细胞亚群及PD-1的相关性[D]. 王荣慧. 山西医科大学, 2021(01)
- [3]髓系抑制细胞通过增强Th17反应促进原发性膜性肾病的疾病进展[D]. 李会敏. 吉林大学, 2021(01)
- [4]基于蛋白质组学的梅花鹿鹿皮胶真伪鉴别及其组方工艺、免疫调节活性的研究[D]. 张行. 长春工业大学, 2021(01)
- [5]1型糖尿病患者免疫细胞表面SLAMF分子异常表达与机制研究[D]. 孙琳. 吉林大学, 2021(01)
- [6]激活免疫检查点OX40对HBV复制的影响及相关机制研究[D]. 湛梦茹. 吉林大学, 2021(01)
- [7]致死型约氏疟原虫初次感染和再次感染小鼠中CD8+T细胞分化亚群的组织定位和生物学特征分析[D]. 吕童. 中国医科大学, 2021(02)
- [8]CD103+ CD8+组织定居T细胞在食管鳞癌中的免疫学特性和功能研究[D]. 韩露. 郑州大学, 2020(08)
- [9]组织驻留记忆T细胞在结核病人组织中的表达特征和功能研究[D]. 杨倩婷. 南方医科大学, 2020
- [10]常用免疫抑制剂对藏酋猴免疫系统抑制作用的研究[D]. 闵绍坤. 电子科技大学, 2020(07)